用于通过在转化过程中诱导BBM提供可育植物的方法

摘要

本发明涉及一种用于提供转基因植物的方法，包括用包含编码BBM蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列转化植物细胞或植物材料，其中所述BBM的活性是在所述转化的植物细胞或植物材料的转化和/或再生过程中被诱导，并且其中所述植物细胞或植物材料来源于顽拗植物。此外，本发明还涉及包含BBM蛋白的转基因植物或其材料，其中所述转基因植物是顽拗植物。

说明书

本发明涉及一种用于提供成熟的转基因植物的方法，其中所述植 物是顽拗植物（recalcitrant plant）。本发明还涉及可通过本发明方 法获得的成熟的转基因植物、其植物材料、其后代、其植物部分、其 种子或其克隆。本发明还涉及通过本发明方法获得的成熟转基因植物 或其植物部分作为共转化系统的用途。

转基因是生命科学领域中使用的并且本身可用在多种生物体中 以实现多种目的的方法。此技术已经并且正在大量在生命科学研究的 许多领域中应用。此技术的一个方面是其可用于鉴别单个核苷酸分子 （例如遗传元件和/或基因）或由这类核苷酸分子编码的蛋白的功能。 所得到的转基因生物可用于基础或应用研究或者用于工业应用。

转基因在是植物科学领域中一种强有力的技术，因为它使得可将 目的核苷酸分子转移到受体植物物种中。这种核苷酸分子可包含蛋白 质功能基因的启动子、基因、终止子、抑制子或增强子等。

例如，转基因可用于研究将目的蛋白加至受体植物中的效应。在 这样的情况下，将编码目的蛋白的基因——其通常是较大核苷酸分子 的一部分——引入所述受体植物。

为了获得转基因植物，可应用这样的方法，即所述方法包括转化， 然后再生，之后使转化的、再生的植物材料发育成为成熟的转基因植 物。这种方法只可以成功地适用于特定的植物物种，所述植物物种易 于进行所述转化和再生阶段以及随后成为成熟转基因植物的进一步 发育。这种植物物种包括例如拟南芥（Ariabidopsis thaliana）或油菜 （Brassica napus）。

在转化过程中，目的核苷酸分子被引入植物细胞。在再生过程中， 使转化的植物材料从一定程度上未定型的结构（例如愈伤组织）发育 为植物器官（例如叶状结构（leaf like-structure）、芽状结构（shoot-like  structure）或体细胞胚（somatic embryo）），从而使得可由其得到 成熟的转基因植物。

所述转化阶段可包括使植物细胞或植物材料与包含Ti（肿瘤诱 导）质粒的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefciens）接触，所述质粒 含有目的核苷酸分子。所述Ti质粒至少包含由根癌农杆菌转移到宿 主植物中的DNA区段，即T-DNA元件。所述T-DNA元件的侧翼是 DNA重复序列，即所谓的左边界和右边界。基因工程允许将目的核 苷酸分子置于Ti质粒的左右T-DNA边界之间。在所述植物细胞或植 物材料与所述根癌农杆菌的接触过程中，至少所述Ti质粒的T-DNA 元件——包括目的核苷酸分子——被从根癌农杆菌转移到所述植物 细胞中，在这里所述元件被稳定整合到核基因组或细胞器基因组（例 如线粒体或叶绿体的基因组）中。其他转化方法也可应用于植物材料。

当从宏观角度考虑合适的再生时，再生中的植物细胞或组织可发 育成无定形细胞团块（即愈伤组织），从所述愈伤组织可形成芽状结 构或叶状结构。通常，如果需要，在合适的植物激素的影响下，从这 样的结构可形成伸长的茎。随后，如果需要，在一种或多种合适的根 诱导剂的影响下，这类结构会开始形成根系统以发育成适于支持进一 步发育的高级根系统。随后，可将处于合适的高级发育阶段的植物材 料从试管内（in-vitro）环境移植到试管外（ex-vitro）环境。随后将 所述植物在允许获得成熟转基因植物的合适条件下进行试管外培养， 例如在土壤、蛭石、岩棉等中培养。所述再生过程可包括此一般概念 的附加或替代步骤。或者，再生可通过形成体细胞胚来进行，所述体 细胞胚可长成成熟的植物。

这种转化和再生的方法优选地适用于幼小的植物体细胞组织，所 培养的细胞（例如原生质体或器官）作为起始材料。这些组织（例如 幼小植物组织的外植体或来自幼苗的植物材料块）包含具有不同分化 程度或决定程度的细胞。可能是由于在这些组织中存在具有不同分化 水平或程度的异源细胞群，因此这些组织对再生处理的初始阶段特别 敏感。

仅有一些植物或植物物种被证明对转化和再生方法反应良好。已 经可以以较简单的方式应用已知方法来转化和再生这些植物。相反， 已证明其他植物或植物物种对这些转化和再生方法无反应。这些植物 不以合适的方式再生并且/或者根本不能再生为成熟植物。这些植物、 植物变种（variety）或植物栽培种被称为“顽拗”或“再生无能 (regeneration incompetent)”。

哪些内在的分子或生理因子起作用或决定植物是否顽拗在很大 程度上是未知的。这表明目前需要开发可适用于多种植物物种的可靠 的植物特异性转化和再生方法。事实上，仅针对少数物种或物种的栽 培种开发出了用于有效提供成熟转基因植物的合适转化和再生方法。

当对顽拗植物进行转化和再生方法然后使其发育为成熟转基因 植物的处理时，已观察到多种不同的问题并发现这些问题难以克服。 这些问题包括无法转化来自受处理的植物细胞或植物材料的植物细 胞。或者在可实现转化的情况下，这些转化材料可能不会发育为成熟 的转化植物。转化的细胞或植物材料最多可再生至某个发育阶段，就 显示出异常行为例如改变或异常的生长、发育的提前终止、严重延缓 的发育或不正确的发育。而且，已知会形成假阳性植物。这类未转化 的植物材料可逃避选择性试剂的压力并再生为成熟的植物。

此外，已知所述方法的适用性、可靠性和适合性方面存在以下问 题：再现性可能成问题；所述方法的结果不可预知，再生中的芽、根 或幼苗的数量可能太低而不适用于工业条件；所述方法仅适用于单一 植物物种，或给定植物物种的栽培种的特定类；所述方法可能不适合 高通量或常规应用；所述方法的合适适用性可能依赖于特定的细菌菌 株。人们清楚的是这些方法不适用于符合成本效益的工业应用。因此， 仍然需要可应用于顽拗植物物种的用于提供成熟转基因植物的有效 且可靠的方法。

因此，本发明的一个目的是提供用于获得成熟的转基因植物的方 法，其中所述植物是顽坳植物，并且其中所述方法包括转化阶段和再 生阶段。此外，本发明的目的是提供可通过本发明方法获得的转基因 植物。

上述目的是由所附权利要求中限定的方法提供。

具体地，本发明涉及一种用于提供成熟的转基因植物的方法，所 述方法包括转化和再生植物细胞或植物材料，其中所述植物细胞或植 物材料被包含编码BBM蛋白的核苷酸序列的核苷酸分子转化，其中 所述BBM蛋白的活性在所述转化植物细胞或植物材料的转化和/或 再生过程中被诱导，并且其中所述植物细胞或植物材料来源自顽坳植 物。

在获得本发明的研究过程中，发现能够通过在转化和再生过程中 诱导BBM而使来自数种顽拗植物（如甜椒和矮牵牛W138）的植物 材料再生为成熟的转基因植物，而在这些阶段不诱导BBM时这些植 物不发育为成熟的转基因植株。本领域和本文中的顽拗植物是这样的 植物，即当对来自这些植物的植物材料进行用于反应良好的植物的适 合转化和再生方法时，其根本不会再生和发育为成熟的转基因植物。 这种方法的基础是与包含植物激素（优选生长素、细胞分裂素、赤霉 酸，以及脱落酸、乙烯或其抑制剂）的培养基接触的经转化植物材料 使得可再生所述经转化的植物材料，就像对于反应良好的植物那样。 在本文中，顽坳植物是在任何这类条件下均不能发育成为成熟转基因 植物的植物。

不少顽坳植物——特别是属于具有重要经济价值的植物物种、作 物或变种的顽坳植物——一直是广泛研究的对象，所述研究旨在开发 使用再生来提供成熟的转基因植株的合适方法。考虑到顽坳植物（例 如甜椒）以其不能再生为成熟的转基因植物而著称，连同在尝试使用 现有方法转化和再生来自此类植物的植物材料为成熟的转基因植物 时遇到的多种不同的问题，本发明的效率令人惊讶。

本发明的一个优点是，明显地，可任选地通过加入一种或多种生 物活性试剂（例如植物激素或模仿植物激素作用的物质），使来自顽 拗植物的植物细胞或植物材料发育为成熟的转基因植物。当使用生物 活性试剂时，可将这种生物活性试剂加入培养基，在所述培养基上培 养转化的植物材料以使得所述转基因植物材料发育为成熟的转基因 植物。将这种生物活性试剂加入其中未诱导BBM活性的植物细胞或 植物材料时不能使这种植物细胞或植物材料再生为成熟的转基因植 物。

本发明的另一优点包括在所述转化和/或再生过程中控制BBM 活性的时间选择的可能性。调节BBM的时间活性可进一步优化通过 本发明从顽拗植物得到的成熟转基因植物的质量或数量。

本发明的另一优点涉及确保转化的植物材料通过繁殖性发育阶 段进行适当发育的可能性。通过防止在植物发育繁殖阶段BBM蛋白 的不合适表达和/或活性，有关部分或完全不育的问题可被避免或减 轻。

本文的再生包括转化的植物细胞发育为体细胞胚、叶状结构或芽 状结构。在之后的阶段，这些植物组织可进一步发育为成熟的转基因 植物。

本发明因此首次使得可通过在转化和再生过程中活化BBM而从 来自顽拗植物的植物材料有效地获得成熟的转基因植物。本文的 BBM活性是指转化的BBM的表达对转化的宿主植物的基因转录的 影响。因为BBM是转录因子，其活性包括影响一个或多个BBM靶 基因的转录。BBM的活化可通过以下方式实现：使BBM在诱导后定 位于核内，也可诱导其转录或其翻译。可以想到，BBM的活化可通 过BBM与调控核苷酸和/或蛋白序列的直接或间接结合而导致对其 靶基因的转录的诱导或抑制。不考虑BBM活性的潜在机制，从表达 构建体表达的BBM蛋白的诱导活性的后果是：进行转化和再生处理 的来自顽拗植物的植物材料可发育为成熟的转基因植物。

本文“成熟的转基因植物”是指这样的植物，即所述植物已达到发 育晚期阶段从而使得所述植物产生至少一个繁殖器官，优选更多这些 器官例如包含种子的果实，其中从这种繁殖器官可获得能存活的后 代。本文的术语“成熟的植物”可与术语“可育植物”互换。这种繁殖器 官可为有性繁殖器官（例如花），或无性繁殖器官（例如块茎、匍匐 枝、根茎、球茎、鳞芽或鳞茎。特别感兴趣的是可根据本发明获得的 成熟的转基因植物，由所述成熟的转基因植物可如本文所述从繁殖器 官获得能存活的后代。

本文中的花可为单性的，即具有至少一个雄性繁殖器官（雄蕊） 或至少一个雌性繁殖器官（雌蕊）；本文中的花也可为双性的，即具 有至少一个雄性繁殖器官和至少一个雌性繁殖器官。

本文中的花优选地为可育的，但也可包含有功能的花粉或有功能 的卵细胞。对于可育的花，这样的花具有有功能的花粉和一个或多个 有功能的卵细胞，其随后可产生能存活的后代。具有有功能的花粉和 一个或多个有功能的卵细胞的花可通过自体受精或杂交受精产生一 个或多个种子。对于包含有功能的花粉或有功能的卵细胞的花，这样 的花不从自体受精产生种子，但可从杂交受精产生种子。因此，这样 的花可为雄性不育的或雌性不育的。然而，雄性不育的花可被来自另 一朵花的有功能的花粉授精。雌性不育花的花粉可用于使另一朵花受 精。这种花的雄性不育性可能是由于细胞质雄性不育(CMS)、孢子体 自交不亲和性、配子体自交不亲和性或任何其他不育性体系。上述生 物学术语以其本领域公认的含义使用。

还应想到以下情况的可能性，即从原代转化的植物材料获得外植 体，从所述外植体可获得成熟的转基因植物。从原代转化体的外植体 获得的这种成熟转基因植物也落入本发明的成熟转基因植物的含义 中，并且作为通过本发明的方法直接获得的产物。

本文中的术语“植物细胞”是指从植物或植物材料获得的任何细 胞。还指来自液体悬浮液的原生质体或任何细胞等。

本文中的术语“植物材料”是指来源自植物的任何结构、组织或器 官获得的任何外植体、碎片或插条。本文中的植物材料还可指植物的 任意组织或器官。所述植物组织或器官——从其获得所述外植体、碎 片或插条——包括子叶、下胚轴、上胚轴、种子、愈伤组织、叶、根、 茎、花、花药、花粉、胚珠、卵细胞、果实、分生组织、原基、花序、 叶柄、原生质体、库组织(sink tissue)、源组织、幼苗、库器官（sink  organ）、源器官、块茎、合子胚、体细胞胚或来源自双倍体或单倍 体的胚。在此方面还包括细胞培养物，例如单细胞培养物、悬浮液、 产雄培养物、产雌培养物。特别地，术语植物材料是指幼苗产生的组 织，例如子叶或其碎片。

本文中的术语“转化”是指将核苷酸分子（例如表达载体或构建 体）导入受体植物细胞的方法。这样的转化方法可用于阐明基因或蛋 白或另一遗传元件（例如启动子、增强子、终止子等）的功能。所述 核苷酸分子优选地来源于植物或者基于来源于植物的核苷酸序列。所 述核苷酸分子还可为合成来源的。所述核苷酸分子可通过使用细菌载 体（例如根癌农杆菌）（参见例如Bent,2000）或适于植物转化的其 他细菌（参见例如Broothaerts et al.,2005）被引入所述植物细胞。 所述转化方法还可包括粒子轰击、机械注射或适于用于本发明的其他 转化技术。这些技术均为本领域技术人员所知并且无需付出创造性劳 动即可用于实施本发明。

本发明的另一方面涉及来自选自以下的植物的植物细胞或植物 材料：茄属（Solanum）、矮牵牛属（Petunia）、郁金香属（Tulipa）、 百合属（Lilium）、番红花属（Crocus）、鸢尾属（Iris）、唐菖蒲属 （Gladiolus）、菠菜属（Spinacia）、甜菜属（Beta）、藜属（Chenopodium）、 菜豆属（Phaseolus）、豌豆属（Pisum）、辣椒属（Capsicum），特 别是来自茄科的植物。本发明更特别地涉及马铃薯（Solanum  tuberosun）、矮牵牛（Petunia hybrida）、郁金香属、百合属、番红 花属、鸢尾属、唐菖蒲属、菠菜（Spinacea oleracea）、甜菜（Beta  vulgaris）、昆诺阿藜（Chenopodium quinoa）、菜豆（Phaseolus vularis）、 红花菜豆（Phaseolus coccineus）、豌豆（Pisum sativum）、辣椒 （Capsicum annuun）特别是甜椒。这些植物物种和/或几种植物物种 的几种栽培种、变种或种类是以顽拗和难以转化和/或再生为成熟转 基因植物而著称。

本发明特别涉及顽拗的马铃薯种类或变种，矮牵牛种类或变种如 W138，更特别涉及甜椒辣椒(sweet pepper，Capsicum annuum)种类 或变种，其中至少甜椒是被本领域技术人员认为和知晓以顽拗而著称 的。

辣椒的种已根据果实的味道被分成两组，即甜（或淡味）辣椒种 类和辣（红辣椒）辣椒种类。甜椒种类的组包括带有无刺激性的、甜 味的果实的辣椒植物。这些果实——在更高的果实成熟水平下——在 果实中具有低水平的辣椒素（8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺）。本文 中的甜椒组包含方椒（blocky）、铃型（bell）、太空椒（lamuyo）、 红辣椒（paprika）、匈牙利辣椒、新墨西哥辣椒、南瓜辣椒（squash  pepper）、西班牙红辣椒、西班牙甘椒（pimiento）、Italian frying、 日本甜椒、Viejo arruga dulce和古巴变种(De Witt&Bosland,1997)。

甜椒被认为是一种高度顽拗的辣椒。当对甜椒植物进行包括转化 和再生的方法时，已报道了观察到以下现象：不能从愈伤组织形成叶 原基；无法通过再生阶段形成叶状结构；再生组织中无芽；枝芽不能 伸长；从枝芽发育为芽状畸胎瘤；顶端分生组织不能伸长；再生芽的 顶端优势降低；在选择性压力下由长成的愈伤组织再生非转基因芽； 再生芽的繁殖率下降；不能从转基因芽发育成正常的根系统或者植物 组织或器官的生长严重迟缓。而且已知会出现假阳性植物，即不含有 所需的赋予抗性的基因的成熟非转基因植物，所述赋予抗性的基因使 得植物可在选择性压力下生长。因此可以说现有技术未教导用于提供 成熟的转基因甜椒植物的合适的且有效的或可靠的转化和再生方法。 本发明的优点在于提供了一种获得成熟的转基因甜椒植物的方法。

应用本发明的方法使得可以提供成熟的转基因甜椒植物，特别是 还导致提供来自这些植物的完全发育的甜椒果实和能存活的种子。此 外，本发明可用于提供含有外源BBM核苷酸序列的萌发幼苗。对自 体受精的成熟转基因植物的分离分析证明所述转基因被下一代的后 代所继承。几种成熟转基因植物的后代的孟德尔分离对应于单一基因 座的存在。表4示出了所述分离分析的结果。因此，本发明提供成熟 的转基因甜椒植物，所述转基因甜椒植物产生包含所述转化的核苷酸 序列的能存活的后代。

通过本发明方法获得的转基因甜椒种子以保藏号NCIMB 41732 保藏。

本发明的另一方面涉及BBM蛋白或其功能性同源物（homolog）， 其特征在于与SEQ ID No：1有至少50%、60%、70%、优选80%、 更优选90%、甚至更优选至少95%、最优选至少98%的同一性，或 者其中所述BBM蛋白是SEQ ID No:1。蛋白是否是BBM同源物可 通过以下方式来确定：与SEQ ID No:1的BBM蛋白相比，评估目的 蛋白是否导致与BBM靶基因的启动子连接的报告基因发生类似的表 达。所述靶基因包含例如肌动蛋白解聚因子9（ADF9;GeneID： 829649，TAIR：AT4G34970）。

或者，候选基因可使用编码所述候选BBM蛋白的表达载体来被 转化到甜椒植物中，所述表达载体提供所述BBM候选蛋白的可诱导 核转录活性。根据本发明，当转化到甜椒植物的植物细胞中后，所述 受试植物材料会发育为一个或多个成熟的转基因植物。确定基因或蛋 白是否是本发明的BBM功能性同源物完全在技术人员的能力范围之 内。在初始研究中，技术人员可查阅由例如 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的研究所或任何其他这样的研究 所提供的现代电子分子生物技术工具和数据。这样的工具和数据库向 技术人员提供手段以快速评估是否存在任何迹象表明任何未知的基 因或蛋白是否可为BBM的功能性同源物。这种迹象可包括在相关进 化枝或相同进化枝的进化保守性和分类方面与BBM有关的未知序列 的信息；所述未知序列是否属于BBM相关的基因或蛋白类，例如包 含ANT、PLT1、PLT2的AP2家族；特定结构域（例如AP2结构域） 的共享；这些共享的结构域（例如单一或重复的AP2结构域）的数 量；基因或蛋白的命名，例如称为BBM样的序列。因此，仅有限数 量的基因或蛋白在研究的第二阶段需要被转化到顽拗植物（特别是甜 椒）中以证实目的序列是否是BBM的功能性同源物。因此，根据此 方法，现代生物技术领域的技术人员会能够不付出过度劳动即确定基 因或蛋白是否为BBM的功能性同源物。

本文中的术语“序列同一性”被定义为在SEQ ID No:1的全长 BBM蛋白上相同氨基酸的数量除以全长的氨基酸数量再乘以100。 例如，与SEQ ID No:1具有90%同一性的序列包含在SEQ ID No:1 的579个氨基酸的全序列上521个相同的氨基酸，作为实例如下计算： 521/579*100=90%。

BBM对于多种不同的物种是保守的，例如欧洲油菜(Brassica  napus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、蒺藜苜蓿(Medicago  trunculata)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)。如在本申请中公开 的，可使用十字花科(Crucifers或Brassicaceae)分类群的植物的BBM 基因，通过包括转化和再生的方法来获得不同并远缘的茄科的成熟转 基因植物。进化保守的水平似乎使这些蛋白适于对不同顽拗植物物 种——包括茄科，或者甚至从单子叶植物到双子叶植物——应用所述 方法。

  gi编号   植物物种   gi：21069055   欧洲油菜   gi：21069053   欧洲油菜   gi：58761187   蒺藜苜蓿   gi：21069057   拟南芥Col 0   gi：151936654   拟南芥C 24   gi：46451393   拟南芥   gi：9755766   拟南芥   gi：195615496   玉米   gi：195612040   玉米   gi：21304227   水稻(Oryza sativa)   gi：189170271   非洲狼尾草(pennisetum squamulatum)   gi：189170265   非洲狼尾草   gi：189170267   水牛草(cenchrus ciliaris)   gi：189170269   水牛草

表1：与SEQ ID NO:1的BBM类似的各种植物物种的蛋白的GI编 号（GenInfo标识）。

本发明的另一个方面涉及编码BBM蛋白的核苷酸序列，所述序 列可操作地连接于选自转录激活子、翻译激活子或核靶向系统的遗传 元件。

这样的遗传元件可控制BBM蛋白的活性以使得所述BBM蛋白 具有合适的空间和/或时间活性。本文中的空间活性是指可以实现器 官或组织特异的BBM活性。使用这些遗传元件的一个优点是可防止 发生与不适当的BBM蛋白表达或活性有关的问题。

在优选实施方案中，BBM蛋白可操作地连接于核靶向系统。在 此实施方案中，可通过使得BBM:GR翻译融合的蛋白迁移或易位至 核来控制BBM的活性。

当本发明的遗传元件是转录激活子时，可在转录水平上调节 BBM活性。这种转录诱导系统可为包括乙醇诱导启动子或热休克诱 导启动子的系统。翻译激活子——其可以被置于5'UTR或3'UTR序 列中——可用于通过翻译控制来调节BBM活性。根据上述遗传元件， 技术人员会明了哪些系统可用于诱导BBM活性。其他合适的系统包 括雌激素诱导系统、PRP诱导系统、UAS诱导系统、任何包含VP16 的系统。

在本发明的优选实施方案中，编码BBM蛋白的核苷酸序列可操 作地连接于以SEQ ID NO：2为特征的核苷酸序列。由此核苷酸序列 编码的肽使得当植物材料与包含地塞米松（DEX）的培养基接触时 BBM蛋白的活性可被诱导。

在本发明的另一优选实施方案中，所述再生的转化植物细胞或植 物材料与包含适于诱导BBM蛋白活性的试剂的培养基接触。

在本发明的又一实施方案中，乙醇是适于诱导BBM蛋白活性的 试剂。在此实施方案中，乙醇可用于诱导外源BBM基因的转录。用 于诱导转录的其他系统也适于实施本发明。BBM活性也可在其他水 平上（如翻译或翻译后水平上）被调节以实施本发明。

根据这方面的实施方案，所述表达载体还编码一种或多种选择性 标记，一种或多种目的蛋白和/或一种或多种目的转录产物。这种目 的蛋白包含提供对任何目的病原体的抗性的任何蛋白，但也是这样的 蛋白，即其是导致产生维生素、营养素、糖等的途径的一部分。

本发明还涉及可通过上述方法获得的包含外源核苷酸序列的成 熟转基因植物或其材料，所述外源核苷酸序列包含编码BBM蛋白的 核苷酸序列和适于允许诱导BBM蛋白活性的遗传元件，其中所述成 熟的转基因植物是顽拗植物。在本发明的优选实施方案中，所述成熟 的转基因植物是选自茄属、矮牵牛属、郁金香属、百合属、番红花属、 鸢尾属、唐菖蒲属、菠菜属、甜菜属、藜属、菜豆属、豌豆属、辣椒 属的顽拗植物的植物，特别是茄科的植物。

在本发明的更优选的实施方案中，所述成熟的转基因植物是甜椒 辣椒植物。

本发明的成熟转基因植物包含外源BBM蛋白或功能性同源物， 其特征在于与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％的同一性， 优选至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至 少95％的同一性以及最优选至少98％的同一性，或者其中所述外源 BBM蛋白是SEQ ID NO：1。优选地，所述成熟转基因植物在其基 因组中包含外源性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明的 BBM蛋白。

在本文中，外源核苷酸序列是已通过生物技术方法（例如转化） 被引入植物材料中的核苷酸序列。外源性蛋白是由所述外源核苷酸序 列编码的蛋白。

在本发明的又一实施方案中，所述遗传元件适于允许诱导所述外 源BBM蛋白的活性，所述遗传元件选自转录激活子、翻译激活子或 优选地是核靶向系统。

本发明的一个优点是，外源BBM蛋白活性可以以空间和时间的 方式被诱导以使所述BBM蛋白可实现合适的活性或表达。看起来尤 其有利地是，除了可能在转化和/或再生过程中诱导外源BBM活性以 外，外源BBM活性还可在其中外源BBM活性可能具有不利的副作 用的发育阶段减少或不存在。外源BBM的空间活性可使用组织特异 性启动子来控制。例如，使用在植物发育的繁殖阶段中无活性的启动 子可防止与不育有关的问题。在转化的植物材料的再生过程中，优选 使用在幼苗生长和发育阶段有活性的启动子。

本发明的遗传元件可操作地连接于外源BBM基因以允许外源 BBM的合适活性。合适的元件包含任何热休克诱导系统、乙醇诱导 系统、雌激素诱导系统、PRP诱导系统、UAS诱导系统和任何包含 VP16的系统。技术人员明了哪些其他合适的系统可用于实施本发明， 以及哪些生物技术方法可用于生产这样的系统。

还可想到可能通过以下方法来控制本发明的BBM活性：基于使 用主要抑制子（dominant repressor）、主要激活子、反义构建体、 RNAi构建体、siRNA构建体、敲除的方法或具有相同的影响BBM 活性的效果的其他类似方法。

本发明的优选实施方案涉及适于允许诱导BBM蛋白活性的以 SEQ ID No:2为特征的遗传元件。此遗传元件可被可操作地连接于所 述BBM蛋白，这会导致翻译融合。这种可操作的连接使得所述BBM 蛋白可定位于转基因细胞的核中，这样可诱导BBM的活性。在该实 施方案中，外源BBM的活化由SEQ ID NO：2编码的肽所介导，当 植物材料与包含地塞米松的培养基接触时，所述肽允许所述BBM蛋 白的活性被诱导。

此外，本发明涉及本发明的成熟转基因植物的后代、植物部分、 种子或克隆。本发明的一个优点是可从本发明的成熟转基因植物获得 后代。这种后代可从成熟的转基因植物获得，例如通过无性繁殖从组 织或器官获得。在这种情况下，后代可通过用于繁殖细胞、组织、器 官或任何合适的植物部分的合适方法获得。这种方法可包括通过各种 手段克隆植物材料，例如嫁接、叶插条繁殖、插条生根或其他此类合 适的方法。繁殖方法还可包括基于制备接合体以获得后代的技术。这 些技术包括通过雌核发育或雄核发育生产双倍体后代。为获得后代还 想到了包括植物组织培养或植物细胞培养的合适方法。

还认为可通过将本发明的BBM基因克隆到遗传构建体中来实施 本发明，所述遗传构建体包含使得编码BBM的核苷酸序列可从植物 细胞基因组中被切除、重组或丢失的核苷酸序列。这种系统包括例如 Cre-Lox系统或FLP/FRT系统，但也可包括其他合适的重组系统。

还应注意，转基因和/或非转基因后代可从本发明的成熟转基因 植物获得。这样的后代可通过以下方式获得：对成熟的植物进行杂交 受精或自体受精（均允许按照孟德尔定律分离转基因）。非转基因的 后代可通过以下方式获得：使对于所述转基因是杂合子的成熟转基因 植物自体受精，或者使成熟的转基因植物与不包含BBM转基因的任 何其他合适植物杂交，经由此方式可获得非转基因的后代。

本发明的另一方面涉及通过本发明方法可获得的成熟转基因植 物或植物部分作为共转化系统的用途。本发明的范围还包括包含本发 明的可诱导BBM核苷酸序列的核苷酸分子作为共转化系统的基础， 优选作为无标记系统的用途。

本文想到了几个实施方案；在第一个实施方案中，植物材料来自 被包含目的基因的另一个表达构建体所转化的包含外源性可诱导的 BBM的植物，例如T1或更高等的甜椒植物。此T1或更高等的植物 可能对于所述外源性可诱导BBM转基因是杂合子或纯合子。在第二 个实施方案中，植物材料来源于被表达构建体转化（并再生为成熟的 转基因植物）的非转基因顽拗植物，所述表达构建体除了编码可诱导 BBM蛋白的核苷酸序列以外还包含编码一个或多个目的基因或一个 或多个目的遗传元件的另一个核苷酸序列。此方法的一个优点是包括 编码可诱导BBM蛋白的核苷酸序列，这样使得可获得有效的无标记 转化和再生，因为所获得的每种成熟植物基本上均包含所述可诱导 BBM构建体以及所述另外的目的核苷酸序列。

在另一实施方案，非转基因的顽拗植物细胞或材料被包含编码可 诱导BBM蛋白的核苷酸序列的表达构建体和包含另一目的核苷酸序 列的另一种不同表达构建体所转化。优选地，使顽拗植物细胞或植物 材料同时接触所述两种表达构建体。此另一目的核苷酸序列可编码或 优选地编码另一目的蛋白。这些实施方案中的一个优点是，顽拗植物 物种（例如甜椒）基本上可被任何目的核苷酸序列或基因转化并再生。 这种目的核苷酸序列可选自针对目的序列的RNAi序列或反义序列、 过表达序列、功能获得性序列或任何其他目的序列。

两个实施方案均可获得除外源BBM以外还可包含任何其他目的 核苷酸分子的成熟转基因植物，例如甜椒。

涉及所述共转化系统的第一个实施方案具有另一优点，即可首先 基于合适的表型或基因型选择包含外源BBM的转基因植物。合适的 表型可包括充分生长或发育的植物或者具有合适的繁殖能力或任何 其他合适或优选的表型的植物。合适的基因型可涉及所述转基因的稳 定性，例如由位置效应导致的BBM的表达水平；所述构建体的泄漏 （即不适当的BBM活性）；在单个植物中的转基因的数量；在单个 植物中的单一整合位点处存在的构建体的数量（多个拷贝的T-DNA 构建体可在单一基因座处插入）或任何其他合适或优选的特性。

涉及所述共转化体系统的第二个实施方案具有另一个优点，即其 可以单次转化和再生处理获得顽拗植物，所述顽拗植物除了外源的 BBM以外还可包含任何其他目的核苷酸序列。

此处应特别注意，在这两种实施方案中均可使用原生质体进行所 述共感染或共转化。

因此，额外地或替代地，本发明提供了一种获得成熟的转基因植 物的方法，包括在再生过程中在转化的植物细胞或在转化的植物材料 中诱导BBM活性，其中所述植物细胞或植物材料包括外源核苷酸分 子，所述外源核苷酸分子包含编码BBM蛋白的核苷酸序列，所述序 列可操作地连接于适于允许诱导BBM蛋白活性的遗传元件，并且其 中所述植物细胞或植物材料来源于顽拗植物，尤其是甜椒。在需要时， 所述转基因植物细胞或转基因植物材料再生为成熟的转基因植物。所 述植物细胞或植物材料可来源于T1或更高等的转化体。此植物优选 地为所述可诱导BBM转基因的纯合子，但也可为杂合子。

再生可通过以下方式实现：使所述转化的植物细胞或植物材料与 包含适于诱导BBM蛋白活性的试剂的培养基接触。

由于所述T1或更高等的植物包含活性可被诱导的BBM蛋白， 因此对应的顽拗植物在BBM活化后被赋予再生能力。这开辟了以下 可能性：所述转化的植物细胞或植物材料可被包含另一目的核苷酸序 列——特别是编码目的蛋白的核苷酸序列——的另一核苷酸分子所 转化，并使此植物材料再生为成熟的转基因植物。此第二种目的核苷 酸序列还可包含针对目的序列的RNAi序列或反义序列、过表达序列、 功能获得性序列或任何其他目的序列。由于存在活性可被诱导的外源 BBM蛋白而具有再生能力的顽拗植物是令人感兴趣的，特别是目前 可以首次以基本上任何目的核苷酸序列或基因有效转化和再生至成 熟的甜椒。因此，在此实施方案中，所述方法作为本文所指的共转化 系统使用。

或者，包含编码可诱导BBM蛋白的核苷酸序列的植物细胞或植 物材料的再生可被用于植物繁殖目的，因为包含编码可诱导外源 BBM蛋白的核苷酸序列的转基因植物在与包含适于诱导本文所指 BBM的试剂的培养基接触时会形成多个体细胞胚。优选地，当需要 更多的体细胞胚时，此培养基还包含合适量的细胞分裂素，例如赛苯 隆（thidiazuron）、玉米素或6-苄氨基嘌呤。由于发现子叶外植体表 面上清晰可辨的体细胞胚数量超过至少100，因此可分离这些胚并使 它们萌发，并进一步发育为成熟的转基因植物。此可育的植物材料， 优选地来自外植体，特别是子叶外植体。

此外，从来源于体细胞胚的生长中或成熟中的植物材料获得的材 料或细胞可通过以下方式而进行另一轮繁殖：在再生过程中诱导 BBM从而提供体细胞胚。

发明的最后一个方面涉及核苷酸分子用于使植物材料转化并再 生为成熟转基因植物的用途，其中所述植物材料来源于顽拗植物，其 中所述核苷酸分子包含编码BBM蛋白的核苷酸序列，其中所述BBM 蛋白的特征在于与SEQ ID NO：1具有至少50％、60％、70％，优 选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少 98％的同一性或者其中所述BBM蛋白的特征在于SEQ ID NO：1。

在本发明此方面的优选实施方案中，编码BBM蛋白的核苷酸序 列可操作地连接于适于允许诱导所述BBM蛋白的活性的遗传元件。

在本发明此方面的另一优选实施方案中，所述遗传元件适于允许 诱导BBM蛋白，所述遗传元件选自转录激活子、翻译激活子或优选 地为核靶向系统。

在本发明此方面的又一优选实施方案中，所述遗传元件适于允许 诱导BBM蛋白SEQ ID No:2的活性。

在本发明此方面的最后一个实施方案中，所述顽拗植物选自茄 属、矮牵牛属、郁金香属、百合属、番红花属、鸢尾属、唐菖蒲属、 菠菜属、甜菜属、藜属、菜豆属、豌豆属、辣椒属，特别是来自茄科 的植物，更特别是甜椒辣椒植物。

在本申请中，参照了以下附图：

图1示出了多种植物物种的BBM蛋白的系统发生树。

图2示出了有愈伤组织形成的3周龄的外植体。

图3示出了对照的愈伤组织和SLS形成。

图4示出了用35S::BBM:GR转化的外植体的SLS上的体细胞胚 形成。

图5示出了伸长的芽。

图6示出了扎根的芽。

图7示出了转基因红色方型辣椒（red blocky type）。

图8示出了转基因黄色方型辣椒（yellow blocky type）。

图9示出了转基因植物的种子。

图10示出了含有Km的培养基上的分离后代。

图11示出了分离的转基因植物的表型。上排示出了Km抗性幼 苗，下排示出了Km易感幼苗。

图12示出了用对照或35S::BBM：GR转化的子叶外植体的愈伤组 织、芽状结构（SLS）和芽的形成的百分比。

图13示出了对转基因辣椒植株进行的PCR结果的凝胶。泳道： M，分子量标记；P，35S::BBM:GR质粒DNA；A，非转基因拟南芥； A+，转基因拟南芥；C，非转基因辣椒;C1-4，独立的转基因甜椒； C5-8，来源于相同外植体的转基因辣椒芽。

图14示出了W138背景的转基因矮牵牛的芽再生。

图15示出了W138背景的转基因矮牵牛的芽再生。

图16示出了SEQ ID No:1。

图17示出了SEQ ID No:2。

图18示出了SEQ ID No:3。

图19示出了在诱导核转录babyboom活性后，包含 35S::BBM::GR的甜椒转基因株系的T1后代中在伤口位点的边缘处 的体细胞胚形成。

本发明通过下面的实施例进一步说明，所述实施例不意图以任何 方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1

用BBM对甜椒的基因转化

包含SEQ ID No:1和SED ID No:2的辣椒种甜椒植物的基因转 化。使用来自表型和遗传型不同的变种Fiesta、Ferrari和Spirit的植 物。

供体植物的生长

将F1杂种Fiesta、Ferrari和Spirit（Enza Zaden，荷兰）的表 面消毒的种子播种在添加有2％蔗糖、以0.8％Microagar（Duchefa） 凝固的完全MS培养基（Murashige和Skoog，1962）上。将十天龄 的子叶切成3-10mm的外植体，并于23℃和在昏暗的光线条件下在 共同培养基（co-cultivation medium,CCM）上预培养下1-2天。CCM 包含添加有1.6％葡萄糖和2mg/L的玉米素核苷（zeatin riboside）、 0.1mg/L的3-吲哚乙酸（IAA）或0.25-1mg/L苯基噻二唑脲 （thidiazuron，TDZ）、10μM地塞米松并以0.7％Microagar凝固的 改良R培养基。在6-10个独立重复的实验中，每个构建体平均使用 200个外植体。

根癌农杆菌的培养

将携带35S::BBM:GR(包含35S启动子，其可操作地连接于BBM 编码序列(SEQ ID No:1)——糖皮质激素受体(GR)与其在翻译上融合 (SEQ ID No:2)）、35S::BBM（包含35S启动子，其可操作地连接于 BBM编码序列SEQ ID No:1）或携带35S::GUS的对照质粒的根癌农 杆菌菌株GV3101+pMP90在100ml YEB培养基（0.5%酵母提取物、 0.5%牛肉膏、2%蔗糖，pH7.2）中并且在存在合适的抗生素利福平(100 mg/L)、硫酸卡那霉素(100mg/L)和/或庆大霉素(25mg/L)的条件下于 28℃过夜培养。植物转化之前，将根癌农杆菌悬浮液用添加有40mg/L 新鲜配制的乙酰丁香酮(Sigma)的液体CCM稀释至OD660为0.3-0.4。

植物材料的遗传转化

将稀释的根癌农杆菌培养物加入至预培养的外植体并在室温下 孵育30-60分钟。将外植体吸干，再在添加有40mg/L乙酰丁香酮的 CCM上于昏暗的光线条件和23℃下共培养2-3天，然后转移至由添 加有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L的头孢噻肟（cefotaxime） 的CCM构成的选择性培养基。

转基因植物材料的再生

将外植体转移至16/8小时昼/夜方案的23℃全光照条件下两个 月，其中四周后进行一次传代。将具有萌发的芽状结构的外植体转移 至伸长培养基（EM）中培养四周时间，所述伸长培养基由MS培养 基(Murashige and Skoog 1962)的macro salt和micro salt混合物、B5 培养基的维生素(Gamborg O.L.1968)、1.6％葡萄糖、1mg/L肌醇、 20mg/L硫酸腺嘌呤、200mg/L酪蛋白水解物、10mg/L GA3、4mg/L BAP，30μM硫代硫酸银、100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L头孢 噻肟构成。将伸长的芽转移至预生根培养基(ptr-rooting medium, PRM)中培养两个月，然后转移至生根培养基，所述预生根培养基为 添加有30mg/L谷胱甘肽、60ml/L硫酸卡那霉素和300mg/L头孢噻 肟的改良MS培养基，所述生根培养基由添加有2％蔗糖、50mg/L 头孢噻肟和万古霉素并且有或没有1mg/L IAA的Rugini培养基构 成。将生根的芽转移至温室中并使其结籽。所有组织培养相关的化学 品均由Duchefa Biochemicals,Haarlem,The Netherlands供应。

转基因芽的分析

通过CTAB微制备方法从叶片分离DNA并将其溶解于50μl TE(10mM Tris,pH 8,1mM EDTA)。基于公布的cDNA序列 （AF317904，-905）设计了BBM特异性的引物：BBMfw: gttaggyttytctctmtctcc，BBMrw:gggctgcaaatccttgataacca。所述转化 质粒和转基因拟南芥株系的DNA用为对照。PCR混合物根据供应商 的方案使用。PCR条件：94℃15秒，48℃30秒，72℃45秒，35个循 环。结果示于图13。

转基因后代的分析

将每个单个转基因芽均自花传粉，并还与原始供体株系的植物杂 交以分析转基因的遗传。收获后将种子表面消毒并播种到MS培养 基、2％的蔗糖、0.8％的microagar和200mg/L硫酸卡那霉素或100 ml/L硫酸巴龙霉素上。播种4周后对分离进行评估。

结果

总计，将3个栽培种的超过10000个外植体与对照或BBM构建 体共培养。在选择性培养基上前3周的培养中，所有外植体尺寸均增 加并且可见小的浅绿色或白色愈伤组织。再过两个星期后，根据所使 用的细胞分裂素的类型，切口表面发生愈伤组织的形成和/或直接芽 形成。在TDZ存在的情况下，外植体形成多个芽状结构（SLS）而 玉米素核苷主要诱导愈伤组织和少量的SLS（图2和3）。在这个阶 段，35S::BBM:GR转化的外植体产生比对照更多的SLS。转移至EM 培养基后，只有35S::BBM:GR SLS繁殖并在接下来的3-4周内在初 生叶片上形成芽或体细胞胚（图4和5及表2）。将合适的芽转移至 PRM后其萌发、伸长和形成均被增强。在将伸长的芽转移至生根培 养基后的两周内发生根形成。转化后六个月，将生根的芽转移至岩棉 块并使其适应温室条件以产生种子。

表2：

  外植体数   SLS数   ％SLS   生根芽   35S::BBM：GR   5620   662   11，78   170   35S：BBM   1128   11   0，98   0

表2示出了两种BBM构建体的再生的比较。

用35S::BBM:GR构建体进行的转化产生转基因芽，但对照不产 生。在选定条件下，所述对照转化显示出产生愈伤组织而不是芽状结 构（SLS）或芽（图12）。在所述3个测试的株系中，Fiesta表现出 最高的再生能力（48％），其次是Spirit（3.4％）和Ferrari（1.7％） （见表3）。适应温室条件后，植物迅速生长并开花但比未转化的对 照植物矮约30％。自体受精和杂交成功进行，显示繁殖能力未被所 述转化和再生过程影响。

体细胞胚胎发生的启动导致形成转基因植物的多个芽（图5）。 在几个独立转化实验中，产生总数超过20的独立的Fiesta和Ferrari 转基因植物。通过PCR对来源于相同外植体的独立的T0植物进行的 分子分析表明，所有的芽均是转基因的并且整体转化率为0.5％至1 ％，所述转化率是由每次转化使用的外植体的初始数量计算。

分离分析表明所述转基因根据孟德尔遗传模式遗传（见表4）。

表3

  外植体的数量   芽的数量   ％   Ferrari   886   15   1，7   Fiesta   1304   626   48   Spirit   1781   61   3，4

表3示出了以35S::BBM:GR转化后不同变种的芽形成的百分比。

表4

表4示出了对来源自在选择性培养基上生长的自体受精的成熟 转基因植物的后代的分离分析。

讨论

所述结果表明，通过使用可诱导的过度表达的BBM基因，可直 接或通过体细胞胚胎发生而再生转基因甜椒植物的高品质芽，并且所 述转基因被遗传到下一代。

已经大量研究了对辣椒种及变种的体细胞胚形成的诱导，使得可 再生为正常植物。然而，在甜椒中，尽管对体细胞胚的诱导是可能的， 但胚缺乏顶端分生组织且不能发育为正常植株。通过在再生过程中激 活BBM基因，其有可能再生有繁殖能力的甜椒植物。

实施例2

用BBM对顽拗矮牵牛W138进行遗传转化

矮牵牛系W138已被证明对再生及随后的转基因植物生产是顽拗 的。

在企图获得成熟的转基因矮牵牛植物的尝试中，使用矮牵牛转化 的常规方案转化W138外植体。

将W138背景的两个株系(NC2676-10,NC2676-11)与W5背景的 一个株系（293）用可诱导的BBM构建体(35S::BBM::GR)或对照 T-DNA构建体转化，所述对照构建体含有GUS报告基因。在含有两 种构建体的所有三个株系中均获得了卡那霉素抗性的愈伤组织，其中 NC2676-11效率最高，其次为293。对照构建体的愈伤组织表现出强 的GUS表达。

芽状结构（SLS）和原基首先在NC2676-11株系中出现，继而以 相同顺序在其他组织的出现，然而仅在35S:BBM::GR转化的愈伤组 织中观察到进一步的发育和生长（图14和15）。

如同在甜椒中，BBM的过表达使得在顽拗植物中形成转基因芽。

实施例3.

35S::BBM::GR株系的后代分析

将多个35S::BBM::GR株系的纯合子T1后代在体外于共同培养 基上培养，所述培养基还包含TDZ、DEX和/或TDZ和DEX，或者 不含TDZ/DEX作为对照。

对纯合子35S::BBM:GR株系的子叶外植体的培养揭示了核诱导 和非核诱导的BBM蛋白导致的发育差异。在已被横向切开的子叶的 边缘处，形成体细胞胚（图19）。在无DEX的培养基上生长的子叶 外植体中并没有观察到这些效应。

本文的结果表明，受控制的外源BBM表达可用于生产高品质的 且形态正常的转基因甜椒的芽。这些体细胞胚确实与合子胚有惊人的 相似性。事实上，在辣椒子叶上可诱导大量（>100）的体细胞胚。与 组织培养中的成熟甜椒植物的形成相比，可在辣椒外植体上识别的这 种胚的量高到足以达到至少100倍的倍增因数。此发现还使得技术人 员可繁殖雄性不育甜椒植物而不需使用保持系。

参考文献

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