通过抑制膜结合转录因子肽酶,位点1(MBTPS1)的天然反义转录物来治疗MBTPS1相关疾病

摘要

本发明涉及调节膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)的表达和/或功能的反义寡核苷酸，尤其是，通过靶向膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)的天然反义多核苷酸。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定和它们在治疗与MBTPS1表达相关的疾病和病症中的用途。

说明书

发明领域

本申请要求2009年12月16日提交的美国临时专利申请号 61/286924的优先权，其以引用方式整体并入本文。

本发明的实施方案包括调节MBTPS1及相关分子的表达和/或功 能的寡核苷酸。

发明背景

DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重 要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变 其表达的多种技术而言也至关重要。反义核苷酸，例如通过与靶RNA 杂交从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制来破坏基因表达。反义 DNA具有额外的特征，即DNA-RNA杂合体用作被核糖核酸酶H消 化的底物，这是在大多数细胞类型中都存在的活性。反义分子可被递 送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情形，或反义分子可由内源基 因表达为RNA分子。FDA最近批准了一种反义药物VITRAVENE^TM（用于治疗巨细胞病毒视网膜炎），反映出反义药物具有治疗效用。

发明概述

提供该发明概述以展示本发明的内容，从而简要地指出本发明的 性质和实质。应理解该发明概述的提交不会用来解释或限制权利要求 书的范围或含义。

在一个实施方案中，本发明提供通过利用靶向天然反义转录物任 何区域的反义寡核苷酸，导致相应有义基因的上调而抑制天然反义转 录物作用的方法。本文还预期，天然反义转录物的抑制可通过siRNA、 核酶和小分子实现，它们被视为落在本发明的范围内。

一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中 MBTPS1多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括述细胞或组织与 长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与 包括SEQ ID NO:2的核苷酸1至1240中的5至30个连续核苷酸的 多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性，从而在体内或体 外调节患者细胞或组织中MBTPS1多核苷酸的功能和/或表达。

在另一个实施方案中，寡核苷酸靶向MBTPS1多核苷酸的天然 反义序列例如SEQ ID NO:2所列的核苷酸以及其任何变体、等位基 因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实 例如SEQ ID NO:3至6所列。

另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中 MBTPS1多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括述细胞或组织与 长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与 MBTPS1多核苷酸的反义的反向互补序列具有至少50%的序列同一 性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中MBTPS1多核苷酸的 功能和/或表达。

另一实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中 MBTPS1多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括述细胞或组织与 长度为5至30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与 MBTPS1反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%的序列同一性； 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中MBTPS1多核苷酸的功能 和/或表达。

在一个实施方案中，组合物包含一种或多种结合到有义和/或反 义MBTPS1多核苷酸的反义寡核苷酸。

在另一实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰或取代的核苷 酸。

在另一实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰的键。

在又一实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的碱基，其包括硫代 磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟-或碳、亚甲基或其它 锁核酸(LNA)分子。优选地，修饰的核苷酸为锁核酸分子，包括α -L-LNA。

在另一实施方案中，寡核苷酸经皮下、肌内、静脉内或腹膜内被 施用于患者。

在另一实施方案中，寡核苷酸以药物组合物的方式施用。治疗方 案包括向患者施用反义化合物至少一次；然而，可修改该治疗以包括 经一段时间的多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的治疗联 合。

在另一实施方案中，寡核苷酸被包封在脂质体中或被连接于载体 分子（如，胆固醇、TAT肽)。

其它方面在下文描述。

附图简述

图1是实时PCR结果的图，其示出通过用Lipofectamine 2000引 入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理HepG2细胞后与对照相比MBTPS1 mRNA的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，用针对MBTPS1 反义Hs.568369设计的一种寡核苷酸处理后48h，HepG2细胞中 MBTPS 1mRNA的水平显著增加。标为CUR-1317、CUR-1315、 CUR-1316和CUR-1318的条柱分别对应用SEQ ID NO:3至6处理的 样品。

序列表描述-SEQ ID NO:1：智人膜结合转录因子肽酶，位点1 (MBTPS1)，mRNA（NCBI检索号：NM_003791）；SEQ ID NO:2： 天然MBTPS1反义序列(Hs.568369)；SEQ ID NO:3至6：反义寡核 苷酸。*指示硫代磷酸酯键。

发明详述

下面参考用于说明的实例应用来描述本发明的多个方面。应理解 的是，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的充分理解。 然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，可在不存在一种或多 种这些具体细节的情况下实践本发明或以其它方法实践本发明。本发 明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以按不同顺序进行和/ 或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都 是实施根据本发明的方法所需的。

本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应来自本文公 开的组合物和方法可适用的任何物种的同系物。因此，这些术语包括 但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应理解的是，当公开来自 具体物种的基因或基因产物时，此公开内容意为仅是示例，不应解释 为限制，除非其出现的上下文中清楚地指明。因此例如对于本文公开 的基因，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，意为 涵盖来自其它动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其它 动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼、两栖类、爬行动物和鸟类。在 一个实施方案中，基因或核酸序列是人的。

定义

本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不意为限制 本发明。除非上下文另外清楚地指明，否则本文所用的单数形式“一 个/种”和“该/所述”旨在包括复数形式。而且，在具体实施方式和/ 或权利要求中使用术语“包括”、“具有”、“带有”或其变化形式 的程度上，此类术语以类似于术语“包含”的方式是包括在内的。

术语“约”或“大约”是指对于由本领域普通技术人员确定的特 定数值在可接受的误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该 数值，即，测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，“约”可 表示在1个或多于1个标准差内。或者，“约”可表示直到给定数值 的20%、优选10%、更优选5%、更优选1%的的范围。或者，尤其 是有关生物系统或方法，该术语可表示在数值的一个数量级内，优选 地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特 定数值时，除非另外指明，否则应假设术语“约”对特定数值表示在 可接受的误差范围内。

本文所用的术语"mRNA"是指靶基因的目前已知的mRNA转录 物和可阐明的任何进一步转录物。

所谓“反义寡核苷酸”或“反义化合物”是指结合到另一RNA 或DNA（靶RNA、DNA）的RNA或DNA分子。例如，如果其为 RNA寡核苷酸，则其借助于RNA-RNA相互作用结合到另一RNA靶 并改变靶RNA的活性(Eguchi等，(1991)Ann Rev.Biochem.60, 631-652)。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功 能。该定义意为包括从治疗、诊断或从其它观点来看有用的任何外来 RNA或DNA分子。此类分子包括例如反义RNA或DNA分子、干 扰RNA (RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治 疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核 苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接体、引物、探针和与 靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以 按单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或 脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸” 还包括天然和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧 核糖核苷、核糖核苷、取代形式和其α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁 核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯等。寡核苷酸能够经由单体间相 互作用的规律模式（例如沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基配对、 或反相型碱基配对等）与靶多核苷酸特异性结 合。

寡核苷酸可以是“嵌合的”，即，由不同区域组成。在本发明的 上下文中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区 域例如（多个）DNA区域、（多个）RNA区域、（多个）PNA区域 等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，即在寡核苷酸化合物的 情形中所述单体单位为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区 域，其中寡核苷酸被修饰以表现一种或多种期望特性。寡核苷酸的期 望特性包括但不限于例如对核酸酶降解的抗性增强、细胞摄取增加、 和/或对靶核酸结合亲和力增加。因此，寡核苷酸的不同区域可具有 不同特性。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的 寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结 构。

寡核苷酸可包含可“对准（register）”连接（即当单体被连续地 连接时，如在天然DNA中）的区域，或经由间隔物连接的区域。预 期间隔物构成区域之间的共价“桥”，在优选情形中具有不超过约 100个碳原子的长度。间隔物可携带不同功能性例如具有正电荷或负 电荷，携带特定的核酸结合特性（嵌入剂、槽沟结合剂、毒素、荧光 团等），为亲脂的，诱导特定的二级结构，如例如，诱导α-螺旋的 含丙氨酸的肽。

本文所用的"MBTPS1"和“膜结合转录因子肽酶，位点1”包括 所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非 编码序列、有义和反义多核苷酸链等。

本文所用的词语膜结合转录因子肽酶，位点1、MBTPS1、 KIAA0091、膜结合转录因子位点1肽酶、MGC138711、MGC138712、 PCSK8、S1P、S1P内肽酶、位点1肽酶、SKI1、SKI-1、枯草杆菌蛋 白酶/kexin同工酶1在本申请中可交换地使用。

本文所用的术语“对…有特异性的寡核苷酸”或“靶向…的寡核 苷酸”是指具有(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能 够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核 苷酸。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确 定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例测定在下文实施例 中描述。

本文所用的术语“靶核酸”涵盖DNA、从这种DNA转录的RNA （包括premRNA和mRNA）、还有从这种RNA衍生的cDNA、编 码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸 的特异性杂交会干扰核酸的正常功能。特异性地与靶核酸杂交的化合 物对靶核酸功能的这一调节通常称为“反义”。待干扰的DNA功能 包括例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如 RNA向蛋白翻译位点的移位，从RNA翻译蛋白，剪接RNA以产生 一种或多种mRNA物质，可能由RNA参与或促进的催化活性。这种 干扰靶核酸功能的总体效果是调节编码产物或寡核苷酸的表达。

RNA干扰"RNAi"由对其“靶”核酸序列具有序列特异性的同源 性的双链RNA(dsRNA)分子介导(Caplen,N J.,等，(2001)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 98:9742-9747)。在本发明的某些实施方案中，介导物 是5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于 称为Dicer的RNase酶对dsRNA的加工(Bernstein,E.,等，(2001)Nature 409:363-366)。siRNA双链体产物被募集到称为RISC（RNA诱导沉 默复合体）的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何具体理论束缚， 据信随后RISC被引导至靶核酸（适当地为mRNA），在那里siRNA 双链体按序列特异性方式相互作用来以催化方式介导裂解(Bernstein, E.,等，(2001)Nature 409:363-366;Boutla,A.,等，(2001)Curr.Biol. 11:1776-1780)。根据本发明可使用的小干扰RNA可根据本领域公知 并且本领域普通技术人员熟悉的方案合成和使用。用于本发明方法的 小干扰RNA适当地包含约1至约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施 方案的实例中，siRNA可包含约5至约40个nt、约5至约30个nt、 约10至约30个nt、约15至约25个nt或约20-25个核苷酸。

通过利用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性的区域的计 算机程序来便于选择适当的寡核苷酸。此类程序用来比较获得的核酸 序列，例如通过搜寻数据库诸如GenBank或通过对PCR产物测序。 比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展示适当的同 一性程度的核酸序列。在未被测序的基因的情形中，进行Southern 印迹以允许确定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领 域所熟知的，通过以不同的严格程度进行Southern印迹，可能获得同 一性的近似测量。这些工序允许选择展现与待控制的受治疗者中的靶 核酸序列的高程度互补性和与其它物种中的相应核酸序列的较低程 度互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发明 的基因的适当区域方面存在相当大的自由度。

所谓“酶促RNA”是指具有酶促活性的RNA分子(Cech,(1988)J. American.Med.Assoc.260,3030-3035)。酶促核酸（核酶）通过首先 结合靶RNA来发挥作用。这种结合经由被保持在邻近用于裂解靶 RNA的分子的酶促部分处的酶促核酸的靶结合部分来进行。因此， 酶促核酸首先识别靶RNA并随后经由碱基配对结合靶RNA，并且一 旦结合到正确位点后，就酶促作用以切割靶RNA。

所谓“诱饵RNA”是指模拟关于配体的天然结合结构域的RNA 分子。因此，诱饵RNA与天然结合靶竞争结合特定的配体。例如， 已经显示HIV反式激活响应(TAR)RNA的过表达可作为“诱饵”起 作用并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合HIV RNA中编码 的TAR序列(Sullenger et al(1990)Cell,63,601-608)。这表示一个特 定的实例。本领域技术人员将认识到，这仅是一个实例，并且利用本 领域通常已知的技术可容易地产生其它实施方案。

本文所用的术语“单体”通常是指由磷酸二酯键或其类似物连接 以形成大小范围从几个单体单位如约3-4个至约数百个单体单位的寡 核苷酸的单体。磷酸二酯键合的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如以下更全面地描 述。

术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。 本领域技术人员应清楚的是，此前被认为是“非天然存在的”多种核 苷酸后来已在自然界中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知的含嘌 呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型 的核苷酸的示例性实例是含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿 嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮 黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6,N6-桥亚乙基-2,6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、 5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、 异鸟嘌呤、肌苷的分子，以及Benner等的美国专利号5,432,272中描 述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”预期涵盖这些实例的 每一种和所有以及其类似物和互变异构体。尤其值得关注的核苷酸是 包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它们被认 为是与人的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天 然2'-脱氧糖和2'-羟基糖，如，在Kornberg和Baker，“DNA Replication （DNA复制）”，第2版(Freeman,San Francisco,1992)中描述的，以 及它们的类似物。

提及核苷酸的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的 糖部分的合成的核苷酸（参见如，以下文献中所概述：Scheit, Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980;Freier & Altmann, (1997)Nucl.Acid.Res.,25(22),4429-4443,Toulm é,J.J.,(2001)Nature  Biotechnology 19:17-18;Manoharan M.,(1999)Biochemica et  Biophysica Acta 1489:117-139;Freier S.M.,(1997)Nucleic Acid  Research,25:4429-4443,Uhlman,E.,(2000)Drug Discovery & Development,3:203-213,Herdewin P.,(2000)Antisense & Nucleic Acid  Drug Dev.,10:297-310）；2'-O,3`-C-连接的[3.2.0]二环阿拉伯糖核苷 （参见如，N.K Christiensen.,等，(1998)J.Am.Chem.Soc.,120: 5458-5463;Prakash TP，Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7):641-9; Cho EJ,等，(2009)Annual Review of Analytical Chemistry,2,241-264）。 此类类似物包括被设计以增强结合特性，如，双链体或三链体稳定性、 特异性等特性的合成核苷酸。

本文所用的“杂交”是指寡聚化合物的大致互补链的配对。一种 配对机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基（核苷酸）之 间的氢键合，其可以是沃森-克里克、或逆氢键 合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是经由氢键形成而配对的互补核苷酸。 杂交可在各种情况下发生。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而导致 功能和/或活性的调节时，该化合物是“可特异性杂交的”，且在期望 特异性结合的条件下（即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理 条件下，和在体外测定的情形中进行测定的条件下）存在足够程度的 互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。

本文所用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指本发明化 合物将与其靶序列杂交，但与最小数目的其它序列杂交的条件。严格 条件是序列依赖性的且在不同情况中将是不同的，并且在本发明的背 景中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚化合物的性质 和组成以及研究它们的测定决定。通常，严格杂交条件包括低浓度 (<0.15M)的带有无机阳离子如Na++或K++的盐（即，低离子强度）、 比寡聚化合物:靶序列复合体的Tm高20℃-25℃的温度、和存在变性 剂诸如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、或去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS)。例如，对于每种1%甲酰胺，杂交率降低1.1%。高严格杂交 条件的一个实例是在60℃，0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1% (w/v)SDS进行30分钟。

本文所用的“互补”是指一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间 准确配对的能力。例如，如果在反义化合物某一位置的核碱基能够与 在靶核酸某一位置的核碱基成氢键，所述靶核酸为DNA、RNA或寡 核苷酸分子，则认为寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合位置是互补位 置。当每个分子的足够数目的互补位置被可彼此成氢键的核苷酸占据 时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互补的。 因此，“可特异性杂交”和“互补”是用来表示经足够数目的核苷酸 足够程度的准确配对或互补性，从而在寡聚化合物和靶核酸之间发生 稳定和特异性结合的术语。

本领域应理解的是，寡聚化合物的序列不必与其待可特异性杂交 的靶核酸的序列100%互补。而且，寡核苷酸可经一个或多个区段杂 交，从而其间的或相邻的区段不牵涉在杂交事件中（如，环结构、错 配或发夹结构）。本发明的寡聚化合物包括与其所靶向的靶核酸序列 中靶区域的至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约 85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约99%序列互补性。例 如，其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补从而将特 异性杂交的反义化合物将表示90%互补性。在这一实例中，其余非互 补核苷酸可聚簇或由互补核苷酸间断，不必彼此连续或与互补核苷酸 连续。因此，具有侧翼为与靶核酸具有完全互补性的两个区域的4（四） 个非互补核苷酸的长度为18个核苷酸的反义化合物将与靶核酸具有 77.8%总互补性，因此将落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸 的区域的互补性百分比可常规地利用本领域已知的BLAST程序（碱 基局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序来确定(Altschul等，(1990) J Mol.Biol.,215,403-410;Zhang and Madden,(1997)Genome Res.,7, 649-656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用 Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,(1981)2,482-489)的Gap 程序（Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的版本8，Genetics  Computer Group,University Research Park,Madison Wis.）并使用默认 设置进行测定。

本文所用的术语“热解链温度(Tm)”是指在限定指定离子强度、 pH和核酸浓度下，与靶序列互补的寡核苷酸的50%平衡地与靶序列 杂交的温度。通常，严格条件将是其中盐浓度为至少约0.01至1.0M Na离子浓度（或其它盐）、pH 7.0至8.3，且对于短寡核苷酸（如， 10至50个核苷酸）温度为至少约30℃的条件。严格条件还可通过加 入去稳定剂诸如甲酰胺来实现。

本文所用的“调节”是指基因表达的增加（刺激）或减少（抑制）。

术语“变体”当在多核苷酸序列的背景中使用时，可涵盖与野生 型基因有关的多核苷酸序列。这一定义还可包括例如，“等位”、“剪 接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可具有与参考分子显著的同 一性，但由于在mRNA加工期间外显子的可变剪接通常将具有更大 数目或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可具有另外的功能结构域或 缺少结构域。物种变体是从一个物种到另一个物种不同的多核苷酸序 列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可来源于核 酸序列中至少一种突变，并可产生改变的mRNA或产生结构或功能 可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有零 种、一种或多种等位基因形式。产生变体的常见突变改变通常归因于 核苷酸的天然缺失、添加或取代。在给定序列中，这些类型改变的每 一种可单独发生，或联合其它类型改变发生一次或多次。

所得的多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态变 体是指定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体 还可涵盖“单核苷酸多态性”(SNP)或其中多核苷酸序列差异为一个 碱基的单碱基突变。SNP的存在可指示例如具有对疾病状态的倾向的 某一群体，所述倾向为与抗性相比较的易感性。

衍生物多核苷酸包括经受化学修饰，例如以烷基、酰基或氨基代 替氢的核酸。衍生物如，衍生物寡核苷酸，可包含非天然存在的部分， 诸如改变的糖部分或糖间键合。这些中示例的有硫代磷酸酯和本领域 已知的其它含硫物质。衍生物核酸还可包含标记，包括放射性核苷酸、 酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性粒 子等。

“衍生物”多肽或肽是通过例如糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、 硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶合或弱福尔马林处理而修饰的 多肽或肽。衍生物还可被直接或间接修饰以包含可检测的标记，包括 但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。

本文所用的术语“动物”或“患者”意为包括例如人、绵羊、麋 鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、 大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲。

“哺乳动物”涵盖通常处于医疗护理下的温血哺乳动物（如，人 和家养动物）。实例包括猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物 和人，以及仅仅人。

“治疗”或“处理”涵盖治疗哺乳动物的疾病状态，并包括：(a) 预防疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当所述哺乳动物倾向于疾病 状态但还未被诊断为患有其的时候；(b)抑制疾病状态，如，阻止其 发展；和/或(c)缓解疾病状态，如，导致疾病状态消退，直到达到期 望终点。治疗还包括疾病症状的改善（如，减轻疼痛或不适），其中 所述改善可以或可以不直接影响疾病（如，引起、传染、表达等）。

多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子

靶：在一个实施方案中，靶包括膜结合转录因子肽酶，位点1 (MBTPS1)的核酸序列，包括但不限于MBTPS1相关的有义和/或反义 的非编码和/或编码序列。

人位点1蛋白酶(S1P)，也常被称为MBTPS1或枯草杆菌蛋白酶 /kexin同工酶1(SKI-1)，是一种与膜结合枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨 酸蛋白酶，属于一组共9种哺乳动物前蛋白转化酶的成员。在这些蛋 白酶中，S1P通过表现出在非碱性氨基酸后优选的裂解而显示出唯一 的底物特异性。S1P在控制膜、细胞和血液胆固醇含量的蛋白水解途 径中发挥着关节作用。S1P是一种高尔基体蛋白酶，可介导固醇调节 元件结合蛋白(SREBP)1和2的前体的蛋白水解激活，它们是调节胆 固醇和脂质代谢中涉及到的多种基因的表达的两种转录因子。

可通过由利用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的 示例性膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)介导的疾病和病症包 括：与ER应激反应相关的疾病和病症、炎症性肠病（如结肠炎）、 代谢性疾病或病症、脂质代谢疾病或病症（如肥胖症、糖尿病、高胆 固醇血症、异常血脂症）、与固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的功能 受损相关的疾病或病症、心血管性疾病或病症、出血热（如克里米亚 -刚果出血热等）、肝脏疾病或病症、软骨内成骨疾病或病症（如软 骨发育异常、软骨细胞凋亡、胶原网络紊乱）。

在一个实施方案中，寡核苷酸对MBTPS1的多核苷酸具有特异 性，该多核苷酸包括但不限于非编码区。MBTPS1靶包括MBTPS1 的变体；MBTPS1的突变体，包括SNP；MBTPS1的非编码序列；等 位基因、片段等。优选地寡核苷酸是反义RNA分子。

根据本发明的实施方案，靶核酸分子不仅限于MBTPS1多核苷 酸，还延伸到MBTPS1的同种型、受体、同系物、非编码区等的任 一种。

在一个实施方案中，寡核苷酸靶向MBTPS1靶的天然反义序列 （与编码区和非编码区天然反义），包括但不限于其变体、等位基因、 同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地寡核苷酸是反义 RNA或DNA分子。

在一个实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括变体，其中在化 合物中一个或多个核苷酸位置存在不同碱基。例如，如果第一个核苷 酸是腺嘌呤，可产生在这一位置包含胸苷、鸟苷、胞苷或其它天然或 非天然核苷酸的变体。这可在反义化合物的任何位置进行。随后利用 本文所述的方法测定这些化合物以确定它们抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，反义化合物与靶之间的同源性、序列同一性 或互补性是从约50%至约60%。在一些实施方案中，同源性、序列 同一性或互补性是从约60%至约70%。在一些实施方案中，同源性、 序列同一性或互补性是从约70%至约80%。在一些实施方案中，同 源性、序列同一性或互补性是从约80%至约90%。在一些实施方案 中，同源性、序列同一性或互补性是约90%、约92%、约94%、约 95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而导致 活性的丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的 条件下存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的 非特异性结合。此类条件包括，即，在体内测定或治疗性治疗的情形 中的生理条件，和在体外测定的情形中进行测定的条件。

当反义化合物（无论是DNA、RNA、嵌合、取代的等）与靶DNA 或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能从而导致效用的 丧失时，该化合物是可特异性杂交的，且在期望特异性结合的条件下 （即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下，和在体外测 定的情形中进行测定的条件下）存在足够程度的互补性以避免反义化 合物与非靶序列的非特异性结合。

在一个实施方案中，MBTPS1的靶向，包括但不限于利用例如 PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列、一种或多种如SEQ ID NO:2 所列的序列等，将调节MBTPS1的表达或功能。在一个实施方案中， 与对照相比表达或功能被上调。在一个实施方案中，与对照相比表达 或功能被下调。

在一个实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO:3至6所列的 核酸序列，包括利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些 寡核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰 的键等。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯等。在一个实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明 的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物（或修饰的磷酸 基团）可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷 烃酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备、和将其向核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸的掺入本身是已知的，不必在此描述。

反义的特异性和灵敏性还由本领域技术人员利用以用于治疗用 途。反义寡核苷酸已在动物和人的疾病状态的治疗中用作治疗部分。 反义寡核苷酸已经安全且有效地施用于人，目前正在进行许多临床试 验。因此已经确定，寡核苷酸可以是有用的治疗模式，可被配置为可 用于治疗细胞、组织和动物，尤其是人的治疗方案。

在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物，尤其是寡核苷酸，结 合到靶核酸分子并调节靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰 的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重 要功能，例如，RNA向蛋白翻译位点置的移位，从RNA翻译蛋白， 剪接RNA以产生一种或多种mRNA物质，和可能由RNA参与或促 进的催化活性。取决于期望的功能，功能可被上调或抑制。

反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列 (EGS)寡核苷酸、可变剪接体、引物、探针、和与靶核酸的至少一部 分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以按单链、双链、部 分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的上下文中，将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多 步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待调节其功能的靶核酸。这种靶 核酸可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因（或从 基因转录的mRNA）、或来自感染物的核酸分子。在本发明中，靶核 酸编码膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)。

靶向过程通常还包括确定靶核酸中发生反义相互作用从而产生 期望作用如调节表达的至少一个靶区域、区段或位点。在本发明的上 下文中，术语“区域”定义为具有至少一个可鉴定结构、功能或特征 的靶核酸的一部分。靶核酸区域中是区段。“区段”被定义为靶核酸 中较小区域或区域的亚部分。本发明中使用的“位点”被定义为靶核 酸中的位置。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到膜结合转录因子肽酶， 位点1(MBTPS1)的天然反义序列，并调节MBTPS1(SEQ ID NO:1) 的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID NO:2至6。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到膜结合转录因子肽酶， 位点1(MBTPS1)多核苷酸的一个或多个区段，并调节MBTPS1的表 达和/或功能。区段包括MBTPS1的有义或反义多核苷酸的至少五个 连续核苷酸。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸对MBTPS1的天然反义序列 具有特异性，其中寡核苷酸对MBTPS1的天然反义序列的结合调节 MBTPS1的表达和/或功能。

在一个实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO:3至6 所列的序列、利用例如PCR、杂交等鉴定和扩展的反义序列。这些寡 核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长的片段、修饰的 键等。修饰的键或核苷酸间键合的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸 酯等。在一个实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可附加于本发明的 修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物（或修饰的磷酸酯 基团）可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷 烃酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备、和将其向核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸的掺入本身是已知的，不必在此描述。

因为如本领域已知，翻译起始密码子通常是5'-AUG（在转录的 mRNA分子中；在相应DNA分子中是5'-ATG），翻译起始密码子也 称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少 数基因具有RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子； 且5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻 译起始密码子”和“起始密码子”可涵盖许多密码子序列，尽管每种 情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸（真核细胞中）或甲酰甲硫氨酸 （原核细胞中）。真核基因和原核基因可具有两个或更多个替代性起 始密码子，其任何一个可在特定细胞类型或组织中或在一组特定条件 下优先地用于翻译起始。在本发明的上下文中，“起始密码子”和“翻 译起始密码子”是指体内用于起始由编码膜结合转录因子肽酶，位点 1(MBTPS1)的基因转录的mRNA的翻译的一种或多种密码子，而与 此类密码子的（多个）序列无关。基因的翻译终止密码子（或“终止 密码子”）可具有三种序列即，5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA之一（相 应的DNA序列分别是5'-TAA、5′-TAG和5'-TGA）。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指这种mRNA 或基因的一部分，涵盖以任一方向（即，5'或3'）从翻译起始密码子 的约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻 译终止密码子区”是指这种mRNA或基因的一部分，涵盖以任一方 向（即，5'或3'）从翻译终止密码子的约25至约50个连续核苷酸。 因此，“起始密码子区”（或“翻译起始密码子区”）和“终止密码 子区”（或“翻译终止密码子区”）都是可以本发明的反义化合物有 效地靶向的区域。

本领域已知的开放读码框(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码 子与翻译终止密码子之间的区域，也是可被有效地靶向的区域。在本 发明的上下文中，靶向的区域是涵盖基因开放读码框(ORF)的翻译起 始或终止密码子的基因内区域。

另一靶区域包括5′非翻译区(5'UTR)，本领域已知是指mRNA以 5'方向从翻译起始密码子的部分，因此包括mRNA的5′加帽位点与翻 译起始密码子之间的核苷酸（或基因上相应的核苷酸）。又一靶区域 包括3′非翻译区(3'UTR)，本领域已知是指mRNA以3'方向从翻译终 止密码子的部分，因此包括mRNA的翻译终止密码子与3'端之间的 核苷酸（或基因上相应的核苷酸）。mRNA的5'加帽位点包括经由 5'-5'三磷酸酯键合与mRNA的最5'残基连接的N7-甲基化鸟苷残基。 认为mRNA的5'加帽区包括5'加帽结构本身以及与加帽位点相邻的 前50个核苷酸。本发明的另一靶区域是5'加帽区。

尽管一些真核mRNA转录物被直接翻译，但是许多包含一个或 多个称为“内含子”的区域，在翻译前从转录物切除。剩余（和因此 被翻译的）区域称为“外显子”，剪接在一起以形成连续的mRNA 序列。在一个实施方案中，靶向剪接位点，即，内含子-外显子结点 或外显子-内含子结点在其中疾病中牵涉异常剪接的情形、或其中疾 病中牵涉特定剪接产物的过度产生的情形尤其有用。由于重排或缺失 的异常融合结点是靶位点的另一实施方案。由剪接来自不同基因来源 的两个（或更多个）mRNA的过程产生的mRNA转录物称为“融合 转录物”。利用靶向例如DNA或mRNA前体的反义化合物可有效地 靶向内含子。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码区和/ 或非编码区并调节靶分子的表达和/或功能。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸并调节 靶分子的表达和/或功能。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合有义多核苷酸并调节靶分 子的表达和/或功能。

可从DNA的相同基因组区域产生可变RNA转录物。这些可变 转录物通常称为“变体”。更具体地讲，“mRNA前体变体”是从相 同基因组DNA产生的转录物，在其起始或终止位置与从相同基因组 DNA产生的其它转录物不同，并包含内含子序列和外显子序列二者。

在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分后， mRNA前体变体产生更小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是 加工的mRNA前体变体，且每个独特的mRNA前体变体必定因为剪 接而产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体还称为“可变剪接变 体”。如果不进行mRNA前体变体的剪接，则mRNA前体变体与 mRNA变体相同。

变体可经由可变信号产生以起始或终止转录。MRNA前体和 mRNA可具备多于一个起始密码子或终止密码子。来源于使用可变起 始密码子的mRNA前体或mRNA的变体称为该mRNA前体或mRNA 的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的那些转录物称为该mRNA 前体或mRNA的“可变终止变体”。一种特殊类型的可变终止变体 是“多聚腺苷酸变体”，其中产生的多个转录物是由于通过转录机制 的“多聚腺苷酸终止信号”之一的可变选择所致，从而产生在独特多 聚腺苷酸位点上终止的转录物。在本发明的上下文中，本文所述的变 体类型也是靶核酸的实施方案。

靶核酸上与反义化合物杂交的位置被定义为活性反义化合物靶 向的靶区域的至少5-核苷酸长的部分。

尽管本文列出了某些示例性靶区段的具体序列，但是本领域技术 人员将理解，这些用于阐释和描述在本发明范围中的具体实施方案。 本领域普通技术人员通过考虑到本公开内容可容易地鉴定另外的靶 区段。

认为包括选自示例性优选的靶区段中的至少五个(5)连续核苷酸 的段的长度为5-100个核苷酸的靶区段也适合于靶向。

靶区段可包括含有从示例性优选的靶区段之一的5'-末端的至少 5个连续核苷酸的DNA或RNA序列（其余核苷酸为从靶区段5'-末 端的紧邻上游开始的相同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或 RNA包含约5至约100个核苷酸）。类似地优选的靶区段由包括从 示例性优选的靶区段之一的3'-末端的至少5个连续核苷酸的DNA或 RNA序列代表（其余核苷酸为从靶区段3'-末端的紧邻下游开始的相 同DNA或RNA的连续段并延伸直到DNA或RNA包含约5至约100 个核苷酸）。借助本文所示例的靶区段的本领域技术人员将能够鉴定 另外的优选的靶区段而不需过度试验。

一经鉴定出一个或多个靶区域、区段或位点后，就选择与靶足够 地互补，即，充分地并以足够特异性杂交的反义化合物，以获得期望 作用。

在本发明的实施方案中，寡核苷酸结合特定靶的反义链。寡核苷 酸长度为至少5个核苷酸并可被合成以使每个寡核苷酸靶向重叠序 列，从而寡核苷酸被合成以覆盖靶多核苷酸的整个长度。靶还包括编 码区以及非编码区。

在一个实施方案中，将反义寡核苷酸靶向特定核酸是优选的。将 反义化合物靶向特定核酸是多步骤的过程。该过程通常开始于鉴定待 调节其功能的核酸序列。这一核酸序列可以是例如其表达与特定病症 或疾病状态相关的细胞基因（或从基因转录的mRNA）、或非编码多 核苷酸，例如，非编码RNA (ncRNA)。

RNA可分为(1)翻译为蛋白的信使RNA(mRNA)，和(2)非蛋白编 码RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和包含高密度终 止密码子和缺少任何广泛“开放读码框”的其它转录单位(TU)。许多 ncRNA看起来是从蛋白编码基因座的3′非翻译区(3'UTR)中的起始位 点开始。ncRNA通常是罕见的，并且已被FANTOM协会测序的 ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。由于显而易见的原因， 大多数研究者集中于被加工并输出到细胞质的多腺苷酸化mRNA。最 近，已显示非多腺苷酸化的核RNA的组可能非常庞大，且许多此类 转录物来源于所谓的基因间区。ncRNA可调节基因表达的机制是通 过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可分组成(1) 顺式编码的RNA，其在相同遗传位置上被编码，但在针对RNA的相 对链上，它们作用于其靶并因此展示出与其靶的完美互补性，和(2) 反式编码的RNA，其在不同于它们所作用的RNA的染色体位置被编 码，并且通常不表现出与其靶的完美碱基-配对潜力。

不希望受限于理论，通过本文所述的反义寡核苷酸干扰反义多核 苷酸可改变相应有义信使RNA的表达。然而，这种调节可以是不一 致的（反义敲低导致信使RNA升高）或一致的（反义敲低导致相伴 的信使RNA减少）。在这些情形中，反义寡核苷酸可靶向于反义转 录物的重叠或非重叠部分，导致其敲低或隔离。编码以及非编码反义 可以相同方式靶向，并且任一种类能够调节相应的有义转录物–以一 致的或不一致的方式。鉴定针对靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可 基于反义RNA转录物被反义寡核苷酸的敲低或调节期望靶的任何其 它手段。

策略1：在不一致调节的情形下，敲低反义转录物升高常规（有 义）基因的表达。如果后一种基因编码已知或假定药物靶，则其反义 对应物的敲低能够可设想地模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。

策略2：在一致调节的情形下，可以协同地敲低反义转录物和有 义转录物二者，从而实现常规（有义）基因表达的协同减少。例如， 如果反义寡核苷酸用来实现敲低，则这一策略可用来施加靶向有义转 录物的一种反义寡核苷酸和靶向相应反义转录物的另一反义寡核苷 酸，或同时靶向重叠的有义转录物和反义转录物的单个有力地对称的 反义寡核苷酸。

根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序 列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化 合物诸如siRNA化合物、和与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功 能的其它寡聚化合物。因此，它们可以是DNA、RNA、DNA-样、 RNA-样、或其混合物，或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这 些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并可包含结构 元件，诸如内部凸起或末端凸起、错配或环。反义化合物以常规方式 线性地制备，但可被连接或以其它方式制备为环状和/或分支的。反 义化合物可包括构建体，例如，两条链杂交以形成完全或部分双链的 化合物，或具有足够自互补性的单链以允许杂交和形成完全或部分双 链的化合物。两条链可在内部被连接，留下自由的3'或5'末端，或可 被连接以形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含在5'或3'末端的 突出端，产生单链特征的延伸段。双链化合物任选地可包括在末端的 突出端。进一步的修饰可包括附加于末端之一、所选的核苷酸位置、 糖位置或核苷间键合之一的缀合物基团。或者，两条链可经由非核酸 部分或接头基团连接。当从仅一条链形成时，dsRNA可采取自互补 发夹型分子的形式，其与自身对折以形成双链体。因此，dsRNA可 以是完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞 系中稳定表达dsRNA发夹来实现，然而在一些实施方案中，基因表 达或功能被上调。当从两条链、或采取与自身对折以形成双链体的自 互补发夹型分子形式的单链形成时，两条链（或单链的双链体形成区） 是以沃森-克里克方式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统后，本发明的化合物就可引发一种或多种酶或结构 蛋白的作用以实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可经由基于占位性的 机制作用。通常，核酸（包括寡核苷酸）可描述为“DNA-样”（即， 通常具有一个或多个2'-脱氧糖，且通常具有T而不是U碱基）或 “RNA-样”（即，通常具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰的糖，且通 常具有U而不是T碱基）。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构， 最通常是A-和B-形式。通常认为，具有B-形式样结构的寡核苷酸是 “DNA-样”，且具有A-形式样结构的是“RNA-样”。在一些（嵌 合）实施方案中，反义化合物可包含A-形式区域和B-形式区域二者。

在一个实施方案中，期望寡核苷酸或反义化合物包括以下至少一 种：反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含修饰的键的反 义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微、干扰RNA (miRNA)；小、临时RNA(stRNA)；或短、发夹RNA(shRNA)；小 RNA-诱导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其组合。

dsRNA还可激活基因表达，这是已被称为“小RNA-诱导的基因 激活”或RNAa的机制。dsRNA靶向基因启动子诱导相关基因的有 效的转录激活。RNAa在人细胞中利用合成的dsRNA证实，称为“小 激活RNA”(saRNA)。目前未知RNAa在其它生物体中是否是保守的。

已发现小双链RNA(dsRNA)，诸如小干扰RNA(siRNA)和微 RNA(miRNA)是称为RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。 RNAi总是经由重建染色质导致基因沉默，从而阻遏转录，降解互补 mRNA，或阻断蛋白翻译。然而在以下实施例部分详细描述的情况中， 寡核苷酸显示出可增加膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)多核 苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA还可作为小激活RNA (saRNA)发挥作用。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序 列，saRNA将以称为dsRNA-诱导的转录激活(RNAa)的现象诱导靶基 因表达。

在进一步的实施方案中，本文鉴定的“优选的靶区段”可用于筛 选调节膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)多核苷酸的表达的另 外化合物。“调节剂”是减少或增加编码MBTPS1的核酸分子表达 的那些化合物，且包括与优选的靶区段互补的至少5-核苷酸部分。筛 选方法包括以下步骤：将编码MBTPS1的有义或天然反义多核苷酸 的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选调节剂接触，并选择减少 或增加编码MBTPS1多核苷酸的核酸分子，如SEQ ID NO:3至6的 表达的一种或多种候选调节剂。一旦显示一种或多种候选调节剂能够 调节（如，减少或增加）编码MBTPS1多核苷酸的核酸分子的表达， 调节剂随后就可用于MBTPS1多核苷酸功能的进一步研究性研究， 或用作根据本发明的研究剂、诊断剂或治疗剂。

靶向天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，MBTPS1基 因（如，检索号NM_003791）。在一个实施方案中，靶是MBTPS 1 基因的反义多核苷酸。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向 MBTPS1多核苷酸（如，检索号NM_003791）的有义和/或天然反义 序列、其变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段 和互补序列。优选地寡核苷酸是反义分子且靶包括反义和/或有义 MBTPS1多核苷酸的编码区和非编码区。

本发明优选的靶区段还可与本发明的其各自的互补反义化合物 组合形成稳定的双链（双链体）寡核苷酸。

在本领域中，此类双链寡核苷酸部分已显示经由反义机制调节靶 表达和调节翻译以及RNA加工。而且，可对双链部分进行化学修饰。 例如，此类双链部分已经显示通过双链体的反义链与靶典型杂交，从 而触发靶的酶促降解来抑制靶。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向膜结合转录因子肽酶，位 点1(MBTPS1)多核苷酸（如，检索号NM_003791）、其变体、等位 基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地 寡核苷酸是反义分子。

根据本发明的实施方案，靶核酸分子不仅仅限于MBTPS1，还延 伸到MBTPS1分子的同种型、受体、同系物等的任一种。

在一个实施方案中，寡核苷酸靶向MBTPS1多核苷酸的天然反 义序列例如如SEQ ID NO:2所列的多核苷酸，和其任何变体、等位 基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的 实例如SEQ ID NO:3至6所列。

在一个实施方案中，寡核苷酸与MBTPS1反义的核酸序列互补 或结合，包括但不限于与MBTPS1多核苷酸相关的非编码有义和/或 反义序列，并调节MBTPS1分子的表达和/或功能。

在一个实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO:2所列的MBTPS1 天然反义的核酸序列互补或结合，并调节MBTPS1分子的表达和/或 功能。

在一个实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:3至6的至少5 个连续核苷酸的序列，并调节MBTPS1分子的表达和/或功能。

多核苷酸靶包括MBTPS1，包括其家族成员、MBTPS1的变体； MBTPS1的突变体，包括SNP；MBTPS1的非编码序列；MBTPS1 的等位基因；物种变体、片段等。优选地寡核苷酸是反义分子。

在一个实施方案中，靶向MBTPS1多核苷酸的寡核苷酸包括： 反义RNA、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA (miRNA)；小、临时RNA(stRNA)；或短、发夹RNA(shRNA)；小 RNA诱导的基因激活(RNAa)；或小激活RNA(saRNA)。

在一个实施方案中，靶向膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1) 多核苷酸，如SEQ ID NO:2，将调节这些靶的表达或功能。在一个 实施方案中，与对照相比表达或功能被上调。在一个实施方案中，与 对照相比表达或功能被下调。

在一个实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID NO:3至6所列 的序列。这些寡核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸、更短或更长 片段、修饰的键等。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:3至6包括一种或多种LNA核 苷酸。

期望的靶核酸的调节可以本领域已知的多种方式进行。例如，反 义寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子（如，核酶）是能够催化多种 反应的一种或多种，包括以核苷酸碱基序列特异性方式重复地裂解其 它单独核酸分子的能力的核酸分子。此类酶促核酸分子可用于例如靶 向几乎任何RNA转录物。

由于其序列特异性，反式裂解酶促核酸分子显示出用作人类疾病 的治疗剂的前景(Usman & McSwiggen,(1995)Ann.Rep.Med.Chem. 30,285-294;Christoffersen and Marr,(1995)J.Med.Chem.38, 2023-2037)。可设计酶促核酸分子以裂解细胞RNA背景中的特异性 RNA靶。这种裂解事件使得mRNA无功能并消除从该RNA的蛋白 表达。以这种方式，可选择性地抑制与疾病状态相关的蛋白的合成。

通常，具有RNA裂解活性的酶促核酸通过首先结合靶RNA来 发挥作用。这种结合经由被保持在邻近用于裂解靶RNA的分子的酶 促部分处的酶促核酸的靶结合部分来进行。因此，酶促核酸首先识别 靶RNA并随后经由互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合到正确 位点，就酶促作用以切割靶RNA。对这种靶RNA的策略性裂解将破 坏其指导编码蛋白合成的能力。在酶促核酸已经结合和裂解其RNA 靶后，其从该RNA释放以搜寻另一个靶并可重复地结合和裂解新的 靶。

若干种方法如体外选择（进化）策略(Orgel,(1979)Proc.R.Soc. London,B 205,435)已经用于进化能够催化多种反应，诸如磷酸二酯 键合和酰胺键合的裂解和连接的新核酸催化剂。

对于催化活性最佳的核酶的开发将显著有助于为了调节基因表 达的目的采用RNA-裂解核酶的任何策略。例如，锤头核酶在饱和(10 mM)浓度的Mg2+辅因子存在下以约1min-1的催化速率(kcat)作用。 人工的“RNA连接酶”核酶已经显示以约100min-1的速率催化相应 的自修饰反应。此外，已知具有DNA制成的底物结合臂的某些修饰 的锤头核酶以接近100min-1的多倍周转率催化RNA裂解。最后， 用某些核苷酸类似物代替锤头的催化核心中的特定残基获得显示催 化速率改进多达10倍的修饰的核酶。这些发现证明，核酶可促进化 学转化，伴随催化速率显著大于大多数天然自裂解核酶体外展示的催 化速率。那么可能可优化某些自裂解核酶的结构以获得最大催化活 性，或可能可制备对于RNA磷酸二酯裂解展示显著更快速率的完全 新的RNA基序。

符合“锤头”模型的RNA催化剂对RNA底物的分子间裂解最 早在1987年显示(Uhlenbeck,O.C.(1987)Nature,328:596-600)。回收 RNA催化剂并与多种RNA分子反应，证实其真正是催化性的。

通过在催化性RNA中进行适当的碱基改变以保持与靶序列必需 的碱基配对，基于“锤头”基序设计的催化性RNA已用于裂解特定 靶序列。这已经允许使用催化性RNA来裂解特定靶序列并指示，按 照“锤头”模型设计的催化性RNA可能可体内裂解特异性底物RNA。

RNA干扰(RNAi)已经成为在哺乳动物和哺乳动物细胞中调节基 因表达的强有力工具。这一方法要求利用表达质粒或病毒和被加工为 siRNA的小发夹RNA的编码序列递送作为RNA本身或作为DNA的 小干扰RNA(siRNA)。这一系统使得能够有效地将siRNA前体转运 到它们在其中为活性的细胞质，并允许使用为了基因表达的受控型启 动子和组织特异性启动子。

在一个实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸(RNA) 和/或脱氧核糖核酸(DNA)，或其模拟物、嵌合体、类似物或同系物的 寡聚物或聚合物。这一术语包括由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷 间（主链）键构成的寡核苷酸以及具有类似地起作用的非天然存在的 部分的寡核苷酸。因为期望特性例如细胞摄取增强、对靶核酸的亲和 力增强和在核酸酶存在下的稳定性增强，此类修饰的或取代的寡核苷 酸通常比天然形式更有利。

根据本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸（如， RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同系物）、核酶、外部 指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi) 化合物诸如siRNA化合物、saRNA、aRNA和与靶核酸的至少一部分 杂交并调节其功能的其它寡聚化合物。因此，它们可以是DNA、RNA、 DNA-样、RNA-样或其混合物，或可以是一种或多种这些的模拟物。 这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并可包含结 构元件，诸如内部凸起或末端凸起、错配或环。常规线性地制备反义 化合物，但可被连接或以其它方式制备为环状和/或分支的。反义化 合物可包括构建体，例如，两条链杂交以形成完全或部分双链的化合 物，或具有足够自互补性的单链以允许杂交和形成完全或部分双链的 化合物。两条链可在内部被连接，留下自由的3'或5'末端，或可被连 接以形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含在5'或3'末端的突出 端，产生单链特征的延伸段。双链化合物任选地可包括在末端的突出 端。进一步的修饰可包括附加于末端之一、所选的核苷酸位置、糖位 置或核苷间键合之一的缀合物基团。或者，两条链可经由非核酸部分 或接头基团连接。当由仅一条链形成时，dsRNA可采取自互补发夹 型分子的形式，其与自身对折以形成双链体。因此，dsRNA可以是 完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中 稳定表达dsRNA发夹来实现。当由两条链、或采取与自身对折以形 成双链体的自互补发夹型分子形式的单链形成时，两条链（或单链的 双链体形成区）是以沃森-克里克方式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统中，本发明的化合物可引发一种或多种酶或结构蛋 白的作用以实现靶核酸的裂解或其它修饰，或可经由基于占位性的机 制发挥作用。通常，核酸（包括寡核苷酸）可描述为“DNA-样”（即， 通常具有一个或多个2'-脱氧糖，且通常具有T而不是U碱基）或 “RNA-样”（即，通常具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰的糖，且通 常具有U而不是T碱基）。核酸螺旋可采用多于一种类型的结构， 最通常是A-和B-形式。通常认为，具有B-形式样结构的寡核苷酸是 “DNA-样”，且具有A-形式样结构的是“RNA-样”。在一些（嵌 合）实施方案中，反义化合物可包含A-形式区域和B-形式区域二者。

根据本发明的反义化合物可包括长度为从约5至约80个核苷酸 （即，从约5至约80个连接的核苷）的反义部分。这是指反义化合 物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链反义化合物包括从 5至约80个核苷酸，且本发明的双链反义化合物（例如dsRNA）包 括长度为5至约80个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技 术人员将理解，这包括长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79或80个核苷酸、或其中的任何范围的反义部分。

在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为10至50个 核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解，这包括具有长度为 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸、或其中 的任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸长 度为15个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物具有长度为 12或13至30个核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解， 这包括具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸、或其中的任何范围的 反义部分的反义化合物。

在一个实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括变体，其中在该 化合物中一个或多个核苷酸位置存在不同碱基。例如，如果第一个核 苷酸是腺嘌呤，可产生在这一位置包含胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这 可在反义或dsRNA化合物的任何位置进行。随后利用本文所述的方 法测定这些化合物以确定它们抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，反义化合物与靶之间的同源性、序列同一性 或互补性是从约40%至约60%。在一些实施方案中，同源性、序列 同一性或互补性是从约60%至约70%。在一些实施方案中，同源性、 序列同一性或互补性是从约70%至约80%。在一些实施方案中，同 源性、序列同一性或互补性是从约80%至约90%。在一些实施方案 中，同源性、序列同一性或互补性是约90%、约92%、约94%、约 95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸，例如SEQ ID NO:2至6所 列的核酸分子，包括一种或多种取代或修饰。在一个实施方案中，核 苷酸是以锁核酸(LNA)取代的。

在一个实施方案中，寡核苷酸靶向与MBTPS1和如SEQ ID NO: 1和2所列的序列相关的编码和/或非编码序列的有义和/或反义核酸 分子的一个或多个区域。寡核苷酸还靶向于SEQ ID NO:1和2的重 叠区域。

本发明某些优选的寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的上下文 中，“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是包含两个或更多个化学上不同 区域的寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通 常包含赋予一种或多种有益特性（例如，核酸酶抗性增加、进入细胞 的摄取增加、对靶的结合亲和力增加）的修饰的核苷酸的至少一个区 域和为能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物的区域。 例如，RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内 切酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的裂解，从而大大增强 基因表达的反义调节的效力。因此，与杂交于相同靶区域的硫代磷酸 酯脱氧寡核苷酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时以较短寡核苷酸通常可 获得可比较的结果。RNA靶的裂解可常规地通过凝胶电泳来检测， 并且如果需要，通过本领域已知的相关核酸杂交技术来检测。在一个 实施方案中，嵌合寡核苷酸包括被修饰以增加靶结合亲和性的至少一 个区域和通常作用为RNA酶H底物的区域。寡核苷酸对其靶（在这 一情形中是编码ras的核酸）的亲和性常规地通过测量寡核苷酸/靶配 对的Tm来确定，Tm是寡核苷酸与靶解离的温度；通过分光光度法 检测解离。Tm越高，寡核苷酸对靶的亲和性越大。

本发明的嵌合反义化合物可形成为两种或更多种寡核苷酸、如上 所述的修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。 此类化合物在本领域中也已称为杂合体或gapmer。教导此类杂合体 结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,013,830； 5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133； 5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922，其每一个 通过引用并入本文。

在一个实施方案中，被修饰的寡核苷酸的区域包括在糖的2'位置 修饰的至少一个核苷酸，最优选地为2'-O烷基、2'-O-烷基-O-烷基或 2'-氟-修饰的核苷酸。在其它实施方案中，RNA修饰包括在RNA 3' 端的嘧啶、脱碱基残基或反向碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基和2'O- 甲基修饰。此类修饰常规地掺入寡核苷酸，这些寡核苷酸已经显示对 指定靶具有比2'-脱氧寡核苷酸更高的Tm（即，更高的靶结合亲和性）。 这种增加的亲和性的作用是大大增强基因表达的RNAi寡核苷酸抑 制。RNA酶H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切 酶；因此该酶的激活导致RNA靶的裂解，从而可大大增强RNAi抑 制的效力。RNA靶的裂解可常规地通过凝胶电泳来证实。在一个实 施方案中，嵌合寡核苷酸还被修饰以增强核酸酶抗性。细胞包含多种 可降解核酸的核酸外切酶和核酸内切酶。多种核苷酸和核苷修饰已经 显示使得掺入它们的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶消化更 耐受。核酸酶抗性常规地通过如下方式测量：培养寡核苷酸与细胞提 取物或分离的核酸酶溶液，并随着时间测量剩余的完整寡核苷酸的程 度，通常通过凝胶电泳测量。已被修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷 酸比未修饰的寡核苷酸保持完整更长时间。多种寡核苷酸修饰已被证 实增强或赋予核酸酶抗性。包含至少一种硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸 目前是更优选的。在一些情形中，增强靶结合亲和性的寡核苷酸修饰 也独立地能够增强核酸酶抗性。

预期用于本发明的一些优选寡核苷酸的具体实例包括含有修饰 的主链的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲基酯、短链烷基 或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂环糖间键合。最优选的是具有硫 代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，尤其是CH2 --NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2[称为亚甲基(甲基亚氨基)或 MMI主链]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2–N(CH3)--N(CH3)--CH2 和O--N(CH3)--CH2--CH2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为 O--P--O--CH。由De Mesmaeker等(1995)在Acc.Chem.Res.28:366-374 中公开的酰胺主链也是优选的。还优选的是具有吗啉代主链结构的寡 核苷酸（Summerton和Weller，美国专利号5,034,506）。在其它实施 方案中，诸如肽核酸(PNA)主链，寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺 主链代替，核苷酸被直接或间接地结合于聚酰胺主链的氮杂氮原子。 寡核苷酸还可包含一种或多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在2' 位置包含以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是1至约10； C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳 烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--、S--或N-烷基；O--、S--或 N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基； 杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA 裂解基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸药代动力学特性的 基团；或用于改善寡核苷酸药代动力学特性的基团、和具有类似特性 的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2 CH2 OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧乙基)]。其它优选的修饰包括2'-甲氧基 (2'-O--CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。还可在寡核 苷酸上的其它位置进行类似修饰，尤其是3'末端核苷酸上糖的3'位置 和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物诸如环丁基来 代替戊呋喃糖基。

寡核苷酸还可另外或替代性地包括核碱基（本领域中通常简称为 “碱基”）修饰或取代。本文所用的“未修饰”或“天然”核苷酸包 括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修 饰的核苷酸包括天然核酸中仅仅罕见或短暂出现的核苷酸，如，次黄 嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、尤其是5-甲基胞嘧啶（也称为5- 甲基-2'脱氧胞嘧啶，本领域中通常称为5-Me-C）、5-羟基甲基胞嘧 啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC、以及合成的核苷酸，如， 2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨烷 基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸 腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟 嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。可包括本领域中已 知的“通用”碱基，如，肌苷。5-Me-C取代已显示增加核酸双链体 的稳定性0.6-1.2℃，是目前优选的碱基取代。

本发明寡核苷酸的另一修饰包括向该寡核苷酸化学连接增强寡 核苷酸的活性或细胞摄取的一种或多种部分或缀合物。此类部分包括 但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、胆固醇基部分、脂肪族链如十二 烷二醇或十一烷基残基、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸。包含亲 脂部分的寡核苷酸和制备此类寡核苷酸的方法是本领域已知的，例如 美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。

指定寡核苷酸中的所有位置不一定一致地被修饰，并且事实上超 过一个上述修饰可被掺入单个寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸中的单 个核苷中。本发明还包括为上文定义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一实施方案中，本发明的核酸分子缀合于另一部分，所述另 一部分包括但不限于脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水 化合物、脂质或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到，这些分子可 在糖、碱基或磷酸酯基团上的多个位置连接于一种或多种任何核苷酸 （包括核酸分子）。

根据本发明使用的寡核苷酸可方便和常规地通过公知的固相合 成技术制备。用于这种合成的设备由包括Applied Biosystems在内的 几家供应商出售。还可采用用于这种合成的任何其它手段；寡核苷酸 的实际合成充分地在本领域普通技术人员的才能范围内。还公知的是 使用类似技术来制备其它寡核苷酸诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。 还公知的是使用类似技术和市售可获得的修饰的亚酰胺化物(amidite) 和可控孔度玻璃(CPG)产物诸如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修 饰的亚酰胺化物和/或CPG（可从Glen Research,Sterling VA获得） 来合成荧光标记的、生物素化的或其它修饰的寡核苷酸，诸如胆固醇 修饰的寡核苷酸。

根据本发明，使用修饰诸如使用LNA单体来增强寡核苷酸的效 力、特异性和作用持续时间并拓宽所述寡核苷酸施用途径，包括当前 化学形式，例如MOE、ANA、FANA、PS等的。这可通过以LNA 单体取代本发明寡核苷酸中的一些单体来实现。LNA修饰的寡核苷 酸可具有与母体化合物相似的大小，或可更大或优选地更小。优选地， 此类LNA-修饰的寡核苷酸包含少于约70%、更优选地少于约60%、 最优选地少于约50%的LNA单体，且其大小为约5至25个核苷酸， 更优选地为约12至20个核苷酸。

优选的修饰的寡核苷酸主链包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和 其它膦酸烷基酯（包括膦酸3′亚烷基酯和手性膦酸酯）、亚膦酸酯、 氨基磷酸酯（包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯）、硫羰 氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5' 键合的硼磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物、和具有倒转极性的那些， 其中相邻的核苷单元对是3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接的。还包括多 种盐、混合盐和游离酸形式。

教导以上含磷键合的制备的代表性美国专利包括但不限于美国 专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196； 5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131； 5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925； 5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799； 5,587,361和5,625,050，其每一个通过引用并入本文。

其中不含磷原子的优选修饰的寡核苷酸主链具有由短链烷基或 环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或一 种或多种短链杂原子或杂环核苷间键合形成的主链。这些包括具有吗 啉代键合（部分地由核苷的糖部分形成）的那些；硅氧烷主链；硫化 物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链；亚甲基甲 酰基和硫代甲酰基主链；含链烯的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚 胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺胺主链；酰胺主链；和具有混合 的N、O、S和CH2组成部分的其余主链。

教导以上寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专 利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033； 5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967； 5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289； 5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312； 5,633,360；5,677,437和5,677,439，其每一个通过引用并入本文。

在其它优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键合 二者即主链被新的基团代替。碱基单元被保留用于与适当的核酸靶化 合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已显示具有极佳的杂交特性的 寡核苷酸称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链 被包含酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链代替。核碱基被保留， 并直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合 物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082； 5,714,331和5,719,262，其每一个通过引用并入本文。PNA化合物的 进一步教导可见于Nielsen,等，(1991)Science 254,1497-1500。

在本发明的实施方案中，具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有 杂原子主链的寡核苷，尤其是-CH2-NH-O-CH2、称为亚甲基(甲基亚 氨基)或MMI主链的-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2、 -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2和-O-N(CH3)-CH2-CH2，其中天然磷酸 二酯主链表示为以上引用的美国专利号5,489,677的-O-P-O-CH2-、和 以上引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。还优选的是具有以上 引用的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸。

修饰的寡核苷酸还可包含一种或多种取代的糖部分。优选的寡核 苷酸在2'位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或 N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔 基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。尤 其优选的是O(CH2)n OmCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、 O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2nON(CH2)nCH3)2，其中n 和m可以为1至约10。其它优选的寡核苷酸包括在2'位置包括以下 之一：C至CO低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O- 烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、 SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳 基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、 报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药代动力学特性的基团、或用 于改善寡核苷酸药代动力学特性的基团、具有类似特性的其它取代 基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基（2'-O-CH2CH2OCH3，也称为 2'-O-(2-甲氧乙基)或2'-MOE）即，烷氧基烷氧基基团。另外优选的修 饰包括如在本文以下实施例中描述的2'-二甲基氨基氧乙氧基，即 O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，和2'-二甲基氨基乙氧 基乙氧基（本领域也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或 2'-DMAEOE），即，2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。

其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-O--CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-O CH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。还可在寡核苷酸上的其它位置进行 类似修饰，尤其是3'末端核苷酸或2'-5'连接的寡核苷酸上糖的3'位置 和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物诸如环丁基部 分来代替戊呋喃糖基糖。教导此类修饰的糖结构的制备的代表性美国 专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080； 5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134； 5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053； 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920，其每一个 通过引用并入本文。

寡核苷酸还可包括核碱基（本领域中通常简称为“碱基”）修饰 或取代。本文所用的“未修饰”或“天然”核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌 呤(A)和鸟嘌呤(G)、和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。 修饰的核苷酸包括其它合成的和天然核苷酸诸如5-甲基胞嘧啶 (5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺 嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙 基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5- 卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞 嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8- 氨基、8-硫氢基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、 5-卤代尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7- 甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮 鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

此外，核苷酸包括美国专利号3,687,808中公开的那些；“The  Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering（聚合物科学 和工程简明百科全书）”，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编著，John  Wiley & Sons，1990中公开的那些；Englisch等，"Angewandle Chemie, International Edition"，1991，30，第613页中公开的那些；以及Sanghvi, Y.S.，第15章，“Antisense Research and Applications（反义研究和 应用）”，第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，CRC Press， 1993中公开的那些。这些核苷酸的某些尤其有用于增加本发明寡聚 化合物的结合亲和性。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、N-2、 N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5- 丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示增加核酸双链体稳定性 0.6-1.2℃（Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，“Antisense  Research and Applications（反义研究和应用）”，CRC Press,Boca  Raton，1993，第276-278页），并且是目前优选的碱基取代，甚至 更尤其是当与2'-O甲氧乙基糖修饰组合时。

教导上述修饰的核苷酸以及其它修饰的核苷酸的制备的代表性 美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808、以及4,845,205； 5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187； 5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469； 5,596,091；5,614,617；5,750,692和5,681,941，其每一个通过引用并 入本文。

本发明寡核苷酸的另一修饰包括将寡核苷酸化学连接于增强寡 核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种部分或缀合物。

此类部分包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚， 如，己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固醇、脂肪族链，如，十二烷二醇 或十一烷基残基、磷脂，如，二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十 六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷 乙酸、棕榈酰基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分。

教导此类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限 于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313； 5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584； 5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439； 5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779； 4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013； 5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136； 5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873； 5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475； 5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481； 5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941， 其每一个通过引用并入本文。

药物发现：本发明的化合物还可应用于药物发现和靶确认领域。 本发明涵盖本文鉴定的化合物和优选的靶区段在药物发现尝试中使 用以阐明膜结合转录因子肽酶位点1(MBTPS1)多核苷酸与疾病状 态、表型、或疾况之间存在的关联。这些方法包括检测或调节MBTPS1 多核苷酸，包括将样品、组织、细胞或生物体与本发明的化合物接触， 在处理后某一时间测量MBTPS1多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相 关的表型或化学终点，和任选地将测量值与未处理样品或用本发明另 外化合物处理的样品比较。这些方法还可与其它实验平行或联合进 行，从而为靶确认方法确定未知基因的功能，或确定特定基因产物作 为治疗或预防特定疾病、疾患或表型的靶的有效性。

评价基因表达的上调或抑制：

外源核酸向宿主细胞或生物体中的转移可通过直接检测细胞或 生物体中该核酸的存在来评价。这种检测可通过本领域公知的多种方 法来实现。例如，外源核酸的存在可通过Southern印迹或利用特异性 地扩增与该核酸相关的核苷酸序列的引物通过聚合酶链式反应(PCR) 技术来检测。外源核酸的表达还可利用包括基因表达分析的常规方法 测量。例如，从外源核酸产生的mRNA可利用Northern印迹和逆转 录PCR(RT-PCR)来检测和定量。

来自外源核酸的RNA表达还可通过测量酶促活性或报告蛋白活 性来检测。例如，反义调节活性可间接地作为靶核酸表达的减少或增 加来测量，靶核酸表达的减少或增加作为外源核酸在产生效应RNA 的指示。基于序列保守性，可设计引物并用于扩增靶基因的编码区域。 最初，来自每个基因的最高度表达的编码区域可用于构建模式对照基 因，尽管可使用任何编码或非编码区域。通过在报告基因编码区域和 其poly(A)信号之间插入每个编码区域来组装每个对照基因。这些质 粒将产生报告基因在基因的上游部分且可能的RNAi靶在3′非编码区 域的mRNA。单独反义寡核苷酸的效果将通过报告基因的调节来测 定。可用于本发明方法的报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性 磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙 酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧 光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素 酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、和其衍生物。赋予 对氨苄西林、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林 可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四环素抗性的多种选择标记 是可得的。确定报告基因的调节的方法是本领域公知的，包括但不限 于荧光方法（如，荧光光谱学、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧光 显微镜检术）、抗生素抗性确定。

MBTPS1蛋白和mRNA表达可利用本领域技术人员已知和在本 文别处描述的方法来测定。例如，免疫测定诸如ELISA可用于测量 蛋白水平。MBTPS1 ELISA测定试剂盒是市售可获得的，如，从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得。

在实施方案中，利用本发明反义寡核苷酸处理的样品（如，体内 或体外的细胞或组织）中的MBTPS1表达（如，mRNA或蛋白）通 过与对照样品中的MBTPS1表达比较来评价。例如，蛋白或核酸的 表达可利用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样品中 的进行比较。或者，取决于期望的信息，可与以对照反义寡核苷酸（如， 具有改变的或不同序列的反义寡核苷酸）处理的样品进行比较。在另 一实施方案中，处理样品与未处理样品中MBTPS1蛋白或核酸的表 达差异可与处理样品与未处理样品中不同核酸（包括研究者认为适当 的任何标准，如，看家基因）的表达差异进行比较。

观察到的差异可如期望地表示，如，比率或分数的形式，用于与 对照比较。在一个实施方案中，以本发明反义寡核苷酸处理的样品中 MBTPS1 mRNA或蛋白的水平相对于未处理样品或以对照核酸处理 的样品增加或减少约1.25倍至约10倍或更多。在一个实施方案中， MBTPS1 mRNA或蛋白的水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3 倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至 少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5 倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少 约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、 至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、或至少约10倍或更多。

试剂盒、研究试剂、诊断和治疗

本发明的化合物可用于诊断、治疗和预防，和作为研究试剂和试 剂盒的成分。而且，能够以强烈特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸 通常被本领域技术人员用来阐明特定基因的功能或区分生物途径的 不同成员的功能。

对于在试剂盒和诊断和不同生物系统中使用，本发明的化合物， 单独或与其它化合物或治疗组合地，可用作差异和/或组合分析中的 工具来阐明细胞和组织中表达的基因的一部分或完全互补序列的表 达模式。

本文所用的术语“生物系统”或“系统”定义为表达或被使得能 够表达膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)基因产物的任何生物 体、细胞、细胞培养物或组织。这些包括但不限于人、转基因动物、 细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物和其组合。

作为一个非限制性实例，将以一种或多种反义化合物处理的细胞 或组织中的表达模式与未被反义化合物处理的对照细胞或组织比较， 并按照其属于所检查的基因的例如疾病关联、信号传导途径、细胞定 位、表达水平、大小、结构或功能分析所产生的模式的基因表达差异 水平。这些分析可对刺激或未刺激的细胞并在影响表达模式的其它化 合物存在或不存在下进行。

本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵 列、SAGE（基因表达系列分析）、READS（消化的cDNA的限制性 酶扩增）、TOGA（总基因表达分析）、蛋白阵列和蛋白质组学、表 达的序列标签(EST)测序、消减RNA指纹技术(SuRF)、消减克隆、差 异展示(DD)、比较基因组杂交、FISH（荧光原位杂交）技术和质谱 方法。

本发明的化合物可用于研究和诊断，因为这些化合物杂交于编码 膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)的核酸。例如，在本文公开 的此类条件下以这种效力杂交的为有效MBTPS1调节剂的寡核苷酸， 在有利基因扩增或检测的条件下分别是有效的引物或探针。这些引物 和探针可用于需要特异性检测编码MBTPS1的核酸分子的方法，以 及可用于扩增用于检测或用于进一步研究MBTPS1的所述核酸分子。 本发明的反义寡核苷酸，尤其是引物和探针与编码MBTPS1的核酸 的杂交可通过本领域已知的手段检测。此类手段可包括将酶缀合于寡 核苷酸、放射性标记寡核苷酸、或任何其它适当的检测手段。还可制 备利用此类检测手段来检测样品中MBTPS1水平的试剂盒。

本领域技术人员还将反义的特异性和灵敏性用于治疗用途。反义 化合物已经在动物包括人的疾病状态的治疗中用作治疗部分。反义寡 核苷酸药物已经安全且有效地施用于人，目前正在进行许多临床试 验。因此已经确定，反义化合物可以是有用的治疗形态，可被配置以 用于治疗细胞、组织和动物，尤其是人的治疗方案。

对于治疗，通过施用根据本发明的反义化合物来治疗怀疑具有可 通过调节MBTPS1多核苷酸的表达来治疗的疾病或病症的动物，优 选地人。例如，在一个非限制性实施方案中，方法包括向需要治疗的 动物施用治疗有效量的MBTPS1调节剂的步骤。本发明的MBTPS1 调节剂有效地调节MBTPS1的活性或调节MBTPS1蛋白的表达。在 一个实施方案中，与对照相比，动物中MBTPS1的活性或表达被抑 制约10%。优选地，动物中MBTPS1的活性或表达被抑制约30%。 更优选地，动物中MBTPS1的活性或表达被抑制50%或更多。因此， 与对照相比，寡聚化合物调节膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1) mRNA的表达至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。

在一个实施方案中，与对照相比，动物中膜结合转录因子肽酶， 位点1(MBTPS1)的活性或表达增加约10%。优选地，动物中MBTPS1 的活性或表达增加约30%。更优选地，动物中MBTPS1的活性或表 达增加50%或更多。因此，与对照相比，寡聚化合物调节MBTPS1 mRNA的表达至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。

例如，可测量动物的血清、血液、脂肪组织、肝脏或任何其它体 液、组织或器官中膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPS1)表达的减 少。优选地，被分析的所述体液、组织或器官中所含的细胞包含编码 MBTPS1肽和/或MBTPS1蛋白本身的核酸分子。

通过向适当的药学上可接受的稀释剂或载体加入有效量的本发 明化合物，本发明的化合物可以药物组合物利用。本发明的化合物和 方法的用途还可以是预防上有用的。

缀合物

本发明寡核苷酸的另一修饰包括将该寡核苷酸化学连接至增强 寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种部分或缀合物。 这些部分或缀合物可包括共价结合官能团诸如伯羟基或仲羟基基团 的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、聚胺、 聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药代动力学特性的基团、增强 寡聚物药代动力学特性的基团。典型缀合物基团包括胆固醇、脂质、 磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、 香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药代动力学特性的基团包 括改进摄取、增强对降解的抗性、和/或加强与靶核酸序列特异性杂 交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学特性的基团包括改 进本发明化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性缀合物基 团公开在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196 和美国专利号6,287,860中，其通过引用并入本文。缀合物部分包括 但不限于脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚，如，己基-5-三苯 甲基硫醇、硫胆固醇、脂肪族链，如，十二烷二醇或十一烷基残基、 磷脂，如，二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H 膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分、 或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可缀 合于活性药物物质例如阿斯匹林、华法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒 洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2,3,5- 三碘苯甲酸、氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂环庚三 烯、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药物、抗糖尿病药、抗 菌药或抗生素。

教导此类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限 于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313； 5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584； 5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439； 5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779； 4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013； 5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136； 5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873； 5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475； 5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481； 5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。

制剂

为了辅助摄取、分布和/或吸收，本发明的化合物还可与其它分 子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其它方式关联， 例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂。教导此 类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不 限于美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291； 5,543,165；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899； 5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633； 5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295； 5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756， 其每一个通过引用并入本文。

尽管反义寡核苷酸不必在载体的背景中施用以便调节靶表达和/ 或功能，但是本发明的实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载 体构建体，包括启动子、杂合体启动子基因序列，并具备强的组成型 启动子活性、或在期望情形中可被诱导的启动子活性。

在一个实施方案中，发明实践包括用适当的核酸递送系统施用上 述反义寡核苷酸中的至少一种。在一个实施方案中，该系统包括可操 作地连接于多核苷酸的非病毒载体。此类非病毒载体的实例包括单独 的寡核苷酸（如，SEQ ID NO:3至6的任何一种或多种）或与适当 的蛋白、多糖或脂质制剂结合的寡核苷酸。

另外适当的核酸递送系统包括病毒载体，通常序列来自以下的至 少一种：腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、辅助病毒依赖型腺病毒、 逆转录病毒、或日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合体。优选地，病毒载 体包括可操作地连接于多核苷酸的强的真核启动子，如巨细胞病毒 (CMV)启动子。

另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录 病毒载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选 的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因来自 HIV基因组且env基因来自另一病毒。DNA病毒载体是优选的。这 些载体包括痘病毒载体诸如正痘病毒或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体 诸如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

本发明的反义化合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的 盐、或当施用于包括人的动物时能够提供（直接或间接）生物活性代 谢物的任何其它化合物或其残留物。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理上和药学上 可接受的盐：即，保留母体化合物的期望生物活性且不对其赋予不期 望的毒物学作用的盐。对于寡核苷酸，药学上可接受的盐和其用途的 优选实例进一步描述于美国专利号6,287,860，其通过引用并入本文。

本发明还包括含有本发明反义化合物的药物组合物和制剂。取决 于期望局部还是系统治疗和待治疗的区域，本发明的药物组合物可以 多种方式施用。施用可以是局部的（包括眼睛和向粘膜，包括阴道和 直肠递送）、肺部，如，通过吸入或喷入粉末或气雾剂，包括通过喷 雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮、口服或肠胃外。肠胃外施用包括 静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，如鞘内 或心室内的施用。

对于治疗中枢神经系统中的组织，施用可通过如，注射或输注到 脑脊液中来进行。反义RNA向脑脊液的施用描述在如，美国专利申 请公布No.2007/0117772“Methods for slowing familial ALS disease  progression（减慢家族性ALS病进展的方法）”中，其通过引用整体 并入本文。

当预期本发明的反义寡核苷酸被施用于中枢神经系统中的细胞 时，可以能够促进本发明反义寡核苷酸跨越血脑屏障的渗透的一种或 多种试剂施用。注射可在如内嗅皮质或海马中进行。通过向肌肉组织 中的运动神经元施用腺病毒载体来递送神经营养因子描述在如，美国 专利号6,632,427“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into  medullary motor neurons（腺病毒载体介导的向脊髓运动神经元的基因 转移）”中，其通过引用并入本文。向脑如，纹状体、丘脑、海马或 黑质直接递送载体是本领域已知的，描述在如，美国专利号6,756,523 “Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain（用于向中枢神经系统尤其 是脑的细胞转移外来基因的腺病毒载体）”中，通过引用并入本文。 施用可以是快速的，如通过注射，或经一段时间进行，如通过缓慢输 注或施用缓释制剂。

本发明反义寡核苷酸可还连接或缀合于提供期望的药物或药代 动力学特性的试剂。例如，反义寡核苷酸可偶联于本领域已知的促进 跨血脑屏障渗透或运输的任何物质，诸如转铁蛋白受体的抗体，并通 过静脉内注射施用。反义化合物可连接于病毒载体例如使得反义化合 物更有效和/或增加反义化合物跨血脑屏障的运输的病毒载体。渗透 血脑屏障破坏还可通过如，输注以下物质来实现：糖，包括但不限于 赤藓糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌 醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯 糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、 D(-)核糖、侧金盏花醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩 藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖、或氨基酸 包括但不限于谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半 胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑 屏障渗透的方法和材料描述在，如，美国专利号4,866,042“Method for  the delivery of genetic material across the blood brain barrier（用于跨血 脑屏障递送遗传材料的方法）”，美国专利号6,294,520“Material for  passage through the blood-brain barrier（用于穿过血脑屏障的材料）” 和美国专利号6,936,589“Parenteral delivery systems（肠胃外递送系 统）”，都通过引用整体并入本文。

为了帮助摄取、分布和/或吸收，本发明反义化合物可与其它分 子、分子结构或化合物混合物例如脂质体、受体靶向分子、口服、直 肠、局部或其它制剂混合、包封、缀合或以其它方式关联。例如，阳 离子脂质可被包含在制剂中以促进寡核苷酸摄取。显示促进摄取的一 种这样的组合物是LIPOFECTIN（可从GIBCO-BRL,Bethesda,MD获 得）。

认为具有至少一种2'-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸尤其可用于口 服施用。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括经皮贴片、软膏、 洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载 体、水性、粉状、或油性基质、增稠剂等可以是必需或期望的。涂覆 的避孕套、手套等也是可用的。

可方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂，可按照制药工业 中公知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形 剂关联的步骤。通常，制剂通过以下制备：均匀且密切地将活性成分 与液态载体或磨碎的固态载体或二者关联，然后，如果需要，将产品 成型。

本发明的组合物可配制为任何的许多可能剂型，诸如但不限于片 剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明 的组合物还可配制为在含水、不含水或混合介质中的悬浮剂。含水悬 浮剂可进一步包含增加悬浮剂粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素 钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮剂还可包含稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液、泡沫剂和含脂质 体制剂。本发明的药物组合物和制剂可包含一种或多种渗透促进剂、 载体、赋形剂或其它活性或无活性配料。

乳剂通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散 在另一液体中的非均匀体系。除了分散相和可作为以水相、油相或本 身作为单独相的溶液存在的活性药物以外，乳剂可包含另外的成分。 包括微乳剂作为本发明的实施方案。乳剂和其用途是本领域公知的， 进一步描述在美国专利号6,287,860。

本发明的制剂包括脂质体制剂。本发明所用的术语“脂质体”是 指包括以一个或多个球形双层排列的两亲性脂质的囊泡。脂质体是单 层或多层囊泡，具有从亲脂性材料形成的膜和包含待递送的组合物的 含水内部。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，认为其与带负电荷的 DNA分子相互作用形成稳定复合体。认为pH-敏感或带负电荷的脂 质体捕获DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体二者已经 用于向细胞递送DNA。

脂质体还包括“空间上稳定的”脂质体，本文所用的该术语是指 包括一种或多种特化的脂质的脂质体。当被掺入脂质体时，这些特化 的脂质产生相对于松散这种特化脂质的脂质体具有增强的循环生命 周期的脂质体。空间上稳定的脂质体的实例是其中脂质体的形成囊泡 的脂质部分的部分包括一种或多种糖脂或以一种或多种亲水性聚合 物诸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂质体。脂质体和其用途进一步 描述在美国专利号6,287,860中。

本发明的药物制剂和组合物还可包含表面活性剂。表面活性剂在 药品、制剂和乳剂中的使用是本领域公知的。表面活性剂和其用途进 一步描述在美国专利号6,287,860中，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，本发明采用多种渗透促进剂来实现核酸尤其 是寡核苷酸的有效递送。除了帮助非亲脂性药物跨细胞膜的扩散，渗 透促进剂还增强亲脂性药物的渗透性。渗透促进剂可分为属于五个宽 的分类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆酸、螯合剂和非螯合非表 面活性剂。渗透促进剂和其用途进一步描述在美国专利号6,287,860 中，其通过引用并入本文。

本领域技术人员将认识到，制剂常规地根据其预期用途，即施用 途径来设计。

用于局部施用的优选的制剂包括其中本发明的寡核苷酸与局部 递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表 面活性剂混合的制剂。优选的脂质和脂质体包括中性（如，二油酰基 -磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷 脂酰胆碱）、阴性（如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG）和阳离子（如， 二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰乙醇胺 DOTMA）。

对于局部或其它施用，本发明的寡核苷酸可被脂质体封装或可与 其形成复合体，尤其是阳离子脂质体。或者，寡核苷酸可与脂质，尤 其是阳离子脂质复合。优选的脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐、和 其用途进一步描述在美国专利号6,287,860中。

用于口服施用的组合物和制剂包括粉末剂或颗粒剂、微颗粒、纳 米颗粒、水或非水介质中的悬浮剂或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、 片剂或小片剂。增稠剂、芳香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合 剂可以是期望的。优选的口服制剂是其中本发明的寡核苷酸连同一种 或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂一起施用的那些。优选的表 面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。优选的胆酸/ 盐和脂肪酸和其用途进一步描述在美国专利号6,287,860中，其通过 引用并入本文。还优选的是渗透促进剂的组合例如脂肪酸/盐以及胆 酸/盐。尤其优选的组合是月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。进一步的 渗透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本 发明的寡核苷酸可以包括喷雾干燥颗粒的粒状形式口服递送，或被复 合以形成微颗粒或纳米颗粒。寡核苷酸络合剂和其用途进一步描述在 美国专利号6,287,860中，其通过引用并入本文。

用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括还可包含 缓冲剂、稀释剂和其它适当的添加剂（诸如但不限于渗透促进剂、载 体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂）的无菌水溶液。

本发明的某些实施方案提供包含一种或多种寡聚化合物和通过 非反义机制起作用的一种或多种其它化疗剂的药物组合物。此类化疗 剂的实例包括但不限于癌症化疗药物诸如柔红霉素、道诺霉素、放线 菌素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷 酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙亚硝基脲、白消安、丝裂霉素 C、放线菌素D、光神霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达 卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁 酸氮芥、甲基环己亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、 6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧柯福霉素、4-羟 基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨 蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、 三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯 雌酚(DES)。当与本发明的化合物一起使用时，此类化疗剂可单独地 使用（如，5-FU和寡核苷酸），顺序地使用（如，5-FU和寡核苷酸 持续一段时间，随后是MTX和寡核苷酸），或联合一种或多种其它 此类化疗剂使用（如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放疗和寡 核苷酸）。包括但不限于非类固醇药物和皮质激素的抗炎药物，和抗 病毒药物，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、无环鸟苷和更昔洛韦， 也可组合在本发明的组合物中。反义化合物与其它非反义药物的组合 也在本发明的范围中。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序地使 用。

在另一相关实施方案中，本发明的组合物可包含靶向第一核酸的 一种或多种反义化合物，尤其是寡核苷酸，和靶向第二核酸靶的一种 或多种另外的反义化合物。例如，第一靶可以是膜结合转录因子肽酶， 位点1(MBTPS1)的特定反义序列，第二靶可以是来自另一核苷酸序 列的区域。或者，本发明的组合物可包含靶向同一膜结合转录因子肽 酶，位点1(MBTPS1)核酸靶的不同区域的两种或更多种反义化合物。 本文阐述了反义化合物的许多实例，其它的可变自本领域已知的适当 的化合物。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序地使用。

给药：

相信治疗性组合物的配制和其随后的施用（给药）在本领域技术 人员的能力范围内。给药依赖于待治疗的疾病状态的严重度和响应 性，治疗的时期持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的 减少。最佳给药计划可从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普 通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可 取决于单独寡核苷酸的相对效力而变化，通常可基于在有效的体外和 体内动物模型中有效的EC50来估算。通常，剂量是每kg体重从0.01 μg至100g，可每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2 至20年一次地提供。本领域普通技术人员可基于测量的药物在体液 或组织中的停留时间和浓度容易地估算重复率。在成功治疗之后，可 能期望对患者进行维持疗法以阻止疾病状态复发，其中寡核苷酸以维 持剂量施用，范围从每kg体重0.01μg至100g，每天一次或多次， 至每20年一次。

在一个实施方案中，患者以至少约1、至少约2、至少约3、至 少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少 约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、 至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约 80、至少约90或至少约100mg/kg体重的药物剂量治疗。反义寡核 苷酸的某些注射剂量描述于，如，美国专利号7,563,884“Antisense  modulation of PTP1B expression（PTP1B表达的反义调节）”，通过 引用整体并入本文。

尽管以上已经描述了本发明的各实施方案，但应理解的是，它们 仅以示例而非限制的方式呈现。可根据本公开内容对公开的实施方案 进行多种改变而不偏离本发明的主旨或范围。因此，本发明的宽度和 范围不应限于任何上述的实施方案。

本文提及的所有文件通过引用并入本文。本申请中提及的所有出 版物和专利文件为了所有目的通过引用并入本文，其程度如同每个单 独出版物或专利文件被单独地提及。通过在本文件中提及多个参考文 献，申请人不承认任何特定参考文献是本发明的"现有技术"。本发明 组合物和方法的实施方案在以下实施例中阐述。

实施例

以下非限制性实施例用于阐述本发明的选定实施方案。应理解的 是，所示组分的成分比例和其它选择方面的改变对于本领域技术人员 是明显的，并且在本发明实施方案范围中。

实施例1：对与膜结合转录因子肽酶，位点1(MBTPSl)反义的核 酸分子和或MBTPS1多核苷酸的有义链具有特异性的反义寡核苷酸 的设计

如上所述，术语“对…有特异性的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶” 是指具有(i)能够与靶向基因的一部分形成稳定双链体，或(ii)能够与 靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体的序列的寡核苷酸。

通过利用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性的区域的计 算机程序来便于选择适当的寡核苷酸。此类程序用来比较获得的核酸 序列，例如通过搜寻数据库诸如GenBank或通过对PCR产物测序。 比较来自一定物种范围的核酸序列允许选择在物种之间展示适当的 同一性程度的核酸序列。在未被测序的基因的情形中，进行Southern 印迹以允许确定靶物种与其它物种的基因之间的同一性程度。如本领 域所熟知的，通过以不同的严格性程度进行Southern印迹，可能获得 近似的同一性测量。这些方案允许选择展现与待控制的受治疗者中的 靶核酸序列的高程度互补性和与其它物种中的相应核酸序列的较低 程度互补性的寡核苷酸。本领域技术人员将认识到，在选择用于本发 明的基因的适当区域方面存在相当大的自由度。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能从而导致 功能和/或活性的调节时，该化合物是“可特异性杂交的”，且在期 望特异性结合的条件下（即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生 理条件下，和在体外测定的情形中进行测定的条件下）存在足够程度 的互补性以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。

本文所述寡核苷酸的杂交特性可通过本领域已知的一种或多种 体外测定确定。例如，本文所述寡核苷酸的特性可利用解链曲线测定 确定靶天然反义与可能的药物分子之间的结合强度来获得。

靶天然反义与可能的药物分子（分子）之间的结合强度可利用测 量分子间相互作用强度的任何已建立的方法例如解链曲线测定来估 算。

对于天然反义/分子复合体，解链曲线测定确定双链向单链构象 的快速转变发生的温度。这一温度被广泛接受作为两种分子之间相互 作用强度的可靠量度。

解链曲线测定可利用对应分子结合位点的实际天然反义RNA分 子或合成的DNA或RNA核苷酸的cDNA拷贝进行。多种包含所有 进行这一测定所必需的试剂的试剂盒是可获得的（如，Applied  Biosystems Inc.MeltDoctor试剂盒）。这些试剂盒包括含有双链DNA (dsDNA)结合染料之一（诸如ABI HRM染料,SYBR Green，SYTO等） 的适当的缓冲溶液。dsDNA染料的特性是使得它们在自由形式几乎 不发出荧光，但当结合dsDNA时是高度荧光的。

为了进行测定，将cDNA或相应的寡核苷酸与具体制造商的说明 书规定的浓度的分子混合。将混合物加热到95℃以使所有预形成的 dsDNA复合体解离，然后缓慢冷却到室温或试剂盒制造商规定的其 它较低温度以允许DNA分子退火。然后将新形成的复合体缓慢加热 到95℃，同时连续收集反应产生的荧光的量的数据。荧光强度与反 应中存在的dsDNA的量成反比。数据可利用与试剂盒相容的实时 PCR仪器（如ABI StepOne Plus实时PCR系统或LightTyper仪，Roche  Diagnostics,Lewes,UK）来收集。

利用适当的软件（例如LightTyper(Roche)或SDS Dissociation  Curve，ABI）将荧光相对于温度的负导函数（y轴上的-d(荧光)/dT)） 对温度(x轴)绘图来构造熔融峰。分析数据以确定dsDNA复合体向单 链分子快速转变的温度。这一温度称为Tm，与两种分子之间相互作 用的强度成正比。通常，Tm将超过40℃。

实施例2：MBTPS1多核苷酸的调节

以反义寡核苷酸处理HEPG2细胞

在37℃和5%CO2下，使来自ATCC的HepG2细胞（目录号 HB-8065）在生长培养基（MEM/EBSS（Hyclone目录号SH30024， 或Mediatech目录号10-010-CV）+10%FBS（Mediatech目录号 MT35-011-CV）+青霉素/链霉素（Mediatech目录号MT30-002-CI）） 中生长。在实验当天将6孔板中培养基改变为新鲜生长培养基。将所 有反义寡核苷酸稀释到20μM的浓度。将此溶液的2μl与400μ l Opti-MEM培养基（Gibco目录号31985-070）和4μl脂质体 (Lipofectamine)2000（Invitrogen目录号11668019）在室温一起培养 20min，然后施加到带有HEPG2细胞的6孔板的每个孔。将代替寡 核苷酸溶液的包含2μl水的类似混合物用于模拟转染的对照。在37 ℃和5%CO2培养3-18h后，将培养基改为新鲜生长培养基。加入反 义寡核苷酸48h后，去除培养基且利用来自Promega的SV总RNA 分离系统（目录号Z3105）或来自Qiagen的RNeasy总RNA分离试 剂盒（目录号74181）按照制造商的说明书从细胞提取RNA。将600 ng RNA加入到利用来自Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒（目 录号AB1453B）或高容量cDNA逆转录试剂盒（目录号4368813） 根据制造商说明书所述而进行的逆转录反应中。来自这一逆转录反应 的cDNA用于利用ABI Taqman基因表达混合物（目录号4369510） 和由ABI（Applied Biosystems Taqman基因表达测定： Hs00921626_m1，由Applied Biosystems Inc.,Foster City CA）设计的 引物/探针通过实时PCR监控基因表达。利用Mx4000热循环仪 (Stratagene)使用以下PCR循环：50℃持续2min、95℃持续10min、 40个循环的（95℃持续15秒、60℃持续1min）。以反义寡核苷酸 处理后的基因表达倍数变化基于处理样品和模拟转染样品之间18S- 标准化dCt值的差异来计算。

结果：实时PCR结果显示，用针对MBTPS1反义Hs.568369设 计的寡核苷酸之一处理后48h，HepG2细胞中MBTPS1mRNA的水 平显著增加。

尽管已经参照一种或多种实施方式对本发明进行了说明和描述， 但本领域技术人员在阅读和理解说明书和附图后将想到等价的改变 和修饰。此外，尽管本发明的特定特征可就多种实施方式之一而公开， 但此类特征可与其它实施方式的一种或多种其它特征组合，如对于任 何给定或特定应用可能是期望和有利的。

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