鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒

摘要

本发明涉及一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于：将待检血清用样品稀释液2倍稀释后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，用洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入结合单抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP结合物37℃作用1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入显色底物溶液，将底物A和底物B以1：1混合，100ul加入ELISA孔中，避光显色15min，加入50ul终止液，测其OD490值。该试剂盒方法技术成熟，重复性强，能够有效鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病抗体，一般研究人员即可完成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病的试剂盒，特别是涉及一种能够鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病的液相阻断ELISA制备方法，属于一种新的动物疫病诊断试剂，主要用于临床猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病、PRRS）与高致病性猪蓝耳病（HPRRS）的鉴别诊断及流行病学调查；应用于畜牧兽医学领域。

背景技术

猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。本病于1987年首先爆发于美国，随后迅速传到世界各地，现已成为危害规模化养猪生产的重要疫病之一。而2001年至今，我国每年都有部分地区不同程度的受到猪“高热病”的危害，经一系列的研究表明，引起“高热病”的最主要病原为变异的高致病性的PRRSV。仅根据临床症状和病变及流行病学特点很难做出诊断，因此PRRS的确诊需要借助实验室诊断技术，特别是新发生本病的地区和猪场。PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，单股正链有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径为45~65nm，含有20~35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕一脂质双层膜，表面有纤突，较小且不清楚。在我国分离的毒株属于美洲型，如VR2332株。经测序表明，与经典毒株相比，HPRRS病原的序列变化主要是在Nsp2区缺失了30个氨基酸，并且致死率明显高于经典毒株。可见，Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。

目前针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测主要采用的技术方法有：病毒分离、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、血清中和试验（SVN）、间接荧光抗体试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金技术、反转录、聚合酶链式反应（RT—PCR）、等。上述检测PRRSV抗体的技术多针对结构蛋白，而有关PRRSV非结构蛋白抗体的检测方法还未见报道，且不便于经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病的鉴别检测。这些限制了对猪蓝耳病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，基于二者差异，利用固相酶联免疫吸附试验（ELISA）原理，以经典PRRSV特有抗原为包被抗原，结合单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG及其他配套试剂组成。其反应机理为包被抗原和样品中抗经典PRRSV特有抗原的抗体结合导致单抗和抗原的结合量减少，通过酶标抗体形成“包被抗原+结合单抗+酶标抗体”复合物，加入显色剂，通过酶催化反应显色，显色深浅与样品中的检测抗体含量成反比。当抑制率高于设定的临界值时结果判为阳性，表明有抗经典PRRSV抗体存在。判定结果是这样设定的：抑制率PI=(OD_未抑制-OD_样品) /OD_未抑制*100%，PI>20%对应的样品为阳性，小于则为阴性。具有简单、快速、敏感和特异性好等特点；适用于临床鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病。

本发明的技术方案是这样实现的：一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG-HRP结合物、结合单抗、终止液、底物A  、底物B  、阳性样品、阴性样品、盖板膜组成，其特征在于：其中结合单抗为抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体2B9，其制备方法如下：首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白中30个氨基酸，而对高致病性PRRSV抗原无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性；

所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1h，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。

本发明的积极效果是

1、具有生物安全性，其所使用包被抗原为公司合成的经典猪蓝耳病 Nsp2蛋白特有的30个氨基酸，检测单抗2B9为小鼠诱生获得，不含PRRSV，因此不存在散毒的危险。

2、特异性强，检测抗体2B9为敏感性和特异性较好的单克隆抗体，因此提高了试剂盒的敏感性和特异性。

3、生产成本低，检测单抗可由相应的杂交瘤细胞系通过注射Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水，通过辛酸-硫酸铵纯化而大量获得。

4、能够良好鉴别经典PRRS与HPRRS，可用于猪场的净化，和流行病学调查。

附图说明

图1为本发明的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明：一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板1、样品稀释液2、20倍浓缩洗涤液3、羊抗小鼠IgG-HRP结合物4、结合单抗5、终止液6、底物A  7、底物B  8、阳性样品9、阴性样品10、盖板膜11组成，其特征在于：其中结合单抗为抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体2B9，其制备方法如下：首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白中30个氨基酸，而对高致病性PRRSV抗原无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性；

所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1h，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1  免疫原的制备　

猪蓝耳病Nsp2蛋白区30个氨基酸的缺失与否，是鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。本实验通过公司合成方法合成作为抗原的经典猪蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，并与BSA载体偶联，作为制备单克隆抗体的免疫原。

实施例2　抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体的制备

1、动物免疫  选择6－8周龄健康Balb/c小鼠，将弗氏完全佐剂乳化的免疫原，每只小鼠腹腔注射50μg左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化免疫原蛋白腹腔注射100μg，最后一次加强免疫时，直接腹腔注射100μg纯化的免疫原蛋白，融合前3～4d尾静脉注射50μg纯化的免疫原蛋白。

2、细胞融合  取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300g离心10min，弃去上清，振荡细胞，使两种细胞尽量混合均匀，然后45s内缓慢滴加预热的PEG溶液，再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置后再以1000 r/min离心10 min，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混匀，加入适量饲养细胞，于96孔培养板培养，第10d换液并开始检测筛选。

3、阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化  阳性克隆的筛选采用间接ELISA，用合成的抗原蛋白包被，并以骨髓瘤细胞上清作为阴性对照进行平行筛选。对所获阳性杂交瘤细胞的培养上清通过连续三次细胞克隆，最终获得一株杂交瘤细胞株2B9。

4、腹水的制备　0.5 mL的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，7d后注入10⁶个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，7～10 d后，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将收集好的腹水置37℃ 24h，随后置4℃过夜，第二天将腹水离心，上清56℃灭活30min即可。

5、单克隆抗体的纯化  用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4.5，缓慢滴加3.3%的正辛酸，搅拌30 min，离心取上清，加入1/10体积的10倍PBS，调至pH7.4，4℃预冷后，用45%饱和硫酸铵沉淀，离心后取沉淀，用PBS稀释后移入透析袋，在50倍体积PBS中透析，透析期间多次换液，透析结束后，紫外分光光度计280 nm测定蛋白浓度并分装冻存。

6、抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体的特性鉴定　

（1）腹水效价测定  间接ELISA方法测定，细胞培养上清与腹水分别从10倍和100倍开始做梯度稀释，同时分别以SP2/0细胞培养上清和腹水做同等稀释度作为阴性对照。通过检测得知2B9单抗的腹水效价为1×10⁶。

（2）抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体的Ig亚类鉴定  按鼠mAb Ig亚类检测试剂盒的说明书进行。具体方法是将纯化的单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100μL，37℃孵育1 h，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100μL，37℃孵育1 h，洗涤3遍。然后加入羊抗鼠IgG酶标二抗， 37℃孵育1 h，洗涤后加入底物显色，确定单克隆抗体的亚类分别为IgG2a。

（3）杂交瘤细胞株染色体的分析　采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果显示2B9杂交瘤细胞的染色体数目为101条。

（4）抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体特异性鉴定　将所获单克隆抗体分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流感病毒进行间接ELISA和HI试验，检测所得知制备的2B9单克隆抗体与其它病毒均无交叉反应性。

实施例3 阻断ELISA方法的建立

1．反应程序的建立

（1）间接ELISA程序：

包被：用pH9.6碳酸缓冲液将合成的PRRSV特有抗原稀释成0.2μg/孔，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃过夜。甩干包被液，PBST(含0.05%Tween-20的PBS，pH7.2)洗板3次。封闭：加入5%脱脂牛奶封闭液，300μL/孔，37℃60min，甩干，洗涤液洗涤3次，300μL/孔，3min/次。加样：加入抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单抗2B9，每孔100μL,37℃作用60 min；洗涤液洗涤5次，300μL/孔，3min/次。加入稀释5000倍的的羊抗鼠-HRP酶标二抗,每孔100μL，37℃作用45 min；甩去液体、洗板，加入TMB,每孔100μL，室温作用15 min；加入1 mol/L H₂SO₄ 50μL终止反应，测定OD490nm值。

（2）抗原最佳工作浓度的确定:

将合成的经典PRRSV特有抗原做倍比稀释，浓度分别为1.6ug/mL，0.8ug/mL，0.4ug/mL，0.2 ug/mL，0.1ug/mL，0.05 ug/mL，100ug/孔,4℃包被酶标板过夜。阴、阳性血清也同时做系列倍比稀释1：20，l：40，l：80，1：160，组成方阵，进行间接ELISA。各步37℃反应30 min，显色12～15 min后终止。在酶联检测仪上490 nm波长处测定样本OD值。选择阳性血清OD值在1左右且阳性OD值/阴性OD值(P/N)比值最大时的抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。确定最佳抗原包被浓度为0.7ug/mL。

2．阻断ELISA程序：

包被：用pH9.6碳酸缓冲液将合成的PRRSV特有抗原稀释成0.7μg/孔，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃过夜。甩干包被液，PBST(含0.05%Tween-20的PBS,pH7.2)洗板3次。封闭：加入5%脱脂牛奶封闭液，300μL/孔，37℃60min，甩干，洗涤液洗涤3次，300μL/孔，3min/次。加样1：加入被检的猪血清，每孔100μL,37℃作用45 min；甩去液体，洗涤液洗涤5次，300μL/孔，3min/次。加样2：加入抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单抗2B9，60000倍稀释，每孔100μL，37℃作用60 min；洗涤液洗涤5次，300μL/孔，3min/次。甩去液体、洗板，加入羊抗鼠-HRP酶标二抗,每孔100μL，37℃作用60 min;甩去液体、洗板，加入OPD，每孔100μL，室温作用15 min；加入1 mol/L H₂SO₄ 50μL终止反应，测定OD490nm值。

3.阻断ELISA最适反应条件的确定

（1）一抗、二抗最佳工作浓度的确定

用已确定的抗原最适工作浓度进行阻断ELISA，方阵滴定法测定PRRSV单克隆杭体的最佳工作浓度和酶标抗体的参考工作浓度。将结合单抗和酶标二抗作不同稀释度稀释，各步37℃反应60 min，显色12～15 min后终止。490 nm波长处测定样本OD值。选择OD值在1左右且阳性OD值/阴性OD值(P/N)比值最大时的一抗和二抗稀释度为最佳工作浓度。确定最佳一抗工作浓度为60000倍稀释，二抗为5000倍稀释。

（2）封闭液及作用时间的确定

用已确定的抗原、抗体及酶标二抗的最适工作浓度进行间接ELISA。分别用含2%脱脂奶粉的PBS、5%脱脂奶粉的PBS、10%血清、0.05%Tween-20的PBS作为反应的封闭液及抗体稀释液。37℃分别封闭30min、1h、2h。显色12-15 min后终止。490 nm波长处测定各样本OD值。比较各组的OD490值和P/N值，确定ELISA反应的最适封闭液及封闭时间。选择5%脱脂奶粉的PBS作用1h为最佳封闭液和作用时间。

（3）阻断ELISA敏感性试验

    判定标准的确定：取20份经IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测为PRRSV抗体阳性的猪血清，按1∶100稀释后进行间接阻断ELISA测定OD490nm值，规定以20份血清的平均OD490nm加3倍标准差作为阴阳性的临界值，计算其抑制率。结果显示抑制率大于20%为抗体阳性,抑制率小于20%为阴性作为判断标准。

（4）阻断ELISA特异性试验

    与患猪瘟、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪流感的病猪血清进行ELISA交叉检测。结果说明该阻断ELISA方法与这些抗病毒抗体无交叉反应。结果见表2。

（5）阻断ELISA可重复性性试验

取4块不同批次包被的酶标板，每个稀释度设4个重复，在同一块酶标板上进行批内重复，不同的酶标板之间进行批间重复，测定OD值，计算其变异系数，如果变异系数<10%则说明其重复性和稳定性很好。4个不同批次的酶标板，结果一致。说明检测方法的重复性较好。

实施例4 阻断ELISA试剂盒的组装

如图1所示将建立好的阻断ELISA方法中所用到的试剂盒材料：96孔ELISA板1、样品稀释液2、20倍浓缩洗涤液3、羊抗小鼠IgG-HRP结合物4、结合单抗5、终止液6、底物A7、底物B8、阳性样品9、阴性样品10、盖板膜11分别用相应的广口瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒，具体操作如下：

   96空ELISA板1：将合成的PRRSV特有抗原稀释到0.7ug/mL，每孔100ul包被ELISA板，37℃孵育1h，洗涤后加入5%脱脂奶粉的PBS封闭液，37℃封闭1h。洗涤后真空封装。

   样品稀释液2（PBST PH7.4）：NaCl 8.0g；KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9g；KCl 0.2g补加二馏水致1000ml；加入0.5ml Tween-20，最后50ml分装。

   20倍浓缩洗涤液3：NaCl 160.0g；KH₂PO₄ 4g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 58g；KCl 4g补加二馏水致1000ml；加入10ml Tween-20，最后50ml分装。

   羊抗小鼠IgG-HRP结合物4： 10ml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP二抗，然后加入4%PEG,25ml分装。

   结合单抗5：将纯化的抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单抗2B9 以60000倍稀释于PBS中加入4%PEG，25ml分装。

终止液6：2mol/L H₂SO₄  浓硫酸44.5ml，双蒸水355.5ml，10ml分装。

底物A7：TMB 200mg，无水乙醇100ml,加双蒸水至1000ml，10ml分装。

底物B8：（0.1ml/L柠檬酸-0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0-5.4）：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0-5.43，10ml分装。

阳性样品9：将标准PRRSV阳性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装。

阴性样品10：将经检测PRRSV阴性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装。

实施例5阻断ELISA试剂盒的保质期的确定

将组装好的阻断ELISA试剂盒4℃放置一个月、两个月、四个月、半年测定其特异性和敏感性。确定该试剂盒的保质期为3个月。