一种液相色谱-质谱法测定中药中邻苯二甲酸酯含量的方法

摘要

本发明公开一种液相色谱-质谱法测定中药中邻苯二甲酸酯类含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)对待测样品进行预处理；(2)通过液相色谱-质谱法测定经预处理后的样品中一种或多种邻苯二甲酸酯的含量。该测定方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于党参、白芍、赤芍、地黄等中药中邻苯二甲酸酯的多成分残留测定。

说明书

技术领域

本发明涉及中药中邻苯二甲酸酯含量的测定方法，具体涉及采用液相色谱-质谱法测定党参、白芍、赤芍、地黄等中药中邻苯二甲酸酯含量的方法。 

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)，是一类广泛应用的增塑剂，能起到软化作用，它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中。研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，可干扰内分泌，使男子精液量和精子数量减少，精子运动能力低下，精子形态异常，严重的会导致睾丸癌，是造成男子生殖问题的“罪魁祸首”。化妆品中的这种物质会通过女性的呼吸系统和皮肤进入体内，如果过多使用，会增加女性患乳腺癌的几率，还会危害到她们未来生育的男婴的生殖系统(参见沈霞红等，邻苯二甲酸酯类胚胎生殖毒性研究进展[J]，中国公共卫生，2010年9月，26(9)：1215)。 

鉴于邻苯二甲酸酯类成分的危害，各国政府对食品药品包装材料、玩具、化妆品中邻苯二甲酸酯的分布及检测予以极大关注，特别是欧盟及美国等发达国家，对此设定了严格的限量规定。欧盟颁布的关于邻苯二甲酸酯的指导标准(第2005/84/EC)，已于2007年1月16日起开始执行。2009年2月6日，美国消费品委员会发布指导性文件，要求自2009年2月10日起，儿童玩具或儿童护理用品中邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)等6种邻苯二甲酸酯的含量不得超过0.1％。我国在食品、化妆品、玩具、环境等介质中的邻苯二甲酸酯类检测已有报道，但尚无产品中邻苯二甲酸酯类成分的限量标准。 

中药材在种植加工过程中可能会被污染。因此，急需开发药品中邻苯二 甲酸酯类成分的高效分析测定方法。 

发明内容

本发明提供一种采用液相色谱-质谱测定中药中邻苯二甲酸酯含量的方法。该方法可用于中药中邻苯二甲酸酯残留的筛查，为拟定药品中邻苯二甲酸酯的标准提供技术服务。 

本发明通过如下技术方案实现： 

提供一种用于测定中药中邻苯二甲酸酯含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 

(1)对待测中药样品进行预处理； 

(2)通过液相色谱-质谱法测定经预处理后的样品中一种或多种邻苯二甲酸酯的含量。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述邻苯二甲酸酯包括邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述中药可以包括党参、白芍、赤芍和地黄等。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述样品的预处理包括用第一种溶剂超声或回流或索氏提取，然后旋转蒸发至干，再用第二种溶剂复溶的步骤。优选地，所述第一种溶剂可以选自正己烷、石油醚(60～90℃)或氯仿，特别优选正己烷；所述第二种溶剂可以选自甲醇、氯仿甲醇溶液(优选体积比3∶1)或正己烷，特别优选甲醇。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述超声提取的条件是：32～40kHz的超声频率下，温度25～45℃下水浴超声提取30～60min，优选在40kHz频率下，在30℃下水浴超声提取30min；回流提取的条件是：80～100℃回流提取1h～2h，优选在90℃回流提取1h；索氏提取的条件是：80～100℃索氏提取4～8h，优选在90℃提取6h。术语“索氏提取”指的是采用索氏提取器(250ml平底烧瓶，80ml抽出筒)，利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断 地被纯溶剂萃取。 

根据本发明的一个特别优选的实施方式，样品的预处理包括：精密称取中药样品粉末，精密加入正己烷，超声，滤过，精密量取续滤液旋转蒸发至干，精密加入甲醇使溶解，滤过。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-质谱法的色谱条件为：采用C 18柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲酸水溶液，B相为乙腈或甲醇，采用梯度洗脱。 

优选地，所述C18柱的粒径为1.7～5μm，柱内径2.1～4.6mm，柱长为5～25cm，更优选为Agilent ZORBAX SB-C18柱。A相的浓度为0％～0.1％，优选0.05％(体积)；A∶B体积比为50～2％∶50～98％，流速为0.3ml/min。 

根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-质谱法的质谱条件为：采用电喷雾离子源，采用正离子模式进行数据采集，毛细管电压2.5～4.0千伏、锥孔电压10～30伏，更优选为毛细管电压3.0千伏，锥孔电压15伏或20伏。 

本发明方法还包括用各种邻苯二甲酸酯的标准品绘制标准曲线，并由此计算样品中邻苯二甲酸酯的含量。 

本发明方法为首次应用于中药中邻苯二甲酸酯多成分残留的检测与分析。本发明方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于党参、白芍、赤芍、地黄或类似药材中邻苯二甲酸酯的多成分残留测定。 

本发明方法通过液相色谱-质谱对中药样品进行进样分析，检测中药中多种邻苯二甲酸酯的残留量，分析成本低、时间短，有较强的实用性。该方法对中药中邻苯二甲酸酯多成分残留的检测具有重要指导意义，对新药等关键技术有良好的指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。该方法可有效应用于国家标准的制订、企业新药的研发、企业现有产品质控方法的提升。 

附图说明

图1为正离子模式的混合标准品溶液的色谱图； 

图2为正离子模式的实施例1的党参样品溶液的色谱图。 

图3为正离子模式的实施例2的白芍样品溶液的色谱图。 

图4为正离子模式的实施例3的赤芍样品溶液的色谱图。 

图5为正离子模式的实施例4的地黄样品溶液的色谱图。 

图6为正离子模式的实施例5的党参样品溶液的色谱图。 

图7为正离子模式的实施例6的白芍样品溶液的色谱图。 

具体实施方式

实施例1 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，KQ-250DB型数控超声仪，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，正己烷分析纯。 

党参原药材：甘肃文县药材市场，批号：ds-080712。 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Agilent ZORBAX SB-C₁₈ column(3.0×150mm，3.5μm)；以0.05％甲酸为流动相A相，以100％乙腈为流动相B相，流速0.3ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表1-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表1-2。 

表1-2质谱参数表 

1.2.3标准溶液的制备 

精密称取邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品适量，加甲醇配制成1mg/mL的溶液，作为标准储备液。 

分别精密吸取上述储备液适量，用空白基质溶液稀释成下表所述浓度的系列标准溶液。 

表1-3系列标准溶液浓度表 

1.2.4供试品溶液的制备 

精密称取党参样品粉末(过40目筛)3g，置具塞三角烧瓶中，精密加入正己烷90ml，30℃水浴超声(250W，40kHz)提取30min，滤过，精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用甲醇溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

分别精密吸取上述各标准品溶液进样5μl，按照上述条件进样分析，绘制标准曲线。另精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

计算公式： 

$X=\frac{A\times 5\times 90}{50\times m}...\left(1\right)$

式中： 

X(ng/g)——试样中待测成分的含量； 

A(ng/mL)——供试品溶液中待测成分的浓度； 

m(g)——试样的质量。 

结果显示，党参样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为678ng/g。 

2.2线性关系 

精密吸取上述系列标准溶液各5μl，进样分析，记录各待测组分色谱峰面积，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归分析，结果(见表1-4)表明，各成分线性关系良好。 

表1-4回归方程和相关系数 

2.3检测限 

以信噪比为3∶1计算方法，标准溶液的检测限(见表1-5)。 

表1-5检测限 

2.4精密度试验 

取基质标准溶液6，连续进样3次，记录峰面积，结果表明，上述11种成分3次进样峰面积的RSD值在1.2％-5.1％范围内，精密度良好。 

实施例2 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，回流装置，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，正己烷分析纯。 

白芍饮片，购自亳州药材市场 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Waters BEH C₁₈ column(2.1×100mm，1.7μm)；以0.1％甲酸为流动相A相，以100％乙腈为流动相B相，流速0.45ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表2-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表2-2。 

表2-2质谱参数表 

1.2.3供试品溶液的制备 

精密称取白芍样品粉末(过40目筛)3g，置圆底烧瓶中，精密加入正己烷90ml，90℃热回流提取1h，滤过，精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用甲醇溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

结果显示，白芍样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为1212ng/g。 

实施例3 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，KQ-250DB数控超声仪(昆山超声仪器有限公司)，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，石油醚(60～90℃)、氯仿为分析纯。 

赤芍饮片，购自亳州药材市场 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Agilent ZORBAX SB C₁₈ column(4.6×250mm，5μm)；以0.5％甲酸为流动相A相，以100％乙腈为流动相B相，流速1.0ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表3-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表3-2。 

表3-2质谱参数表 

1.2.3供试品溶液的制备 

精密称取赤芍样品粉末(过40目筛)3g，置具塞三角烧瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)90ml，45℃水浴超声(250W，36kHz)提取1h，滤过， 精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用氯仿甲醇溶液(3∶1)溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

结果显示，赤芍样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为925ng/g。 

实施例4 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，索氏提取器(250ml烧瓶，80ml抽出筒)，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，正己烷、氯仿为分析纯。 

地黄饮片，购自济南百泉药材市场。 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Agilent ZORBAX SB-C₁₈ column(2.1×50mm，1.8μm)；以水为流动相A相，以100％甲醇为流动相B相，流速0.25ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表4-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表4-2。 

表4-2质谱参数表 

1.2.3供试品溶液的制备 

精密称取地黄样品粉末(过40目筛)3g，置具塞三角烧瓶中，精密加入正己烷90ml，100℃索氏提取4h，滤过，精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用氯仿甲醇溶液(1∶10)溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

结果显示，地黄样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为 607ng/g。 

实施例5 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，回流装置(250ml烧瓶)，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，正己烷分析纯。 

党参饮片，购自甘肃文县，批号：ds-080712。 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Agilent ZORBAX SB-C₁₈ column(3.0×150mm，3.5μm)；以0.05％甲酸为流动相A相，以100％乙腈为流动相B相，流速0.3ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表5-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表5-2。 

表5-2质谱参数表 

1.2.3供试品溶液的制备 

精密称取党参样品粉末(过40目筛)3g，置圆底烧瓶中，精密加入正己烷90ml，80℃热回流提取2h，滤过，精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用正己烷溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

结果显示，党参样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为664ng/g。 

实施例6 

1、材料与方法 

1.1主要仪器与试剂 

Waters ZQ单四极杆质谱仪(美国Waters公司)，ACQUITY Ultra Performance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，索氏提取器(250ml烧瓶，80ml抽出筒)，超纯水机(美国Millipore公司)。 

邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二正丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)标准品(百灵威科技有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，石油醚(60～90℃)分析纯。 

白芍饮片，购自亳州药材市场 

1.2实验方法 

1.2.1色谱条件 

Agilent ZORBAX SB-C₁₈ column(3.0×150mm，3.5μm)；以0.1％甲酸为流动相A相，以100％乙腈为流动相B相，流速0.3ml/min；按下表进行梯度洗脱： 

表2-1流动相梯度 

1.2.2质谱条件 

离子源为电喷雾离子化源ESI源；毛细管电压、锥孔电压等质谱参数见表6-2。 

表6-2质谱参数表 

1.2.3供试品溶液的制备 

精密称取白芍样品粉末(过40目筛)3g，置圆底烧瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)90ml，85℃索氏提取6h，滤过，精密量取续滤液50ml，置旋蒸瓶中40℃旋转蒸发至干，用甲醇溶解定容至5ml，滤过，即得。(注：实验过程避免接触塑料制品，以免污染)。 

2、结果 

2.1测定 

精密吸取供试品溶液5μl，按照上述条件进样分析，从标准曲线上读出相应的量，计算，即得。 

结果显示，白芍样品中检出上述邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)，含量为1242ng/g。