体外培养诱导淋巴细胞制备MHCⅡ类分子的方法及应用

摘要

本发明公开一种操作简单、成本低、产量高、原料用量少、避免产品携带外源病毒及其他病源微生物的体外培养诱导淋巴细胞制备MHCII类分子的方法，包括如下步骤：用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；对淋巴细胞单层进行传代培养；当传代淋巴细胞长成单层后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人参皂苷、美洲商陆及肿瘤刺激剂中的至少两种丝裂原诱导培养48小时，丝裂原加入量为5～10ug/mL；将细胞培养物经超声破碎后取样检测MHCⅡ类分子的浓度。所制备的MHCⅡ类分子，可在提高动物免疫力饲料添加剂中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种MHCⅡ类分子的生产方法，尤其是一种操作简单、成本低、产量高、原料用量少、避免产品携带外源病毒及其他病源微生物的体外培养诱导淋巴细胞制备MHCII类分子的方法及应用。

背景技术

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一个与机体免疫反应相关的基因群，该基因群有100多个基因位点，其编码产物包括MHCI类分子和MHCⅡ类分子，是一些能够提呈抗原的分子，在调节免疫应答和免疫细胞发育中发挥作用。MHCⅡ类分子是呈现在免疫系统特定细胞（APC）表面的由α链和β链非共价链相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白，可提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体，导致辅助性T细胞激活和分化，从而在诱发免疫应答中起重要的作用。如在一些病毒感染的疾病中，病毒的某些蛋白就是通过干扰MHCⅡ的功能，影响了正常的免疫识别。MHCⅡ类分子在抗原提呈过程中可介导APC的多条信号转导通路、凋亡等多种生物学行为，一些在正常情况下不表达MHCⅡ类分子的细胞，在生长过程中亦可受细胞因子等诱导表达MHCⅡ类分子，因此MHCⅡ类分子的表达被看成是抗原递呈能力的标志。

细胞因子（cytokine,CK）则是一类能在细胞间传递信息的蛋白质或小分子多肽，通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部以发挥广泛多样的生物学功能。免疫活性细胞产生的具有免疫调节和效应功能的细胞因子，以其多种多样的生物学活性，在体内构成功能性细胞因子网络，彼此协作或相互制约，对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用，有助于提高MHCⅡ类分子的免疫增效作用。

由于现有MHCII类分子的提取方法存在着操作复杂、原料来源较少、得率低、成本高以及潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险，很难实现产业化，迄今为止，未发现国内外关于MHCII类分子相关产品的报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低、产量高、原料用量少、避免产品携带外源病毒及其他病源微生物的体外培养诱导淋巴细胞制备MHCII类分子的方法及应用。

本发明技术解决方案是：一种体外培养诱导淋巴细胞制备MHCⅡ类分子的方法，其特征在于包括如下步骤：

a. 用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；

b. 对淋巴细胞单层进行传代培养；

c. 当传代淋巴细胞长成单层后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人参皂苷、美洲商陆及肿瘤刺激剂中的至少两种丝裂原诱导培养48小时，丝裂原加入量为5～10ug/mL；

d. 将细胞培养物经超声破碎后取样检测MHCⅡ类分子的浓度。

一种上述体外培养诱导淋巴细胞制备MHCⅡ类分子的方法制备的MHCⅡ类分子，其特征是在提高动物免疫力饲料添加剂中的应用。

本发明以较少的脾脏或外周血为原料，制备淋巴细胞单层，在体外培养、诱导淋巴细胞单层即可生产出大量的MHCII类分子，具有以下优点：

1. 无需进一步提纯，可以经过冻融、超声破碎、过滤处理后直接将产品饲料添加剂的形式以口服途径或作为疫苗稀释剂给动物使用，反应时间缩短，作用期限延长，使用量少，无种属特异性，即可起到免疫增效的作用效果，进而提升受体的免疫功能。

2. 生产工艺简单，原料用量少，无需宰杀大量的动物，即可生产出大量的产品，产量高且成本低，可以节省大量的人力、物力。

3. 可以避免产品中携带外源病毒及其他病原微生物。

4. 可多次传代培养生产MHCII类分子。

附图说明

图1是本发明实施例1新城疫抗体效价监测结果示意图。

图2是本发明实施例2新城疫抗体效价监测结果示意图。

图3是本发明实施例3新城疫抗体效价监测结果示意图。

具体实施方式

实施例1：

具体操作方法可以按以下步骤进行：

a．处理新鲜猪脾脏；

取新鲜猪脾脏，立即放入无菌烧杯中，加入平衡盐液浸泡半小时或浸于1%新洁尔灭溶液中，取出以碘酒酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用平衡盐液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成1mm³小块，再用平衡盐液洗涤2-3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；

b．消化及分散组织块；

将上步清洗过的平衡盐液吸掉，将剪碎的组织块移入三角烧瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25%胰蛋白酶液（PH7.6-7.8），置37℃水浴中消化30分钟，每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用平衡盐液洗涤3次，用0.5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的吸管吹打数次，用四层纱布过滤；

c.细胞计数；

采用标有0.1mm字样的血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数方法相同；

d.细胞悬液的分装和培养；

按细胞计数结果，将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液，将细胞悬液分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；

e．观察；

置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察，若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段（游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期），直至形成淋巴细胞单层；

f．对淋巴细胞单层进行传代培养；

g．当传代淋巴细胞长成单层后，进行诱导培养；

当显微镜下观察传代淋巴细胞长成单层后，加入溶解过滤后的刀豆蛋白A（Con A）、美洲商陆（PWM）和人参皂苷（GS）诱导培养，加入量分别是刀豆蛋白A（Con A）5ug/mL、美洲商陆（PWM）2ug/mL和人参皂苷（GS）1ug/mL；

h．诱导培养48小时后对产品进行检验；

将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例1所得培养物中MHCII类分子的含量为1000～2500ng/L；

MHCII类分子的含量测定：对MHCII类分子的定量多以多肽含量定量，利用紫外分光光度计或ELISA检测试剂盒进行测定多肽含量（以多肽含量1mg为一个单位）；

i．半成品和成品的检验。

半成品检验：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

成品检验：成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

实验例1：

临床实验具体操作方法按以下步骤进行：

a．新城疫（Clone30株）疫苗配制

取新城疫（Clone30株）疫苗，购自哈尔滨兽医研究所，按说明书的剂量配制，其中用量为50微升/羽。

b．实验分组免疫

将实验鸡群分为两组，对照组和实验组，均待鸡群母源抗体为零时进行免疫。对照组正常免疫新城疫（lasota 株）疫苗，滴鼻或滴口50微升/羽；实验组正常免疫新城疫（lasota 株）疫苗，滴鼻或滴口50微升/羽，同时口服本发明实施例1的培养物（做为饲料添加剂）100微升/羽。

c．新城疫抗体效价监测

检测方法按照国家高致病性新城疫诊断技术标准，进行微量血凝与血凝抑制试验。

d．检测结果如图1所示，说明本发明实施例1体外培养诱导淋巴细胞制备的MHCⅡ类分子做为饲料添加剂饲喂动物，具有显著的免疫增效作用。

实施例2：

a.以动物外周血为原料，按常规方法制备淋巴细胞单层。

具体方法是：无菌静脉采取动物全血30毫升，加入抗凝剂0.3毫升，分液漏斗中静置2-3小时左右，收集红细胞层以上的血浆，分装于消毒离心管内，用平衡盐液反复洗涤2-3次，离心速度800-1400转/分，然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养瓶或转瓶中，塞紧瓶塞，置37℃恒温箱中或转瓶机中培养，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。

b. 对淋巴细胞单层进行传代培养

在传代培养细胞前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定已生长成单层，即可进行细胞的传代培养。

c. 当传代淋巴细胞长成单层后，进行诱导培养。

当传代淋巴细胞长成单层后，加入溶解过滤后的刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、人参皂苷（GS）进行诱导培养。加入量分别是刀豆蛋白A（Con A）3ug/mL、脂多糖（LPS）1.0ug/mL、植物血凝素（PHA）0.5ug/mL和人参皂苷（GS）0.5ug/mL。

 d．诱导培养48小时后对产品进行检验；

将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例2所得培养物中MHCII类分子的含量为1000～2500ng/L。

MHCII类分子的含量、半成品和成品的检验项目均同实施例1，检验结果如下：

半成品检验：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

成品检验：成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

实验例2：

临床实验具体操作方法按以下步骤进行：

a．新城疫（lasota 株）疫苗配制

取新城疫（lasota 株）疫苗，购自辽阳益康生物制品有限公司，按说明书的剂量配制，其中用量为50微升/羽。

b．实验分组免疫

将实验鸡群分为两组，对照组和实验组，均待鸡群母源抗体为零时进行免疫。对照组正常免疫新城疫（lasota 株）疫苗，滴鼻或滴口50微升/羽；实验组正常免疫新城疫（lasota 株）疫苗，滴鼻或滴口50微升/羽，同时口服本发明实施例2细胞培养物（做为饲料添加剂）100微升/羽。

c．新城疫抗体效价监测

检测方法按照国家高致病性新城疫诊断技术标准，进行微量血凝与血凝抑制试验。

d．检测结果如图2所示，说明本发明实施例2体外培养诱导淋巴细胞制备的MHCⅡ类分子做为饲料添加剂饲喂动物，具有显著的免疫增效作用。

实施例3：

a.以动物外周血为原料，按常规方法制备淋巴细胞单层；

具体方法是：无菌静脉采取动物全血30毫升，加入抗凝剂0.3毫升，分液漏斗中静置2-3小时左右，收集红细胞层以上的血浆，分装于消毒离心管内，用平衡盐液反复洗涤2-3次，离心速度800-1400转/分，然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养瓶或转瓶中，塞紧瓶塞，置37℃恒温箱中或转瓶机中培养，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。

b. 对淋巴细胞单层进行传代培养

在传代培养细胞前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定已生长成单层，即可进行细胞的传代培养。

c. 当传代淋巴细胞长成单层后，进行诱导培养。

当传代淋巴细胞长成单层后，加入溶解过滤后的植物血凝素（PHA）、人参皂苷（GS）、美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂（PMA）进行诱导培养。加入量分别是植物血凝素（PHA）5ug/mL、人参皂苷（GS）2ug/mL、美洲商陆（PWM）1.5ug/mL和肿瘤刺激剂（PMA）1.5ug/mL。

d．诱导培养48小时后对产品进行检验；

将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例2所得培养物中MHCII类分子的含量为1000～2500ng/L。

MHCII类分子的含量、半成品和成品的检验项目均同实施例1，检验结果如下：

半成品检验：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

成品检验：成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。

实验例3：

临床实验具体操作方法按以下步骤进行：

a．禽流感H5N1（Re-5株）疫苗配制

取禽流感H5N1（Re-5株）疫苗，购自哈尔滨兽医研究所，按说明书的剂量使用，其中用量为50微升/羽。

b．实验分组免疫

将实验鸡群分为两组，对照组和实验组，均待鸡群母源抗体为零时进行免疫。对照组正常颈部注射免疫禽流感H5N1（Re-5株）疫苗， 500微升/羽；实验组正常颈部注射免疫禽流感H5N1（Re-5株）疫苗， 500微升/羽，同时口服本发明实施例3细胞培养物（做为饲料添加剂）100微升/羽。

c．禽流感H5N1（Re-5株）抗体效价监测

检测方法按照国家高致病性禽流感诊断技术标准，进行微量血凝与血凝抑制试验。

d．检测结果如图3所示，说明本发明实施例3体外培养诱导淋巴细胞制备的MHCⅡ类分子做为饲料添加剂饲喂动物，具有显著的免疫增效作用。

本发明实施例所用丝裂原来源如下：

刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、人参皂苷（GS）、美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂（PMA）均购自Sigma公司。