解淀粉芽孢杆菌株B-1619及其在防治茄科蔬菜土传病害中的应用

摘要

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌株B-1619及其在防治茄科蔬菜土传病害的应用，该菌株的保藏号为CGMCCNo.4671。应用时可以在播种前，将生防菌菌粉与覆盖土混合，播种后将含有生防菌的覆盖土覆盖在种子上；或分苗前，先将生防菌菌粉洒在土壤表面；或定植前，用稀释后的生防菌菌液对准备定植的茄科蔬菜苗，定植时用稀释后的生防菌菌液浇灌在茄科蔬菜植株的根部；或定植后定期用稀释后的生防菌菌液浇灌在茄科蔬菜植株的根部；或在茄科蔬菜从播种到收获全过程中各阶段应用方式的组合。

说明书

技术领域

本发明涉一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-1619菌株，及利用该菌株制备的生防菌剂和该菌剂的应用。属于利用有益微生物对设施茄科蔬菜进行生物防治的领域。

背景技术

设施蔬菜在我国农业及农村经济发展中的地位和作用越来越重要，已成为现代农业生产中的支柱产业和农民增收的主要途径。高产、连作的设施蔬菜种植布局导致设施蔬菜土传病害频繁暴发，加之目前的蔬菜基地多为传统稻麦土地改良而来，土壤泛碱严重，更加重了土传病害的流行为害。目前，生产上防治设施蔬菜土传病害主要依靠化学农药，但防治效果不理想，病害发生依然严重。同时化学防治易造成设施生态环境污染，增加蔬菜农产品有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。以宿迁市沭阳县华冲镇为例，该镇有种植番茄的历史，生产水平较高，建有设施番茄万亩标准化生产基地。但最近十年来，每年至少有70%的田块受到土传病害的困扰，在目前常用化学药剂防效不佳、无法解决设施番茄土传病害的情况下，该镇农户只能花大价钱租借邻村、镇的田块种植。而且土传病害病原菌存活期很久，需要间隔期长，一般需要5-8年。

为了解决蔬菜产量和质量之间矛盾，达到有效控制设施蔬菜土传病害、减少化学农药的使用量的目的，使用生物防治控制连作障碍的方法越来越受到各国政府和人民的关注，并初见成效。Silveria等学者研究发现：生防细菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）等3种芽孢杆菌对番茄青枯病有很好的防效，同时还可以提高番茄种子的发芽率。张力群等人研究结果表明：从小麦全蚀病自然衰退的土壤中分离获得一株荧光假单胞菌2P24，对由番茄青枯病也具有很好的防效，该菌株能产生2,4-DAPG、氢氰酸、嗜铁素以及蛋白酶等多种抗菌物质。Abyard等人将灰白链霉菌（Streptomycescanescens）等制成种衣剂处理番茄种子，结果发现可以有效防治由Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病。马利平等经过8年系统试验研究从330个细菌菌株中筛选出1株拮抗细菌98-1，可以有效防治由番茄枯萎病菌，经鉴定属蜡质芽孢杆菌。

芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的芽孢，所以是理想的生防菌筛选对象。许多性状优良的菌株已成功应用于植物病害的生物防治。芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际体表或体内与病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质以抑制病原菌生长、同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。目前利用解淀粉芽孢杆菌防治设施茄科蔬菜土传病害未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对设施蔬菜土传病害，尤其是设施茄科蔬菜枯萎病发生面积日益扩大，化学药剂防治除易造成环境污染外，防效也不理想的实际情况，提出一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株B-1619和粉剂制剂的制备方法及其在设施茄科蔬菜土传病害防治上的应用。

本发明的目的是这样实现的：一种解淀粉芽孢杆菌株B-1619（Bacillus amyloliquefaciens），其特征在于：保藏号为CGMCC No.4671。

一种上述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害的应用，其特征在于：播种前，将生防菌菌粉与覆盖土混合，播种后将含有生防菌的覆盖土覆盖在种子上；或分苗前，先将生防菌菌粉洒在土壤表面；或定植前，用稀释后的生防菌菌液对准备定植的茄科蔬菜苗，定植时用稀释后的生防菌菌液浇灌在茄科蔬菜植株的根部；或定植后定期用稀释后的生防菌菌液浇灌在茄科蔬菜植株的根部；或上述各阶段措施的组合。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：

在播种前，先将生防菌菌粉与覆盖土混合，播种后将含有生防菌的覆盖土覆盖在种子上，覆盖厚度为0.9~1.1cm，每平方米覆盖土中生防菌菌粉的含量为100-200克；

在分苗前，先将生防菌菌粉按100-200克/米²的比例洒在土壤表面，与表层土充分混合，再把茄科蔬菜苗移入土壤中；

在定植前，先把准备定植的茄科蔬菜苗在稀释50倍的生防菌菌液中蘸根2-3小时，在定植时用稀释50-100倍的生防菌菌液浇灌在茄科蔬菜植株的根部，每棵植株浇灌9—11毫升的稀释生防菌菌液；

在定植后，每隔9—12天用稀释100-200倍的生防菌菌液浇灌在植株的根部，每棵植株浇灌9—11毫升，直至茄科蔬菜收获。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：所述的生防菌菌液是将解淀粉芽孢杆菌株B-1619在YPGA斜面培养基上活化、移入YPG培养液中培养、通过发酵培养基发酵培养获得生防菌菌液，生防菌菌液的含菌量至少为10¹⁰cfu/mL，获得生防菌菌液的具体步骤是：

a)将解淀粉芽孢杆菌种B-1619移植到含有YPGA培养基的试管进行一环活化；

b)取一环活化后的菌种移入用1000ml三角瓶装的300mlYPG培养液中，在120转/min、28^oC下培养48小时，获得菌液；

c)将培养好的菌液按接种量1:300倍的比例接种于种子罐中的发酵培养基中发酵培养，种子罐的温度30~32^oC，发酵培养基的pH值7.0~7.2，接种菌液4小时后，每隔2小时对种子罐中的发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满，即将出现芽孢时，获得发酵菌种，种子罐中的发酵时间大约为12~16小时；

d)将发酵菌种按接种量1:10~20倍的比例接种于大型发酵罐中的发酵培养基中发酵培养，大型发酵罐的温度30~32^oC，发酵培养基的pH值7.0~7.2，接种发酵液菌体4小时后，每隔2小时对大型发酵罐进行发酵质量检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，当大型发酵罐中发酵液中的芽孢含量大于等于90％后，立即将发酵液出罐，进行分装，获得生防菌液；大型发酵罐中发酵时间为24~36小时。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：制备生防菌菌液涉及的YPGA培养基的配方为：酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g,琼脂17.0g，水1000ml，pH6.8-7.2；涉及的YPG培养液的配方为：胰蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，水1000ml，pH6.8-7.2；涉及的发酵培养基配方为：大豆粉1.0%，豆饼粉1.0%，淀粉0.5%，大米粉1.5%，酵母膏0.5%，玉米浆0.2%，鱼粉0.2%，NaCl 0.1%，CaHCO₃ 0.18%，余量为水，pH7.0~7.2。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：YPGA培养基是这样配制的：称取标准量的酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖和琼脂放入1000ml水中，加热溶化、充分混匀后将pH调整至6.8~7.2，冷却后封装到试管中，试管中的装量为试管的1/5~1/6，用塞子塞好试管口，121℃湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用；

涉及的PYG培养液是这样配制的：称取标准量的胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖放入1000ml中，充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，1000ml三角瓶中装量为1/3~1/4，用塞子塞好三角瓶口，121^oC湿热灭菌30分钟，冷却后备用；

涉及的发酵培养液是这样配制的：在种子罐或发酵罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆饼粉、大米粉、淀粉、酵母膏、玉米浆、鱼粉、NaCl、CaHCO₃放入发酵罐，充分搅拌，将发酵培养基pH调整到7.0~7.2，密封加料孔，用121^oC蒸汽灭菌2小时，冷却后立即接种。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：在制备生防菌剂的过程中，当培养好的菌液或发酵菌种在种子罐或发酵罐内发酵过程中出现泡沫且即将溢出时，应该加入消泡剂，所述消泡剂为有机硅，加入量以发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

在所述解淀粉芽孢杆菌株B-1619在防治茄科蔬菜土传病害中的应用中：所述的生防菌菌粉含菌量至少为4×10⁹cfu/mL；获得生防菌菌粉的具体步骤是：将经过发酵获得的含菌量为10¹⁰cfu/mL的生防菌菌液进行离心，弃上清液，取出沉淀物与碳酸氢钙进行吸附，充分搅拌混合，并通过气流粉碎机，使生防菌菌粉均匀、细致；其中，离心的条件为：7000r/min，10分钟，生防菌菌液和碳酸氢钙的重量比为1:2。。

本发明的优点在于：解淀粉芽孢杆菌株B-1619对茄科蔬菜土传病害有良好的防治效果，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；同时，通过在番茄、辣椒等茄科蔬菜育苗、分苗时菌粉拌土、或定殖和生长期通过菌液灌根等措施，操纵管理番茄、辣椒等植株根叶围生态环境中微生物群落的合理分布，恶化病原菌的生存环境，形成一个生物多样化的设施农作物生态系统，从而有效地、持久地控制茄科蔬菜土传病害的发生与流行。

具体实施方式：

实施例1

解淀粉芽孢杆菌B-1619菌株的分离和保藏

2008年12月，B-1619菌株是在宿迁地区的沭阳设施番茄大棚中、通过梯度稀释方法分离获得。（梯度稀释分离法：从沭阳设施番茄大棚中采集土壤，称取10g加入盛有90mL 灭菌水的三角瓶中，震荡培养30min（150r/min），制成1：10（土壤：水）的悬浮液，然后取悬浮液1mL 置于9mL无菌水中，制成10^-2稀释悬浮液，依次类推，制成10^-5，10^-6稀释悬液；在其中各吸取200μL，加到YPGA培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次。将上述培养皿，置于28℃恒温培养箱中培养1~2d。挑选单菌落转接到YPGA平板培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。）

分离、纯化获得的B-1619菌株在YPGA培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为园形，四周光滑，乳白色；革兰氏染色阳性；细胞形状为杆状，细胞直径大于1μm；不形成伴孢晶体；需氧生长；接触酶、氧化酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、脲酶、甲基红试验反应为阴性；VP试验、淀粉水解、硝酸盐还原、分解酪素为阳性；能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖，甘露糖，乳糖和柠檬酸盐；发酵葡萄糖不产气。在50^oC时不能生长；pH5.7、7%NaCl时能够生长。16SrRNA基因序列为：

该菌株于2011年3月15日保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（100101），保藏号为CGMCC No.4671。该菌株命名为B-1619，分类命名：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌B-1619生防菌菌液的制备

1、解淀粉芽孢杆菌B-1619生防菌菌种的制备

菌种活化：将冻干保藏的B-1619菌种移植到YPGA培养基，28^oC下培养48小时。

YPGA培养基的配制：称取酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g；葡萄糖5.0g, 琼脂17.0g；放入1000ml水中，加热、充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，适当冷却后封装到试管中，装量为试管的1/5-1/6，用塞子塞好试管口，121^oC湿热灭菌30分钟，趁热取出试管摆好斜面至冷却后备用。 

发酵菌种的制备：取一环活化后的B-1619菌移入用1000ml三角瓶装的300mlYPG培养液中，在150转/min、28^oC下培养48小时后，培养液中的菌含量可达到10^9-10cfu/ml。

YPG培养液的配制：称取胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，放入1000ml中，充分混匀后将pH调整至6.8-7.2，1000三角瓶中装量为300ml培养液，用塞子塞好三角瓶口，121^oC湿热灭菌30分钟，冷却后备用。

、解淀粉芽孢杆菌B-1619菌液的发酵程序与质量控制

发酵程序：

将培养好的发酵菌种移入种子罐进行发酵培养，首先在种子罐中发酵时间为12~16小时，移入发酵菌种4小时后，每隔2小时对发酵菌液进行发酵质量检测，当发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，立即将种子罐中的发酵液转入大型发酵罐进行发酵培养，在大型发酵罐中发酵时间为24~36小时，移入发酵菌液4小时后，每隔2小时对发酵菌液进行发酵质量检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，泡沫较多时可适量加入消泡剂。当大型发酵罐中发酵液中的芽孢含量大于等于90％后，立即将发酵液出罐，进行分装，获得生防菌菌液，生防菌菌液的含菌量至少为10¹⁰cfu/mL。。

上述种子罐和发酵罐中培养液的配制：在发酵罐中加入所需的吨位的水，按大豆粉1.0%，豆饼粉1.0%，淀粉0.5%，大米粉1.5%，酵母膏0.5%，玉米浆0.2%，鱼粉0.2%，NaCl 0.1%，CaHCO₃ 0.18%的比例放入发酵罐，充分搅拌，将发酵培养基pH调整到7.2，密封加料孔，用高温蒸汽灭菌2小时，冷却后立即加入发酵菌种进行发酵。

在制备生防菌剂的过程中，当培养好的菌液或发酵菌种在种子罐或发酵罐内发酵过程中出现泡沫且即将溢出时，应该加入消泡剂，所述消泡剂为有机硅，加入量以发酵罐中的泡沫不溢出为准；发酵罐发酵完成后，在发酵罐中加入占罐中液体总体积万分之二的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，再出罐进行分装。

发酵质量控制检测方法：

通过发酵罐的取样口获取发酵液50~100ml，用接种环挑取数环发酵液于洁净的载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。用番红染液染色2~3分钟，用缓流水冲洗，直至流出的水无红色为止，然后用滤纸吸干载玻片上的水迹。用物镜（油镜100倍）×目镜（10倍）观察。观察完后用香柏油擦干净镜头，在载玻片上注明镜检时间。镜检的玻片一直保留到发酵全过程结束时一并处理。

上述检测方法用于：1）检测发酵液是否被污染：解淀粉芽孢为杆状（刚接种阶段为由短杆状的菌体连接成线形）菌体。如镜检发现在发酵液中有小球形、椭圆形或其它形状的菌体，表明发酵液被污染了。2）观察解淀粉芽孢杆菌的生长状况：刚接种阶段（1~4小时），解淀粉芽孢杆菌为由短杆状的菌体连接成线形菌体；在生长条件适宜、营养充足的状况下，解淀粉芽孢杆菌繁殖很快，数量迅速增加，菌体为短杆状；在发酵后期，营养条件不能满足菌体快速繁殖的需求，菌体数量增加停止，并形成着生在菌体两端的长圆形芽孢。当有芽孢的菌体超过90％，即可终止发酵，迅速将发酵液下罐，传送到储存罐中。3）估计发酵液中的菌体数量：首先用发酵液稀释平板菌落计数的方法建立显微镜（物镜100倍×目镜10倍）观察到的菌体数量和发酵液中菌体数量之间关系的标准曲线。然后根据在显微镜下观察到的菌体数量，估算出发酵液中菌体数量。

实施例3、

解淀粉芽孢杆菌B-1619生防菌菌粉的制备

将实施例2经过发酵获得的含菌量为10¹⁰cfu/mL的生防菌菌液进行离心，弃上清液，取出沉淀物与碳酸氢钙进行吸附，充分搅拌混合，并通过气流粉碎机，使生防菌菌粉均匀，形成解淀粉芽孢杆菌B-1619生防菌菌粉；其中，离心的条件为：7000r/min，10分钟，生防菌菌液和碳酸氢钙的重量比为1:2。

所述的生防菌菌粉含菌量至少为4×10⁹cfu/mL。

实例4

解淀粉芽孢杆菌B-1619防治设施番茄、辣椒土传病害田间使用方法。

育苗播种前1天番茄、辣椒在温汤（45^OC-55^OC）浸种4-6小时；播种前给苗床上透肥水，播种后在苗床上覆盖1cm厚的土，覆盖的土是生防菌菌粉按100-200克/米²的比例和土均匀混合的。

分苗是在播种后40天左右。先将生防菌菌粉按100-200克/米²的比例洒在土壤表面，与表层土充分混合，再把番茄、辣椒苗移入土壤中。

定植是在分苗后40天左右。先将生防菌菌液稀释50倍，把要定植的番茄、辣椒苗浸泡在稀释后的生防菌菌液中2-3小时，定植后用稀释50-100倍的生防菌菌液浇灌在植株的根部，每棵植株浇灌10毫升左右稀释的生防菌菌液。

定植以后，每隔10天左右用稀释100-200倍的生防菌菌液浇灌在植株的根部，每棵植株浇灌10毫升左右稀释的生防菌菌液，直至番茄、辣椒开始收获。

本实施例使用的生防菌菌粉源于实施例3，使用的生防菌菌液源于实施例2。

实例5

解淀粉芽孢杆菌B-1619防治番茄、辣椒土传病害的效果

2011年10月-2012年5月，在沭阳县华冲镇大尖村示范试验8个大棚，设施大棚试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌B-1619对设施蔬菜土传病害的防治效果明显好于常规的化学药剂（多菌灵+辛硫磷）的防治效果。

实例6

解淀粉芽孢杆菌B-1619发酵菌液的毒性测定结果

使用健康的大鼠20只，体重180-200g，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2^oC，相对湿度40-70％。大鼠禁食过夜后，以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用解淀粉芽孢杆菌B-1619发酵菌液经口一次灌胃，容量为10ml/kg.b.wt.，灌胃后4小时给食，观察期2周。雌雄大鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠急性经口LD₅₀值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：解淀粉芽孢杆菌B-1619发酵菌液属微毒级。

使用健康的大鼠20只，体重200-300克，雌雄各半。试验条件：环境温度22±2^oC，相对湿度40-70％。试验前24小时剪毛备皮，面积为体表面积的10％。以5000mg/kg.b.wt.的剂量使用解淀粉芽孢杆菌B-1619发酵菌液直接均匀涂于备皮区内，4小时后用温水轻轻洗去残余，观察期2周。雌雄大鼠涂皮后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。雌雄大鼠经皮LD₅₀ 值均大于5000mg/kg.b.wt.。可见：解淀粉芽孢杆菌B-1619发酵菌液属微毒级。