加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法

摘要

本发明涉及加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。该方法包括以下操作步骤：1.菌株活化，2.一级种子培养，3.二级种子培养，4.发酵培养，得到加拿大一枝黄花内生真菌发酵液，发酵液为褐色；加拿大一枝黄花内生真菌发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液。本发明明确了具有广谱抗菌活性的球毛壳菌yt03（

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵培养方法，具体涉及加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。 

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们越来越关注环境污染，生态平衡和人类健康等问题。尤其是对食品品质要求也越来越高。无公害蔬菜和绿色食品，已经得到全社会的公认。开发和利用生物农药，开展生物防治，势在必行。当前，微生物农药在开展生物防治中将大显身手。因为它具有明显优点:对环境安全，无公害，无残留，不易产生抗性，生产成本低，发酵工艺简单，对非靶标生物安全。 

作为微生物农药来源之一的植物内生真菌(Endophytic fungi)在宿主植物长期相互作用、协同进化、互相适应过程中，在植物体内维持了微生态系统平衡。同时，为了保持这种平衡，植物内生真菌可能产生与其周边环境（即宿主植物）相似或相同作用的次生代谢产物。因此，可以认为植物内生真菌的次生代谢产物可以替代宿主植物的代谢产物，进而作为新化合物、新药物筛选的潜在或替代资源，从而可以有效降低新药物或其它用途活性物质的研发成本。 

加拿大一枝黄花（Solidgo canadensis）作为一种外来物种，繁殖力极强，传播速度快，生长优势明显，生态适应性广阔，与周围植物争阳光、争肥料，直至其它植物死亡，从而对生物多样性构成严重威胁。加拿大一枝黄花可做观赏切花、饲料、蜜源，同时可用于天然色素的生产和提炼精油。目前, 已经发现加拿大一枝黄花体内具有较强的抗氧化、自由基消除活性和多种抑菌活性的黄酮类成分。此外还有报道加拿大一枝黄花的植物浸提液对许多杂草（如光头稗和大狗尾草）及多种蔬菜（紫花苜蓿、红苋菜、小麦、大豆和棉花 ）的种子萌发及幼苗生长具有显著的化感作用。根据植物内生真菌内共生理论，加拿大一枝黄花很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的具有抗菌活性的次生代谢产物。目前，国内外还没有加拿大一枝黄花内生真菌次生代谢产物对植物病原菌抑菌活性的研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较强的抑制植物病原真菌活性的加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的制备方法。 

本发明所述的加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088。 

本发明所描述的加拿大一枝黄花内生真菌系从中国安徽省合肥市加拿大一枝黄花 (Solidgo canadensis)植物活体中分离得到的。 

加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088； 

本发明加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的具体发酵制备操作步骤如下：

（1）菌种活化

     在无菌条件下，用接种环挑取少许加拿大一枝黄花内生真菌试管斜面保藏菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，置培养箱内温度28℃±1℃，活化培养5～7天，得到活化菌种；

（2）种子培养

用无菌打孔器(内径5mm)在无菌条件下将活化菌种打成直接为5mm菌碟，接种5块菌碟于含有50ml液体培养基的三角摇瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养2～3天，得摇床种子； 

（3）发酵培养

将摇床种子接种到装有50ml液体培养基的250ml三角摇瓶中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养5～7天，得到加拿大一枝黄花内生真菌发酵液；加拿大一枝黄花内生真菌发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液；

发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为黄褐色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为褐色；

所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升； 

所述液体培养基：蛋白胨15克，葡萄糖 20克，氯化钙 0.5克，磷酸氢二钾0.1克，硫酸亚铁  0.01克，硝酸钠1克，水 1000 毫升，pH自然；

使用前以上述两种培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min。

本发明通过对球毛壳菌yt03的抗菌发酵液的抗菌试验发现，该菌对供试六种植物病原真菌（即辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），番茄枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica)，苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），枣炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum)，小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum））具有较为明显的抑制菌丝生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害新型农用抗生素类天然成分。 

本发明所述加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的抗菌试验如下：

1.    植物病原真菌：

辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），番茄枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica)，苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），枣炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum)，小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）；

2.    病原微生物的培养

取病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在（28±2）℃恒温箱中培养5天；

3.    抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性

在100毫升的无菌三角瓶中加入6毫升本发明制备的加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液和54 毫升马铃薯葡萄糖琼脂无菌融化的培养基，摇匀，分别各取10毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入1个供试病原菌菌饼（直径为6毫米），菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养96小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：    

表1：本发明所述的球毛壳菌yt03的发酵液对六种植物病原微生物的抗菌结果

由上表1可见，本发明制备所得到的加拿大一枝黄花内生真菌内生真菌球毛壳菌yt03发酵产物对供试植物病原真菌具有广谱抗菌活性。球毛壳菌yt03发酵原液对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），枣炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum) 和小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）的菌丝生长抑制率超过50%。对番茄枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica)和苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的菌丝生长也有较强的抑制作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵制备以求获得抗植物病原真菌病害新型农用活性的天然成分。

具体实施方式

实施例： 

本实施例所用加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088；

球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03）菌株，是发酵获得抗植物病害新型农用抗生素类活性成分的天然微生物药源。

加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的具体制备操作步骤如下： 

（1）菌种活化

     在无菌条件下（超净工作台），用接种环挑取少许试管斜面保藏菌种球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，置培养箱内温度28℃活化培养5天，得到活化菌种；

（2）种子培养

用无菌打孔器(内径5mm)在无菌条件下（超净工作台）将活化菌种打成直接为5mm菌碟，将5块菌碟接种于含有50ml液体培养基的三角摇瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160转/分，温度28℃，培养2天，得摇床种子； 

（4）发酵培养：将摇床种子接种到装有50ml液体培养基的250ml三角摇瓶中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃，培养7天，得到加拿大一枝黄花内生真菌发酵液；加拿大一枝黄花内生真菌发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液；

发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为黄褐色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为褐色；

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；液体培养基：蛋白胨15克，葡萄糖 20克，氯化钙 0.5克，磷酸氢二钾0.1克，硫酸亚铁  0.01克，硝酸钠1克，水 1000 毫升，pH自然。使用前以上两种培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min。