大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法

摘要

本发明提供了一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，所述的ELISA中酶标板上的检测抗原为OmpT重组蛋白。检测方法包括以下步骤：待检血清按照1:640稀释后，与酶标板上的OmpT重组蛋白37℃孵育1.5h，洗板三次；加入辣根过氧化物酶标的兔抗牛lgG与待检血清37℃孵育1.5h；加入TMB底物进行显色10min；终止反应后检测OD450，OD450值≥0.335为阳性，OD450值＜0.335为阴性。本发明用大肠埃希氏菌的标志性基因OmpT制备的重组蛋白作为ELISA的检测抗原，该重组抗原可规模化、标准化生产，且特异性强，适于大肠埃希氏菌属所有血清型细菌感染后抗体检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方 法。

背景技术

大肠埃希氏菌（E.coli）属是肠杆菌科12个菌属中最重要成员，广泛存在于自然界并能 引起人和动物共同感染的重要人畜共患病病原。依其致病机制可分为三类：共生型、肠内致 病型和肠外致病型。过去人们对肠内致病型E.coli研究较多，近年来肠外致病型E.coli备受 关注。但E.coli菌体表面结构复杂，血清型种类繁多，不同地区流行的E.coli血清型也各不 相同，且与肠杆菌科其他11个属细菌存在交叉反应，为E.coli感染的血清学诊断和检测带 来不少困难。目前，E.coli血清学检测方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光抗 体试验（IFAT）和血清凝集试验（SAT）等。但这些血清学检测方法都存在着特异性等不足 之处，且检测基本都是针对某一个血清型，因检测范围狭窄而使用受限。所以，尚缺乏通过 单一抗原对所有血清型E.coli感染进行血清学诊断和检测的敏感、特异、快速、简便方法。

OmpT是E.coli的特异性蛋白，由297个氨基酸构成，存在于所有E.coli中，具有高度 保守性和属特异性。晶体结构显示，OmpT由10个β折叠构成、中心切面为13×16A°的椭 圆型花篮结构，蛋白活性位点位于细胞外。OmpT蛋白是菌血症的主要蛋白抗原，其既能诱 导特异性抗体产生，亦能诱导机体的细胞免疫应答。鉴于OmpT蛋白具有这些重要的功能及 良好的抗原性，本发明选取ompT基因，采用重组技术对其进行基因克隆和原核表达，表达 产物进行亲和层析获得纯化的OmpT重组蛋白。经过重组表达的OmpT蛋白既保留了其良好 的抗原性，又提高了OmpT蛋白的产量。该抗原不仅具有高度的属特异性，且具有高纯度和 高稳定性，提取纯化后适宜作为抗原包被酶标板建立间接ELISA检测方法。目前，尚无一 种使用OmpT重组蛋白检测大肠埃希氏菌的ELISA检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供了一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，解决目前 对大肠埃希氏菌的检测范围狭窄，尚缺乏通过单一抗原对所有血清型E.coli感染进行血清学 诊断和检测的敏感、特异、快速、简便方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，所述的检测抗原为OmpT重 组蛋白。

OmpT重组蛋白是通过以下方法制备而成：

（1）提取大肠埃希氏菌的DNA；

（2）根据NCBI数据库已公布序列AE014075设计引物，PCR扩增出ompT基因，引物 序列如下：

ompT-T1：5’-CGATGCGGGCGAAACTTCT-3’（SEQ ID No.1）

ompT-T2：5’-GGCTTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3’（SEQ ID No.2）

（3）扩增的PCR产物回收和纯化；

（4）PCR产物与T载体连接，连接产物转入感受态细胞，经过酶切鉴定，筛选阳性克 隆，序列测定；

（5）BamH I、Sal I双酶切阳性克隆的质粒以及pET-32a，构建pET-32a-ompT表达载体， 转入感受态细胞，培养后挑取阳性克隆，双酶切鉴定；

（6）将阳性克隆的培养液用IPTG诱导表达OmpT重组蛋白。

所述的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，60.5℃退火45s，72℃延伸 90s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

二、一种大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）待检血清按照1:640稀释后，与酶标板上的OmpT重组蛋白37℃孵育1.5h，洗板 三次；

（2）加入辣根过氧化物酶标的兔抗牛lgG与待检血清37℃孵育1.5h；

（3）加入TMB底物进行显色10min；

（4）终止反应后检测OD₄₅₀，OD₄₅₀值≥0.335为阳性，OD₄₅₀值＜0.335为阴性。

该方法在检测大肠埃希氏菌中的应用。

具体方法如下：

以提取的大肠埃希氏菌DNA作为PCR反应模板扩增出ompT基因，将其克隆进表达 pET-32a质粒中，再转入表达宿主菌E.coli rosetta(DE3)中，将获得的含有阳性表达质粒的重 组菌，按常规方法诱导表达，将表达蛋白经纯化、定量后包被酶标板，建立检测大肠埃希氏 菌OmpT抗体的间接ELISA方法。

1、大肠埃希氏菌OmpT蛋白表达质粒的构建

按常规方法提取大肠埃希氏菌DNA作为PCR反应的模版扩增出ompT基因片段，经克 隆、测序验证，将其克隆pET-32a表达质粒中，再转入表达宿主E.coli rosetta(DE3)中，双酶 切、PCR鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pET-32a-ompT质粒，重组菌命名为大肠埃希 氏菌pET-ompT菌株。

2、OmpT蛋白表达、鉴定及纯化、定量

将经诱导表达的菌体12000r/min离心10min，将沉淀以10倍浓缩比例重悬于PBS中， 超声破碎裂解菌体，离心取上清结合NI-NTA柱，用咪唑洗脱法纯化重组蛋白，取样经四亚 群大肠埃希氏菌免疫血清和对照菌免疫血清Western blot鉴定及免疫原性、普遍性和特异性 验证。并根据Bradford法确定蛋白浓度。

3、酶标反应板的制备

包被：将OmpT重组蛋白作为抗原，用0.05M pH7.6 Tris盐酸缓冲液稀释后包被96孔 板，包被浓度1μg/孔，置湿盒中4℃12-14小时，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干； 得到抗原OmpT包被酶标反应板。

封闭：用含1%BSA加满孔（约200μl/孔），37℃孵育，封闭1h，洗板三次，拍干密封； 即得到OmpT包被酶标板。

采用上述技术方案的积极效果：本发明用大肠埃希氏菌的标志性基因OmpT制备的重组 蛋白作为ELISA的检测抗原，与以往大肠埃希氏菌抗原相比，该重组抗原可规模化、标准 化生产，且特异性强，适于大肠埃希氏菌属所有血清型细菌感染后抗体检测。

附图说明

图1是重组表达质粒的鉴定结果。

1：DNA Marker，2：PCR鉴定，3：双酶切鉴定。

图2是OmpT重组蛋白表达图。

M：蛋白Marker，1：空载体诱导前，2：工程菌诱导2小时，3：工程菌诱导3小时， 4：工程菌诱导4小时，5：工程菌诱导5小时，6：工程菌诱导前，7：空载体诱导5小时， 8宿主菌诱导前。

图3是四个种系发育群代表菌免疫血清与OmpT重组蛋白免疫印迹图谱。

A：OmpT重组蛋白与E.coli C83919血清免疫印迹，B1：OmpT重组蛋白E.coli 2002-1 血清免疫印迹，B2：OmpT重组蛋白与E.coli J96血清免疫印迹，D：OmpT重组蛋白与E.coli  O157H:7EDL933血清。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源说明：

1、菌种

大肠埃希氏菌C83919：购自国家兽医微生物菌种保藏中心；

大肠埃希氏菌2002-1：奶牛乳房炎肠杆菌OmpA的免疫原性分析及对小鼠感染模型的 免疫保护效果评估，呼锐，樊自尧，佟春玉，迟佳琦，李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于 立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中 国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集，2010年，363-366，并由申请人保证从 本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；

大肠埃希氏菌J96：尿路致病性大肠杆菌临床株I型菌毛FimH基因检测及分析，尹晓 琳，王秀荣，胡洁，冯惠东，魏林，河北医科大学学报，2003年第24卷第03期，136-138 页，该菌种由河北医科大学基础医学院魏林老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请 日起二十年内向公众发放该生物材料；另外，该生物材料还公开在奶牛乳房炎肠杆菌OmpA 的免疫原性分析及对小鼠感染模型的免疫保护效果评估，呼锐，樊自尧，佟春玉，迟佳琦， 李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽 医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集中， 2010年，363-366，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；

大肠埃希氏菌O157H：7EDL933：大肠杆菌O157噬菌体的分离鉴定及其初步应用， 杜崇涛，硕士论文，授予单位：吉林大学，导师：冯书章，发表时间：2008年；该菌种由吉 林大学畜牧兽医学院杜崇涛老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请日起二十年内向 公众发放该生物材料；

弗氏志贺菌ATCC 12022，肺炎克雷伯菌ATCC 35281，普通变形杆菌ATCC 49027，绿 脓杆菌ATCC27853，金黄色葡萄球菌ATCC 25923均购自中国药品生物制品鉴定所；

牛巴氏杆菌CVCC 44702，鸡沙门氏菌CVCC 520，奇异变形杆菌CVCC 1969，无乳链 球菌CAU0306，均购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

2、引物

ompT基因特异性引物是根据基因序列自行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。

3、辣根过氧化物酶标的兔抗牛lgG购自sigma公司。

4、作为感受态细胞的DH5a和E.coli rosetta(DE3)购自博美科生物技术有限公司。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例用于说明ompT基因的获得以及表达载体的构建，具体步骤如下：

1、按照大肠埃希氏菌ompT基因序列（GenBank Accession No.AE014075），利用Oligo6.0 软件分析，自行设计一对引物，引物两端分别加限制性酶切位点BamH I和Sal I（方框内） 及保护性碱基。经计算机BLAST软件分析，具有较好的特异性。引物的核苷酸序列为：

ompT-T1：5’-CGATGCGGGCGAAACTTCT-3’（SEQ ID No.1）

ompT-T2：5’-GGCTTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC-3’（SEQ ID No.2）

2、以提取的E.coli 2002-1株菌体DNA作为模版进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预 变性5min，94℃变性45s，60.5℃退火45s，72℃延伸90s，进行30个循环，最后72℃延伸 10min。扩增出的ompT基因片段采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段。

3、扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA凝 胶回收试剂盒（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System）回收和纯化DNA，具体步骤参照 说明书进行。

4、将所得片段与T载体连接，将连接产物10μL加入到新制备的感受态细胞中，轻旋 混匀。冰浴30min；42℃热休克90s，立即冰浴2min。然后加入到1mL 37℃预热的液体 LB培养基中，37℃100r/min振摇45min；5,000r/min离心2min，弃去800μL上清，余下 的200μL培养液涂布于固体LB平板（含100μg/mLAmp+），37℃培养12h。

5、挑取转化板上的单一菌落，无菌接至3mL LB/Amp+（Amp+终浓度为100μg/mL） 液体培养基中，震荡培养12h后，采用试剂盒提取小量质粒。

6、取克隆重组质粒进行PCR和BamH I、Sal I双酶切鉴定。PCR反应体系及条件同上。 混匀后37℃水浴2-3h，取出后全部上样，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

7、将pET-32a载体提取质粒，用BamH I和Sal I进行双酶切后，用DNA纯化/回收试 剂盒回收。同时将质粒pMD18-T-OmpT用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，使用DNA纯化/回 收试剂盒回收ompT基因片段。将目的片段与载体pET-32a连接。16℃连接过夜后，热转化 至E.coli rosetta感受态细胞中，通过Amp抗性、PCR和限制性内切酶双酶切进行筛选和鉴 定后，（如图1），目的条带为1000bp，将阳性克隆进行测序。

实施例2

本实施例说明重组蛋白的诱导表达以及纯化，具体步骤如下：

1、对于序列正确的菌落，挑取单个菌落接种于含Amp+的液体LB培养基中，37℃振荡 过夜。取过夜培养物按2%的量接种于含Amp+的液体LB培养基中，37℃振荡培养至A600 值0.5~1.0，加IPTG至终浓度为1mM，继续在37℃振荡培养，并在培养的不同时刻（2、 3、4、5、6h）各从培养物中取出1mL菌液转移到离心管中，10,000r/min离心5min，收集 菌体沉淀，加入90μL 2×上样缓冲液和10μL 1mol/L DTT悬浮混匀，煮沸5min，10,000r/min 离心5min后立即使用，或-20℃储存，用前100℃加热5min。

2、SDS-PAGE凝胶电泳：组装好电泳设备，拔出样品梳，每孔加入10μL的样品，样品 在浓缩胶中采用8v/cm的电压进行电泳，在分离胶中采用15V/cm的电压进行电泳。待溴酚 蓝至分离胶底部约1cm时，停止电泳。取出凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液在摇床上染色 30min左右，然后脱色至背景清晰，用清水冲洗、照相。SDS-PAGE表明，在IPTG的诱导 下，转化有重组质粒的大肠杆菌rosetta(DE3)可高效表达融合蛋白；时间梯度结果表明，4h-5h 的诱导量最高（如图2）。

3、按最佳诱导时间培养重组菌，10,000g离心5min，沉淀重悬后超声波破碎，4000r/min 再离心10min，分别取10μL上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳（8%分离胶，5%浓缩胶）， 以确定重组蛋白是否为可溶性表达，并用NI-NTA柱纯化。

实施例3

本实施例说明OmpT蛋白的抗原性以及特异性验证。

1、按“半干法”进行：将SDS-PAGE后的凝胶中的蛋白质转到NC膜上，用全菌体免 疫血清和蛋白免疫血清分别作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行western-blotting 检测表达的蛋白质。结果：四个E.coli种系发育群小鼠免疫血清作为一抗的western-blotting 均出现清晰可见的一条带（图3），表明表达的OmpT蛋白具有良好的抗原性和保守性，纯 度高。

2、用微量加样器向96孔聚苯乙烯微孔反应板（酶标板），以每孔25μL加入稀释液（第 一孔除外）。第一孔加入50μLOmpT纯化蛋白免疫小鼠血清，从第一孔血清中取出25μL加 入到第二孔中，用加样器以吹打方式混合5次，混匀后用微量加样器吸取25μL加入第三孔 中，同样采用吹打方式混匀，依次到第12孔，最后在第12孔取出25μL弃掉。每孔分别加 入已制备的菌体抗原25μL：A群:E.coli C83919；B1群：E.coli 2002-1；B2群：E.coli J96； D群：E.coli O157H:7EDL933，验证各种系发育群E.coli抗原的保守性，结果E.coli四个种 系发育群均与OmpT蛋白免疫血清发生凝集反应；同时，与9株非E.coli对照菌株做凝集实 验以验证其特异性，结果9株非E.coli对照菌株均未与OmpT蛋白免疫血清发生凝集反应。

实施例4

本实施例用于说明大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法的建立（以牛血清检测 为例）：

1、ELISA检测的试剂

（1）包被液：0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，4℃保存。

（2）样本稀释液：含1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸盐-吐温缓冲液。

（3）封闭液：含1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸盐-吐温缓冲液。

（4）酶标二抗：兔抗牛IgG/HRP。

（5）底物缓冲液（磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0））：0.2mol Na₂HPO₄·12H₂O 25.7mL， 0.1mol柠檬酸24.3mL,去离子水50mL。

（6）TMB底物显色液：0.01g TMB干粉溶于1mL DMSO中，取底物缓冲液9.9mL加 30μL H₂O₂，再加入DMSO溶解的TMB100μL。

（7）终止液（2M H₂SO₄）：蒸馏水178.3mL，逐点加入浓2M的H₂SO₄ 21.7mL。

（8）0.05%PBST：在上述PBS中加入0.5mL的Tween-20。

2、反应板均一性测定

从购买的酶标板中随机抽取8块，酶标板用3000倍稀释后的酶标二抗以100μL/孔包被， 4℃包被过夜。PBST洗3次，每次间隔5min，洗涤后拍干，以200μL/孔加入5%脱脂乳封 闭液，37℃1h，按上述方法再次洗涤。以100μL/孔加入TMB底物显色液，37℃避光反应 10min，在酶标仪上测其OD450数值，计算各个孔间的标准差和变异系数，分析不同酶标板 间的均匀度。经统计分析，各孔在OD450时平均值为1.347，变异系数为4.6%，小于5%， 表明这种酶标板均一性良好，能够满足ELISA检测试验的要求。

3、最佳包被缓冲液的选择

OmpT蛋白抗原分别用碳酸盐缓冲液（pH9.6）、PBS（pH 7.2）、Tris-HCl（pH 7.6）、柠 檬酸盐缓冲液（1.0M pH6.0）、水（pH7.0）进行包被，每种包被液体做4个重复，4℃过夜， 血清根据最佳浓度稀释，以下按ELISA操作步骤进行，测其OD450值并计算P/N值，用 Tris-HCl（pH 7.6）作为包被缓冲液时的P/N值都一直最大。所以，选择Tris-HCl（pH 7.6） 作为最佳包被缓冲液。

4、OmpT蛋白抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定

阴阳性血清分别做40-1280倍稀释，与梯度稀释的包被抗原做交叉反应试验，每个稀释 度做4个重复。结果当包被抗原浓度降低、阴阳性血清浓度减小时，OD450值不断变小。当 抗原的稀释浓度为1μg/孔，阴阳性血清的稀释倍数为1:640，此时P/N值最高。所以，确定 最佳的抗原包被浓度为1μg/孔，血清的稀释倍数为1:640。

5、酶标二抗工作浓度的确定

将OmpT蛋白和阴阳性血清分别作最佳稀释后进行ELISA操作，酶标二抗根据说明书 分别作1：3000、1：6000、1：12000、1：24000梯度稀释进行ELISA试验，测其OD450 时的值并计算P/N值。结果当抗原和血清最佳工作浓度确定后，酶标二抗以1:6000稀释时 的P/N值最大，确定酶标二抗最佳稀释浓度为1:6000。

6、封闭液的选择

将OmpT蛋白抗原、一抗血清和酶标二抗分别按照已确定的最佳浓度进行稀释。分别用 5%脱脂奶粉、1%明胶、1%牛血清白蛋白和10%胎牛血清做封闭液，进行间接ELISA试验。 测OD450时数值并计算P/N值。结果OmpT-ELISA用1%BSA-PBST封闭液效果最佳。

7、封闭时间的确定

采用已确定的最佳封闭液在37℃封闭30min、1h、1.5h、2h，其它反应条件按以上确 定进行，在OD450时测量其数值并做P/N计算，确定最佳的封闭时间。结果OmpT–ELISA 37℃封闭1h效果最好。

8、血清稀释液的选择

比较5%脱脂奶粉、1%BSA、PBS、Tris盐酸盐缓冲液作为血清稀释液时的P/N值，确 定最佳的血清稀释液。结果1%BSA作为血清稀释液的效果明显好于Tris-HCl和PBS。

9、抗原和血清反应时间的确定

抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平 衡，OmpT蛋白抗原按上述确定的最佳反应条件，阴性与阳性血清各做8个重复，37℃分别 作用0.5h、1h、1.5h、2h四个反应时间的验证。测其OD450时数值，确定P/N值最大的反 应时间。结果OmpT蛋白抗原在37℃下与血清反应1.5h时P/N值最大，阴性平均值也较小。

10、酶标二抗的作用时间的确定

OmpT蛋白抗原按最佳包被浓度包被酶标板，4℃过夜，将标准阳性、阴性血清以最佳 稀释倍数稀释，酶标二抗作1：6000稀释，酶标二抗的作用时间设0.5h、1h、1.5h、2h 四个反应组，每组阴性和阳性对照各做8个重复，按照ELISA操作程序进行，测其在OD450 数值，比较P/N值确定反应时间。结果OmpT酶标二抗作用1.5h时，P/N值最大，且阳性 值都大于1.0，阴性值都小于0.2，因此OmpT-ELISA酶标二抗的作用时间确定为1.5h。

11、底物显示时间的确定

按照已确定的ELISA反应程序依次包被、封闭、加入阴阳性血清，各做8个重复，再 和酶标二抗反应1.5h之后加入TMB底物显色，37℃孵育反应设5min、10min、15min、 20min四个显色时间，测定在OD450时数值。选取阳性平均值接近1.0，阴性OD平均值比 较小，且P/N值最大的一组作为最佳的底物显色时间。结果在37℃条件，与底物作用10min 的阳性OD450值可以达到1.0以上，而阴性OD450值在0.2以下，P/N值最大，底物显色时 间确定为10min。

12、间接ELISA方法阳性临界值的确定

用OmpT蛋白抗原包被酶标板，按照前面已建立的间接ELISA检测方法，检测170份 血清凝集试验判定为阴性的牛血清。每份血清做三次重复，记录样本的OD450值并计算平 均值(x)和标准差(S)。当样本OD450值≥x+3S时，判定此血清为阳性血清；相反，判定为阴 性血清。结果间接ELISA方法阴阳血清的判定值为0.335。即血清样品OD450值≥0.335就 可以判断为阳性，＜0.335为阴性。

13、特异性和敏感性试验

用已建立间接ELISA方法，对170份E.coli凝集实验为阴性和170份全菌疫苗免疫凝集 实验为阳性的牛血清稀释640倍后进行检测。阴性血清的检出率体现所建立间接ELISA方 法的特异性，阳性血清的检出率体现所建立的间接ELISA方法的敏感性。即间接ELISA方 法特异性=（ELISA阴性血清数量）/（全菌凝集实验阴性血清数量）×100%；ELISA方法 敏感性=（ELISA阳性血清数量）/（全菌疫苗免疫阳性血清数量)×100%。结果间接ELISA 方法的特异性为96.5%，敏感性为100%。

14、检测灵敏度试验

将阳性和阴性血清平行倍比稀释，按建立的间接ELISA方法检测血清中抗体的含量， 将P/N≥2.1的最大血清稀释度作为ELISA检测方法的灵敏度。结果通过对血清的倍比稀释后 检测发现，当血清稀释度达到1:6400时，P/N值仍大于2.1，说明所建立的间接ELISA方法 有很高的灵敏度。

15、重复性试验

（1）批内重复性试验

用同一次纯化的OmpT重组蛋白包被酶标板，取8份不同的血清，在一起按已确立的间 接ELISA检测程序测定，每份样品做6个平行孔，结果进行统计学分析。结果检测样品的 变异系数（CV）在2%-9%之间，都小于10%。此方法有很好的重复性。

（2）批间重复性试验

用同一次纯化的OmpT重组蛋白抗原包被4块酶标板，取8份不同待测样本，在4个时 间按照已确立的间接ELISA检测程序测定样本，每份血清样本设6个平行孔，结果进行统 计学分析；用4次不同批次纯化的OmpT重组蛋白抗原包被酶标板，取8份不同的血清样本 在同样条件下进行检测，每份血清样本设6个平行孔，结果进行统计学分析。结果检测样品 的变异系数（CV）在2%-9%之间，都小于10%。此方法有很好的重复性。

实施例5

本实施例用于说明大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测板的制备及检测流程，具 体步骤如下：

（1）将已纯化重组OmpT蛋白用0.05M Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液稀释10μg/mL后， 用微量加样器吸取稀释好的样品加入孔内，100μL/孔，4℃冰箱12~14h，PBST洗板3次， 每次3min，然后拍干；洗涤：冰箱过夜后取出ELISA板，甩干内容物，加入洗液PBST， 200μL/孔，震荡5min，甩干，洗涤3次，最后一次甩干拍打干净；

（2）加入1%BSA-PBST，100μL/孔，37℃1h，洗板3次后密封。

（3）待检血清稀释：加入1：640稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100μL/孔， 37℃孵育，1.5h，洗板三次；

（4）加酶标物：被检测物种的特异IgG抗体或采用酶标记的SPA，100μL/孔，37℃1.5 h，洗板三次；

（5）显色：将配置好的TMB底物溶液100μL/孔加入，37℃避光10min；

（6）终止反应：加入终止液2mol/L的H₂SO₄50μL/孔，室温下5min；

（7）确定血清阴阳性临界值，按照前面已建立的间接ELISA检测方法，检测阴性的血 清。每份血清做三次重复，记录样本的OD450值并计算平均值(x)和标准差(S)。当样本OD450 值≥x+3S时，判定此血清为阳性血清；相反，判定为阴性血清。

（8）结果判断：利用酶标仪，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD450值。 大于临界值的为阳性，小于临界值的为阴性。

试验例1

本试验例用于验证本发明的大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测板的准确性，具 体步骤如下：

取10份已经感染大肠埃希氏菌的阳性血清，以及被9株对照菌（弗氏志贺菌ATCC 12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通变形杆菌ATCC 49027、绿脓杆菌ATCC27853、牛 巴氏杆菌CVCC 44702、鸡沙门氏菌CVCC 520、奇异变形杆菌CVCC 1969、无乳链球菌 CAU0306、金黄色葡萄球菌ATCC 25923）感染后的抗体血清，应用本发明的ELISA检测板 进行检测，判定方法同实施例5。结果发现，本发明的ELISA检测板准确率可达100%，可 以作为检测大肠埃希氏菌的一种简单有效的方法。