与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用

摘要

本发明公开了一种与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用，采用标记引物

说明书

技术领域

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与增加小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，因此高产小麦品种的选育一直被育种家高度重视。小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点（Quantitative trait locus，QTL）控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育高产小麦品种时，传统的育种方法常存在时间长、耗费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的各个组织和生育时期均可检测、选择效率高的优势。研究证明，主要受籽粒大小性状影响的千粒重是最稳定的产量直接构成因素（Giura and Saulescu, Euphytica. 89: 77-80, 1996）；Snape等曾报道过籽粒大小与产量高度相关（Euphytica. 154: 401-408, 2007）。可见，小麦的产量与籽粒大小和千粒重具有显著相关性。因此，研究千粒重和籽粒大小基因，通过分子标记技术，提高小麦籽粒大小和千粒重获得高产小麦新品种，在育种工作中具有极其重要的意义。小麦山农品系0431是1994年“国际冬春麦杂交筛选圃”（美国，康奈尔大学）的F₃组合“Grtpi85504 // MI76-77-S29 / ALD”选育的的一个大粒、抗病（条纹病、叶锈病、白粉病、根腐病）和抗干热风的品系，综合农艺性状好，是研究千粒重和籽粒大小基因的优异种质资源。目前，尚未有与其千粒重和粒长主效数量基因位点QTL相连锁的分子标记报道。

发明内容

本发明的目的就是提供一种与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用，通过发明获得的与千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有增加千粒重和粒长的QTL，以加快小麦高产品种的选育进程。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的一种与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记，该分子标记为wmc386和barc216，其所述分子标记wmc386的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述；所述分子标记barc216的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO:4所述。

一种与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记的获取方法，它包括以下步骤：采用分子标记wmc386的引物

左端核苷酸序列  ATCACTGAAACGAAATGAGCGG（如SEQ ID NO:1所述）

右端核苷酸序列  TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA（如SEQ ID NO:2所述）

和分子标记barc216的引物

左端核苷酸序列  TGACGACCCAATCCATAGACA （如SEQ ID NO:3所述）、

右端核苷酸序列  GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG（如SEQ ID NO:4所述）

对小麦品系山农0431的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，H₂O 5.75 μl，10×PCR缓冲液 10.0 μl，Taq酶 0.25 μl，左右端引物 2.0 μl，DNA 2.0 μl；扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min；10℃保存；扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为190 bp和100 bp，即得到与小麦千粒重和粒长主效QTL连锁的分子标记。

本发明所述的与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记在选育高产小麦中的应用，即为将与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记用于检测小麦品种或品系的方法，该方法它包括以下步骤：

a．用wmc386和barc216的标记引物对小麦品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包含H₂O 5.75 μl，10×PCR缓冲液 10.0 μl，Taq酶 0.25 μl，左右端引物 2.0 μl，DNA 2.0 μl；扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min；10℃保存； 

b．将上述扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如wmc386的扩增产物分子量大小为190 bp的分子标记和barc216的扩增产物分子量大小为100 bp的分子标记同时出现，则该小麦品种或品系为具有增大千粒重和粒长的基因的的品种或品系，否则，该小麦品种或品系属于不具有增大千粒重和粒长基因的品种或品系。

本发明提供的与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法，它包括以下步骤：

（i）以小麦品系山农0431为母本、小麦品种鲁麦21为父本进行杂交得到F₁，F₁自交产生F₂，采用单粒传法获得含有177个株系的F₇代RIL群体；

（ii）用改良CTAB法（Vander Beek et al.，1992）提取所述RIL群体各株系的DNA，采用多样性微阵列技术标记（DArTs标记）、简单重复序列标记（SSR标记）和基于表达序列标签的简单重复序列标记（EST-SSR标记）对所述株系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型资料；

（iii）利用MAPMAKER 3.0作图软件将获得的所述RIL群体的基因型资料构建小麦的分子遗传图谱，其LOD ≥ 3.0；

（iv）将所述RIL群体进行田间种植，并对RIL群体的各株系分别进行表型调查，获得各株系的千粒重和粒长的特征数据；

（v）利用MAPMAKER 3.0和Windows QTL Cartographer 2.5作图软件，采用复合区间作图法，对每个分子标记的群体基因型资料与对应每个株系的千粒重和粒长进行连锁分析，在LOD ≥ 3.0时，染色体5B上的wPt-7029-wPt-9467区间中千粒重QTL和粒长QTL的峰值均在wmc386-barc216区间；

（vi）其wmc386和barc216标记引物在小麦品系山农0431的DNA中获得的扩增产物的分子量分别为190 bp和100 bp，即为与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记。

在上述方法中所采用的MAPMAKER 3.0、Windows QTL Cartographer 2.5软件均为目前进行遗传作图和QTL分析的常用软件，属于市售商品，可以通过商业渠道购得。

本发明所述小麦品系山农0431的DNA是指对小麦品系山农0431植株的叶片分离提取后获得的DNA。

本发明所述8%聚丙烯酰胺凝胶是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。

本发明公开的小麦千粒重和粒长紧密连锁的分子标记wmc386和barc216充分体现了小麦品种或品系的千粒重和粒长的主效QTL，通过该分子标记对小麦衍生品种或品系PCR扩增，可以很快捷地对小麦品种或品系是否具有千粒重和粒长的QTL进行判断，从而可以快速筛选出具有增加千粒重和粒长QTL的小麦品种或品系，加快高产小麦品种的选育进程。

将本发明提供的与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。

附图说明

图1为小麦品系山农0431的千粒重和粒长主效QTL在染色体5B上的作图区间。

图1中：空心长方形代表染色体，中间的实心黑圈代表着丝粒位置，右侧是分子标记的名称，左侧数字是标记之间的遗传距离，单位是cM；图中共有两种分子标记，“wPt”和“rPt”为DArTs标记，barc、gwm与wmc均为SSR标记，标有黑色下划线的标记为wmc386和barc216；染色体左下方的斜线填充的长方形表示QTL作图区间，其中GL代表粒长性状；TGW代表千粒重性状。

图2为小麦品系山农0431为亲本的F₇代RIL群体的18个衍生品系用wmc386标记引物进行PCR扩增的电泳条带图。

图3为小麦品系山农0431为亲本的F₇代RIL群体的18个衍生品系用barc216标记引物进行PCR扩增的电泳条带图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

一种与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记， 

采用标记引物wmc386，

左端引物序列  ATCACTGAAACGAAATGAGCGG（如SEQ ID NO:1所述）

右端引物序列  TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA（如SEQ ID NO:2所述）

和标记引物barc216，

左端引物序列  TGACGACCCAATCCATAGACA （如SEQ ID NO:3所述）

右端引物序列  GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG（如SEQ ID NO:4所述）

对小麦品系山农0431的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，H₂O 5.75 μl，10×PCR缓冲液 10.0 μl，Taq酶 0.25 μl，左右端引物 2.0 μl，DNA 2.0 μl；扩增条件为94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min；10℃保存；所使用的PCR仪型号为：BIO-RAD S1000 THERMAL CYCLER（本发明中所有PCR扩增均采用该型号PCR仪）；扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为190 bp和100 bp，即为小麦千粒重和粒长主效QTL的分子标记。

本发明提供的与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法，它包括以下步骤：

（i）以大粒小麦品系山农0431为母本、以普通小麦品种鲁麦21为父本进行杂交得到杂种F₁，F₁自交产生F₂，采用单粒传法获得含有177个株系的F₇代RIL群体；

（ii）用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化铵法（Vander Beek et al.，1992）提取上述RIL群体各株系的DNA，采用多样性微阵列技术标记（DArTs标记）、简单重复序列标记（SSR标记）和基于表达序列标签的简单重复序列标记（EST-SSR标记）对所述株系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型资料；

其中SSR标记和EST-SSR标记分析是将筛选株系的DNA进行PCR扩增，扩增产物在所述8%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在所选株系中进行分析，获得所述RIL群体的基因型资料；DArTs标记分析是通过与芯片杂交的技术来辨别不同基因组之间多态性的方法，将各株系基因组DNA经过两种不同切割频率的限制性内切酶酶切，再利用切割频率低的限制性内切酶识别序列的接头与酶切片断相连接，继而通过与该酶切接头相对应的引物来实现对该特异片断的PCR扩增。将扩增子用于构建克隆文库，进而将其经过荧光标记，经变性后点于芯片上作为探针。所要检测的目标DNA也需经过同样的内切酶切割和PCR扩增，然后就可与经过荧光标记的靶序列探针来杂交，获得所述RIL群体的基因型资料；

改良的CTAB法提取叶片中DNA的步骤为：取0.15～0.2 g新鲜叶片放入2 ml离心管中，迅速放入液氮中至少10 s，快速磨成细粉；加入1 ml已预热至65℃的CTAB提取液，65℃温育1 h，每20 min颠倒混匀离心管或者轻微震荡温育；置于4℃冰箱或室温冷却至15℃以下；加入1 ml温度4℃的按体积比为1:1的酚和氯仿，上下混匀30 min，然后1000 rpm离心20 min；取700 μl上清液，加入等体积的体积比为24:1的氯仿-异戊醇，上下混匀30 min，保证样品与氯仿充分混和；10000 rpm离心20 min；取上清液500 μl，加入等体积的冰异丙醇，轻轻上下颠倒管子15次，可以看到核酸沉淀；4℃冰箱静置30 min左右；10000 rpm离心30 min，弃上清液，1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀两次；弃乙醇，吹干DNA，用250 μl 1×TE溶解DNA；加入1.0 μl 2 mg/ml的RNase，37℃水浴30 min去除RNA，即得到所需DNA；

（iii）利用MAPMAKER 3.0作图软件，将获得的RIL群体的基因型资料构建具有740个标记的小麦的分子遗传图谱，以LOD ≥ 3.0为标准；其中740个标记是由617个DArTs、118个SSR和5个EST-SSR组成；

（iv）将RIL群体进行了两年共六个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考查不同年份和不同环境条件下的各个株系的籽粒性状和千粒重，其中两年六个试验环境即2010年泰安、2011年泰安、2011年菏泽、2011年泰安农科院、2011年烟台和2011年淄博。

其中小麦种植方法：RIL群体中每个株系种植5行，行长2 m、行间距25 cm、每行种植70粒种子，正常生长及收获；千粒重测定方法：将收获后各株系的小麦种子取500粒称重，重复3次，取平均值计算千粒重；粒长测定方法：将收获后各株系的小麦种子取20粒，首尾相接摆成直线量长度，重复3次，计算籽粒粒长。

（v）利用MAPMAKER 3.0和Windows QTL Cartographer 2.5作图软件的前后回归方法，以LOD ≥ 3.0为标准，对每个分子标记的群体基因型资料与对应每个株系的千粒重和粒长进行连锁分析并作图；

（vi）由QTL分析可得：在染色体5B上分别发现4个环境条件下重复出现千粒重QTL和5个环境条件下重复出现粒长QTL峰值的区间为wmc386-barc216，如图1、表1所示。

表1 千粒重和粒长的QTL分析结果

由表1所示，这9个QTL的峰值均在wmc386附近，其中，泰安（2010）、泰安农科院（2011）和烟台（2011）3个环境下的粒长QTL以及泰安（2011）、泰安农科院（2011）和烟台（2011）3个环境的千粒重QTL的峰值均在wmc386处。淄博（2011）环境的千粒重QTL峰值离wmc386的距离是1.0 cM，泰安（2011）和淄博（2011）粒长的QTL峰值离wmc386的距离分别是2.0 cM和3.0 cM。并且这9个QTL的贡献率最高达32.5%，最低的为9.7%，且所有的QTL的加性效应均为正值。在wmc386-barc216区间内，在5个环境中检测到了粒长QTL，并且QTL的平均贡献率为16.5%；在4个环境中检测到了千粒重QTL，平均贡献率为16.9%。说明在wmc386-barc216区间内检测的是与小麦千粒重和粒长相连锁的稳定、主效的QTL，其标记引物wmc386和barc216在小麦品系山农0431的DNA中获得的扩增产物的分子量分别为190 bp和100 bp，即为与小麦千粒重和粒长主效QTL连锁的分子标记。

实施例2 

本发明提供的与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记在小麦品系山农0431为亲本的F₇代RIL群体中的18个衍生品系和鲁麦21中的应用

以大粒、抗病、抗干热风品系山农0431作母本，以小粒、多穗品种鲁麦21作父本，通过单粒传法（SSD法）构建了F₇重组自交系群体（RIL群体），并开展了利用该RIL群体进行籽粒与产量相关性状的QTL定位以及与主效QTL紧密连锁分子标记的筛选。其具体步骤如下：

（1）将小麦品种山农0431的RIL群体中18个衍生株系进行田间种植，取各株系的植株叶片采用所述改良的CTAB方法进行分离提取获得的DNA；

所述的小麦品系山农0431的衍生品种或品系是指：以小麦品系山农0431为亲本，通过采用常规杂交并繁衍至F₂代以上、组织培养或玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系；

（2）采用标记引物wmc386和barc216将获得的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系20 μl，包含H₂O 5.75 μl，10×PCR缓冲液 10.0 μl，Taq酶 0.25 μl，左右端引物 2.0 μl，DNA 2.0 μl；PCR工艺条件为：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min；10℃保存； PCR扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测； 

（3）对检测结果进行分析，其wmc386的扩增产物分子量大小为190 bp的分子标记和barc216的扩增产物分子量大小为100 bp的分子标记同时出现，即扩增产物均与山农0431的扩增产物一致的品系为具有增大粒长、千粒重QTL的衍生品系。

具体结果分析如下：利用wmc386和barc216的标记引物对山农0431、1-18个衍生品系及鲁麦21的DNA进行PCR扩增，其结果分别如图2和图3所示：

在图2和图3中，泳道1-18分别代表山农0431的18个衍生品系扩增产物的电泳分离带，CK为鲁麦21扩增产物的电泳分离带（鲁麦21为小粒、多穗品种），SN代表的是山农0431扩增产物的电泳分离带。

从图2、图3可以看出，在18个衍生品系中，其带型与山农0431带型相同的为携带增大粒长、千粒重QTL的衍生品系，即衍生品系2、13、15和18，这些衍生品系可用于下一步高产育种的品系；而鲁麦21的扩增产物的电泳分离带型与山农0431带型不同，则鲁麦21是不具有增大千粒重和粒长QTL的品种。

由此证明：利用wmc386和barc216进行分子标记辅助选择，可有效筛选具有增加千粒重和粒长QTL的品种或品系，该标记用于小麦辅助育种可大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  山东农业大学

 

<120>  与小麦千粒重和粒长主效QTL紧密连锁的分子标记

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  wmc386

 

<400>  1

atcactgaaa cgaaatgagc gg                                              22

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  wmc386

 

<400>  2

tggttggcgg tttttctcta ca                                              22

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  barc216

 

<400>  3

tgacgaccca atccatagac a                                               21

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  barc216

 

<400>  4

ggtgattatt cgtgagttcc ctgtg                                           25