一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法

摘要

本发明提供了一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法。具体地，本发明提供了一种融合基因及其编码的融合蛋白。该基因含有人蛋白C的信号肽序列和Gla等结构域缺失人前凝血酶基因序列，可提高人前凝血酶-2的表达水平。本发明还公开了采用包含上述核苷酸序列的重组表达载体在动物细胞中表达和生产人前凝血酶的方法；本发明还公开了经过纯化和激活生产重组人凝血酶的方法。本发明所生产的重组人凝血酶具有可以满足治疗临床相关疾病的生物学活性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地涉及一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法。

背景技术

凝血酶是机体凝血系统中的关键酶，生成于损伤处血管内皮细胞，参与凝血过程各个反应环节。凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，由308个氨基酸残基组成，分子质量为36KD。凝血酶是一种双链分子含有A链和B链，两链间由二硫键连接。其中A链含49个氨基酸残基，又称轻链；B链由259个氨基酸残基组成，又称重链(Raimondo De Cristofaro et a1. A natural prothrombin mutant reveals an unexpected influence of the A-chain’s structure on the activity of human α-thrombin. J Biol Chem. 2004, 279(13): l3035- l3043.)。

在人体凝血反应过程中，凝血酶直接作用于纤维蛋白原使其转化为纤维状的不溶性纤维蛋白，网住外渗的血细胞，最终形成血液凝块而完成止血过程。

由于凝血酶所具有的止血快、无副作用的优点，在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出。近年来其应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料。

传统的工业生产凝血酶的技术已趋成熟，主要是从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。但是，这种生产工艺受到血液资源的限制，随着市场需求的增大，已经远远不能满足需求。由于血浆中往往含有大量的病原体和病毒，如牛海绵状脑炎物质、人肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒等，难免会在终产品中产生残留，增加患者感染的几率。不仅如此，产自动物的凝血酶会引起抗体的产生，这些抗体可与人血液发生交叉反应，且往往诱导严重的出血并发症。

随着基因工程技术的成熟和发展，利用重组方法大量生产的凝血酶已经成为可能，并且能够克服传统工业生产凝血酶的缺点，具有纯度高、防污染、可量产等优点。有研究表明，采用原核细胞如大肠杆菌作为表达载体，产生的凝血酶往往形成不可溶的包涵体，很难复性和纯化，收率低(K. Soejima, N et a1. An efficient refolding method for the preparation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of the recombinant derived alpha-thrombin. J Biol Chem, 200, l 0(2): 269-277.)。更重要的是原核生物不能对蛋白质进行如糖基化、羧基化等的翻译后修饰，而凝血酶活性的发挥恰恰需要这些修饰作用。

由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，直接被分泌到胞外，不存在形成包涵体的问题，而且在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。在很多工业生产中，细胞培养过程中不添加动物源性的营养物质，所有成分都已知、可控，避免了病原体或者病毒的残留。高密度培养工艺是重组蛋白和单克隆抗体等生物技术产品规模化工业生产中的主流工艺技术，具有高细胞密度，高产量，高效率，产品质量可控，和容易实现工艺放大等优点。

美国FDA于2008年1月批准了Zymogenetics公司的重组人凝血酶Recothrom上市，Recothrom是第一个被批准上市的无血浆的重组凝血酶，由带有凝血酶表达载体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞大规模培养后分泌至培养基中，经过高度纯化制成，后者是通过基因修饰用来生产人凝血酶的细胞系。这些细胞不带有任何已知的病原体，并且产品经过了病毒灭活的程序。基于一项411例病人参加的Ⅲ期临床研究结果表明，该产品与牛凝血酶有同等的功效，却显著减少抗体产生几率(Chapman WC et a1. A phase 3, randomized, double-blind comparative study of the efficacy and safety of topical recombinant human thrombin and bovine thrombin in surgical hemostasis. J Am Coll Surg, 2007, 205(2): 256-265.)。

然而，采用CHO细胞进行表达时，其表达效率较低，导致生产成本上升等不利因素。

因此，本领域迫切需要开发新的、高效表达和制备重组凝血酶的方法。

发明内容

本发明的一个目的是为了克服重组人凝血酶在动物细胞中表达较低、生产成本高，或动物或人血浆来源的凝血酶可能含有病原污染等弱点，提供一种能提高人凝血酶在动物细胞中表达水平的表达载体和方法。 

本发明的另一个目的是提供上述在动物细胞中所表达的重组人前凝血酶激活和纯化的方法，从而获得可用于临床治疗的人凝血酶。

 

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白是人蛋白C的信号肽序列与缺失Gla结构域的人凝血酶形成的融合蛋白。

在另一优选例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面中所述的融合蛋白的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列是与SEQ ID NO:5简并的序列或同源性≥80%(较佳地90%，更佳地95%)的同源序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞携带本发明第三方面表达载体，或者所述宿主细胞的染色体或基因组中整合有本发明第二方面中所述的多核苷酸，或者是为所述表达载体或所述多核苷酸所转化的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

在本发明的第五方面，提供了一种制备人凝血酶的方法，包括步骤：

培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2； 

分离或纯化出所述的分泌的人前凝血酶-2；和

对上一步骤中获得的人前凝血酶-2进行激活处理，从而形成人凝血酶。

在另一优选例中，所述的激活是用伊卡因(ecarin)蛋白进行激活。

在另一优选例中，在分离或纯化步骤中包括：将人前凝血酶-2经过阴离子柱和疏水柱进行纯化后，再用重组ecarin蛋白激活。

在另一优选例中，还包括对于激活后的重组人凝血酶，通过亲和纯化和凝胶过滤层析进行纯化。 

在另一优选例中，所述的亲和柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow柱。

在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白或第二方面中所述的编码融合蛋白的多核苷酸的用途，它们被用于制备人凝血酶。

在本发明的第七方面，提供了一种表达和生产重组人凝血酶的序列和方法，包括步骤：

①将含有人蛋白C的信号肽序列与Gla结构域缺失的人凝血酶基因融合，形成表达融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的编码基因；

②将上述编码基因插入包含有效的启动子(CMV promotor)、牛生长因子polyA  (bovine growth factor hormone polyA)、鸡beta-肌动蛋白启动子、DHFR基因、SV40  polyA信号序列的表达载体pGN的多克隆位点，形成重组的表达载体； 

③将重组表达载体转染动物细胞，并选出表达所述融合蛋白的宿主细胞；

④培养上一步骤中获得的宿主细胞，从而表达人前凝血酶-2；和

⑤ 分离纯化所述的人前凝血酶-2；和

⑥ 激活人前凝血酶-2，从而获得人凝血酶。

在另一优选例中，所述方法包括：经过阴离子柱和疏水柱纯化后，采用纯化的重组ecarin激活，再经亲和纯化和凝胶过滤层析后，高产率地获得高比活性的重组人凝血酶。

在另一优选例中，在步骤③中，所述的细胞是dhfr基因缺陷的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)，并且通过MTX加压选出表达融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞可高表达编码蛋白质(人前凝血酶-2)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pc-PT2和th-PT2电泳图谱。其中，各泳道如下：1，2分别为pc-PT2和th-PT2 PCR电泳结果，3为分子量标准。

图2显示了pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2质粒酶切电泳图谱。其中，各泳道如下：1，2分别为pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2酶切电泳结果,3为分子量标准。

图3显示了pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2质粒构建图谱。其中，“pUC19 backbone”表示pUC19骨架；“promoter”表示启动子。

图4显示了不同筛选压力下两种前凝血酶表达细胞株表达情况比较。

图5显示了SDS-PAGE电泳检测5 L细胞反应器培养上清中重组人前凝血酶2随时间变化的累积量。其中，各泳道如下：1.培养5天上清；2.培养6天上清；3.培养7天上清；4.培养8天上清；5.培养9天上清；6.培养10天上清；7.培养11天上清；8.培养12天上清；9. 对照品。

图6显示了ELISA检测5 L细胞反应器培养上清中重组人前凝血酶2随时间变化的累积量。

图7显示了pGN/ecarin的质粒图谱。

图8显示了dot-blot检测900 nM ecarin蛋白的表达。+为阳性对照品(300 ng)，-为阴性对照(Excell-302培养基)。

图9显示了ecarin的中试电泳图。其中，各泳道如下：2-9分别为伊卡因生物反应器生产第1、7、8到13天样品。

图10显示了伊卡因的纯化结果。其中，泳道1为分子量标准，泳道2为Ecarin。

图11显示了重组人前凝血酶-2活化图谱。各泳道如下：1，2分别为活化前和活化后的人前凝血酶-2;3为分子量标准。

图12显示了凝血酶的活性检测-酶切含有凝血酶酶切位点的目的蛋白。各泳道如下：1为使用牛凝血酶，2为使用与牛凝血酶相同活性单位的ecarin活化重组人凝血酶(其活性单位由实例13中检测方法确定)。3为未酶切前的目标蛋白，该蛋白含有凝血酶识别位点。

图13显示了纯化终产品SDS-PAGE图谱。各泳道如下：1．凝血酶(还原型，5微克)；2．分子量标准；3．凝血酶(非还原型，5微克)。

图14显示了SEC-HPLC检测凝血酶纯化、激活终产品纯度大于95%。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，本发明采用基因工程技术，将人蛋白C信号肽与prethrombin-2嵌合基因在pGN高效表达载体系统和CHO细胞中，其表达水平显著提高了约3倍。此外，还采用优化的生产纯化和激活工艺，提高了重组人凝血酶最终得率。在此基础上完成了本发明。本发明方法制备的重组人凝血酶可成为用于临床治疗，成为安全有效的药品。

此外，本发明还提供了被该表达载体转化的动物细胞；提供了一种利用该转化后所产生的表达重组人凝血酶的细胞株；以及提供了生产、活化和纯化人凝血酶的工艺。

 

在本发明中，编码重组人凝血酶的融合基因以及其他元件(如启动子、标记基因、polyA序列、间隔序列)的核苷酸全长序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。以融合基因为例，对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列片段。然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

通常，将获得的用于构成本发明表达盒的各元件，按正确的顺序连接在一起，就可形成本发明的表达盒。然后，将本发明的表达盒插入常规的或市售的表达载体，即可形成本发明的表达载体。

本发明的适合在动物细胞中高效表达人重组人凝血酶的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞宜为动物细胞等。优选的宿主细胞是肾细胞、CHO，更佳地，宿主细胞是CHO细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

哺乳动物细胞系的合适培养液和培养方法是本领域熟知的，例如可见US5,633,162中的描述。用于实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需要的标准细胞培养液的例子包括但不限于：Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640培养液(Morre,G,The journal of the American Medical Association,199:519,1967)、L-15培养液(Leibovitz,A等，Amer.J.of Hygiene,78:173,1963)、Dulbecco改良Eagle培养液、Eagle最简单基础培养液(Eagle’s minimal essential medium,MEM)、Ham F12培养液(Ham,R等,Proc.Natl.Acad.Sc.53:288,1965)或缺少白蛋白、运铁蛋白和卵磷脂的Iscoves改良DMEM(Iscoves等，J.Exp.med.1:923,1978)。例如，Ham F10或F12培养液是专门为CHO细胞培养设计的。特别适合于CHO细胞培养的其它培养液见EP-481 791中所述。已知此类培养液中可增添胎牛血清(FBS,也称为胎小牛血清FCS)，后者提供了天然来源的丰富激素和生长因子。目前哺乳动物细胞的培养是常规操作，在科学教科书和手册中有全面的描述，细节可参见R.Ian Fresney,《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.,2000。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点包括：本发明的融合基因可高效地在动物细胞中表达重组人前凝血酶，用于构建和获得高表达重组人凝血酶的动物细胞株。另外，通过优化的纯化工艺，可以获得高比活的人凝血酶。所获得的活化凝血酶具有与商业产平同等或更高的生物活性,因此,可用于多种临床疾病的治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：人前凝血酶-2基因的制备

步骤一、

以抽提的人肝细胞mRNA为模板，以Oligo-dT为引物，采用逆转录的方式合成第一链cDNA。以cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。其引物序列如下：

引物1： tgctgcggatccgcaaacgtcgtaccgccaccagtgagta (SEQ ID NO: 11)；

引物2： atatgcggccgcctactctccaaactgatcaatga；(SEQ ID NO: 12)

引物3：tgctccagcgggtccggcgaaccgccaccagtgagtacca (SEQ ID NO: 13)

引物1含有人蛋白C信号肽C端序列和人前凝血酶-2 N端编码序列，引物2含有人前凝血酶-2 C端编码序列并引入NotⅠ酶切位点，其产物为含有人蛋白C信号肽部分序列和人前凝血酶-2完整编码区的嵌合基因，其序列如SEQ ID NO:1

引物3含有人凝血酶原信号肽c端和人前凝血酶-2 N端编码序列，引物2和引物3的扩增其产物为含有人凝血酶原信号肽和人前凝血酶-2完整编码区的嵌合基因，其序列见SEQ ID NO:2。

步骤二、

以人肝细胞cDNA为模板，以下列序列为引物合成人蛋白C信号肽

引物4： ataggtaccgccgccaccatgtggcagctcacaagcct (SEQ ID NO: 14)

引物5： tactcactggtggcggtacgacgtttgcggatccgcagca (SEQ ID NO: 15)

引物6：atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgt agccttgtgcacagc (SEQ ID NO: 16)

引物7：tggtactcactggtggcggt tcgccggacccgctggagca (SEQ ID NO: 17)

引物4和引物5为人蛋白C信号扩增引物，引物4引入KpnⅠ酶切位点，引物5含有人前凝血酶-2 N端序列，其产物为人蛋白C信号肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列如SEQ ID NO:3。

引物6和引物7为人凝血酶原信号肽扩增引物，引物6 为含有人凝血酶原信号肽N端序列并在5’端引入KpnⅠ酶切位点，引物7含有人前凝血酶-2 N端序列，其产物为人凝血酶原信号肽和人前凝血酶-2 N端序列的嵌合基因，其序列见SEQ ID NO:4。

步骤三、

以上述步骤一和步骤二的产物为模板,以引物3和引物2进行PCR，其产物序列如SEQ ID NO:5所述，在其两端分别引入KpnⅠ和NotⅠ酶切位点，其电泳结果可参见图1和图2。表达的pc-PT2融合蛋白的序列见SEQ ID NO:6。

以上述步骤1和步骤2的产物为模板,以引物5和引物2进行PCR，其产物序列如SEQ ID NO:7所述，在其两端分别引入KpnⅠ和NotⅠ酶切位点，其电泳结果可参见图1和图2。其表达的th-PT2融合蛋白序列见SEQ ID NO:8。

实施例2：人前凝血酶-2表达质粒的构建

扩增产物和pGN载体(见中国专利200910052576.1)分别以KpnⅠ和NotⅠ双酶切，纯化酶切产物后，以T4 DNA连接酶按连接扩增产物：pGN载体(摩尔比3：1)，连接成环。构建表达质粒pGN/pc-PT2和pGN/th-PT2,其质粒图谱见图3。

实施例3：利用动物细胞表达人前凝血酶-2

使用实施例2所述的表达质粒转染常规的DHFR缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞CHO DG44(G Urlaub等，somatic细胞，Mol. Genet., 12, p555-556,1986,以下称CHO)。

该细胞采用商业无血清Excell-302培养基(Sigma公司)加入次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)正常培养，转染采用电转染的方法，其过程如下所述：对数生长期的CHO细胞，在转染前24小时离心换液，用新鲜培养基重悬并吹打成单细胞悬液；转染时将细胞离心并按照10⁷细胞每毫升的密度重悬，取0.8 mL放入0.4 cm的电击杯中；加入200 微克的表达质粒pGN/pc-PT2或pGN/th-PT2，轻轻混匀，避免气泡产生；冰浴10分钟；电转染条件为电压300伏、电容975微法拉、电阻1000欧。电击结束后室温静置10分钟，转入含302培养基的培养瓶中，孵育箱培养。

转染后的细胞在连续培养12-14天后，用含20 nM的氨甲喋呤(MTX)的302培养基稀释和接种入96孔板。细胞生长到11-13天的时候，用间接ELISA的方法检测人前凝血酶-2的表达。

取表达较高的克隆株，进行进一步加压筛选。其流程为：将高表达的克隆株移到已经含有更高浓度MTX的96孔板孔中进行加压。用间接ELISA的方法检测人前凝血酶-2的表达。

重复这一步骤，逐渐提高MTX浓度。使用的MTX浓度为20、40、60、90、130、200、300、450、600、900 nM MTX。通过MTX浓度上升选出抗MTX的细胞株，用有限稀释法进行亚克隆制备，采用间接ELISA方法进行表达量检测。

实施例4：CHO细胞产生前凝血酶-2的水平

表达人前凝血酶-2的CHO细胞亚克隆株，包括pGN/pc-PT2质粒转染的细胞株和pGN/th-PT2质粒转染的细胞株，在市售的Excell-302培养基(Sigma公司)条件下，以2×10⁵/mL密度接种于直径10 cm的一次性培养皿，37度，5%CO₂，95%相对湿度进行培养。24小时计数细胞密度，取上清，离心用于ELISA检测。ELISA采用间接ELISA方法，其过程如下：

人α-凝血酶标准品按照1μg/mL为起始浓度，倍比稀释后每孔50μL的量包被在酶标板；取培养上清分别用PBS以不同稀释倍数稀释，按每孔50μL的量包被；包被采用pH9.6的0.1 M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液4度包被过夜；

弃去液体，用封闭液(含0.5%BSA的PBST)洗涤3次，然后加入用封闭液1:2000稀释的抗人α凝血酶单抗溶液100μL，37度孵育1小时；

弃去液体，用封闭液(含0.5%BSA的PBST)洗涤3次，然后加入用封闭液1:5000稀释的HRP标记的抗鼠IgG二抗溶液100μL，37度孵育1小时；

弃去液体，用封闭液(含0.5%BSA的PBST)洗涤3次，加入50μLTMB液体，显色15分钟，450 nm波长检测表达。

通过实验检测不同筛选浓度下的两种表达细胞株的人前凝血酶表达水平，其表达量结果见图4。其中，20到135 nM两个细胞均选取20株克隆进行比较；200到900 nM各选取10株克隆进行表达比较。可见采用蛋白C信号肽的pGN/pc-PT2质粒转染的细胞株比采用凝血酶自身信号肽的pGN/th-PT2质粒转染的细胞株表达明显增加。

经亚克隆后测定单细胞表达量，pGN/pc-PT2细胞株比pGN/th-PT2细胞株平均高2-3倍。其中前者表达较高的细胞株，pc-PT2 F3-C3细胞株的前凝血酶-2表达量为75 pg/c/d。这表明,利用蛋白C信号肽替代凝血酶自身信号肽可大大提高人前凝血酶-2在CHO细胞中的表达量.

实施例5：重组人前凝血酶CHO细胞的生物反应器培养

将高表达人前凝血酶-2的细胞株(F3-C2)细胞株在250mL转瓶中培养，其工作体积为50 mL；当细胞密度达到1×10⁶以后， 扩大培养到2 L转瓶，其工作体积为500mL。当细胞密度达到1×10⁶/mL、细胞活度高于95%的情况下，将细胞接种入5 L WAVE袋中。

WAVE系统采用GE的20/50系统，初始接种密度为4×10⁵细胞/mL、初始体积1升，其温度为37度、转速为12转、角度为6度、通气量为0.15 Lpm、溶氧设定60%、5%CO₂；按照fed-batch工艺，逐步增加培养基的量；一般情况下，每次增加上次培养基总体积的30-50%，在这个过程中调整角度、转速和通气量以维持溶氧，适当补碱以维持pH值，适当补糖以维持葡萄糖浓度。当细胞密度达到1×10⁶/mL以上时开始补加补料培养基，每升培养基每天补加10 mL补料培养基。当细胞密度达到3×10⁶/mL以上开始降温。细胞活率低于85%时停止生长，收集表达上清。上清离心后采用间接ELISA方法检测表达量。

结果：采用此工艺下，每升培养液可含有约300毫克的人前凝血酶-2。其电泳结果见图5，间接ELISA结果见图6。

实施例6：蛇毒伊卡因(ecarin)基因的制备

以文献(S. Nishida等，Biochemistry ,34, 1771-1778)报道的方法，以伊卡因cDNA为模板，通过特异性引物进行PCR扩增，并在两端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ，获得编码序列于报道完全相同的目的基因。其序列见SEQ ID NO:10。

实施例7：伊卡因表达质粒的构建

将上一实施例中获得的伊卡因扩增产物和pGN载体(见中国专利200910052576.1)分别以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，纯化酶切产物后，以T4 DNA连接酶按连接扩增产物：pGN载体摩尔比3：1比例连接成环。构建表达质粒pGN/ecarin，质粒图谱见图7。

实施例8：利用动物细胞表达伊卡因

使用实施例7所述的表达质粒pGN/ecarin转染CHO DG44。转染采用电转染的方法，其过程如下所述：对数生长期的CHO细胞，在转染前24小时离心换液，用新鲜培养基重悬并吹打成单细胞悬液；转染时将细胞离心并按照10⁷细胞每毫升的密度重悬，取0.8 mL放入0.4cm的电击杯中；加入200 微克的表达质粒pGN/ecarin，轻轻混匀，避免气泡产生；冰浴10分钟；电转染条件为电压300伏、电容975微法拉、电阻1000欧。电击结束后室温静置10分钟，转入含新鲜培养基的培养瓶中，孵育箱培养。

转染后的细胞在氨甲喋呤(MTX)的302培养基中加压筛选。逐渐提高MTX筛选浓度。使用的筛选浓度为20、40、60、90、130、200、300、450、600、900 nM MTX。筛选最终浓度所得的细胞株，用有限稀释法进行亚克隆制备，采用dot-blot方法进行表达量检测。

结果获得了多株表达伊卡因的细胞株，其如图8所示。 采用dot-blot检测900 nM ecarin蛋白的表达，+为阳性对照品(300ng)，-为阴性对照(Excell-302培养基)。每一纵列均为一个细胞株，可见第2、4、6列细胞表达量较高。

实施例9：CHO细胞产生伊卡因的绩效

表达伊卡因的CHO细胞亚克隆株(2F8-C8)，在Excell-302培养基条件下，以2×10⁵/mL密度接种于10 cm一次性培养皿，37度，5%CO₂，95%相对湿度进行培养。24小时计数细胞密度，取上清，离心用于伊卡因酶学活性检测。其酶学活性检测方法见实施例13，检测可见其表达量为4.5μU/c/d。

实施例10：重组伊卡因在生物反应器中的生产

将高表达伊卡因的细胞株扩大培养，培养基采用Ex-cell302培养基。起始在250 mL转瓶中培/养，其工作体积为50 mL；当细胞密度达到1×10⁶/mL以后， 扩大培养到2 L转瓶，其工作体积为500 mL。当细胞密度达到1×10⁶/mL、细胞活度高于95%的情况下，将细胞接种入5 升 WAVE袋子中。

WAVE系统采用GE的20/50系统，初始接种密度为4×10⁵cells/mL、初始体积1升，其温度为37度、转速为12 转、角度为6度、通气量为0.15 升每分、溶氧设定60%、5%CO₂；按照fed-batch工艺，逐步增加培养基的量；一般情况下，每次增加上次培养基总体积的30-50%，在这个过程中调整角度、转速和通气量以维持溶氧，适当补碱以维持pH值，适当补糖以维持葡萄糖浓度。当细胞密度达到1×10⁶以上时开始补加补料培养基，每升培养基每天补加10 mL补料培养基。当细胞密度达到3×10⁶/mL以上开始降温。细胞活率低于85%时停止生长，收集表达上清。上清离心后检测其酶学活性，发现在此工艺下，每升含有伊卡因20U/mL。其电泳结果见图9。

实施例11：重组伊卡因的纯化

纯化方法如下：

收集含有伊卡因的细胞培养上清，10000 rpm离心20min，取上清；

用10 mM Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡DEAE-sepharose，将离心培养上清按照120 cm/h上样，当基线冲洗至平稳时；按照0至1 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有伊卡因的样品；

用50%饱和度硫酸铵的10 mM Tris-HCl pH8.0溶液平衡phenyl-sepharose，将DEAE收集样品加入50%饱和度硫酸铵，完后按照120 cm/h上样，用50%饱和度硫酸铵的10 mM Tris-HCl pH8.0溶液冲洗至基线平稳后；按照50%至0% 10 mM Tris-HCl pH8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有伊卡因的样品。

结果获得的高纯度的伊卡因，其电泳结果见图10。

实施例12：重组凝血酶的纯化和激活

方法如下：

收集含有重组凝血酶的细胞培养上清，10000 rpm离心20min，取上清；

用10 mM Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡DEAE-sepharose，将离心培养上清按照120 cm/h上样，当基线冲洗至平稳时；按照0至1 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组人前凝血酶-2的样品；

用50%饱和度硫酸铵的10 mM Tris-HCl pH8.0溶液平衡Phenyl-sepharose，将DEAE收集样品加入50%饱和度硫酸铵，完后按照120 cm/h上样，用50%饱和度硫酸铵的10 mM Tris-HCl pH8.0溶液冲洗至基线平稳后；按照50%至0%10 mM Tris-HCl pH8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组人前凝血酶-2的样品；

按照6.5U/mL的比例向重组人前凝血酶-2溶液中加入伊卡因，于37℃孵育16小时；

用0.15 M NaCl，10 mM PB pH 8.0溶液平衡Blue-sepharose，将孵育激活后样品按照120 cm/h上样；当基线冲洗至平稳时，按照0%至70%乙二醇，0.5 M NaCl，10 mM PB pH 8.0，10个柱体积条件梯度洗脱(120 cm/h)，收集含有重组凝血酶的样品；

用0.2 M NaCl，10 mM PB pH 8.0溶液平衡sephacryl S-200，将Blue洗脱样品按照24 cm/h上样后洗脱，收集含有重组凝血酶的样品。

结果：

Ecarin活化人前凝血酶-2的电泳结果见图11。活化后的重组人凝血酶，用实施例13的方法检测其凝血酶活性，并酶切本公司自产的含有凝血酶酶切位点的目的蛋白以验证其酶切活性(图12)。 

最后纯化的样品经SDS-PAGE电泳、HPLC分析可见其纯度大于95%，结果如图13-14。 

纯化的重组人凝血酶经序列测定，其氨基酸序列同天然人α-凝血酶相同。其蛋白序列见SEQ ID NO:18。

实施例13：重组α-凝血酶酶学特性

上述实施例中的凝血酶和伊卡因活性检测方法如下：

①凝血酶活性检测：

采用纤维蛋白原凝固法检测人重组凝血酶活性。所用标准品为凝血酶国家标准品，上海生物制品研究所制备。取不同稀释度的标准品或样品0.1mL，置测定杯中，37度孵育2分钟；加入3 mg/mL的纤维蛋白原 0.4 mL，记录凝固时间。用4,4平行线法计算效价。

经测定得Ecarin完全活化后的人凝血酶比活性为3200 U/mg。

②伊卡因活性检测：

在纯化后的人前凝血酶-2中，加入相同体积、不同浓度的Ecarin(sigma公司)和待测样品，37度酶切4 h。加入EDTA终止反应。取终止反应后的样品，按照步骤(1)的方法进行凝血酶活性测定。用标定的标准Ecarin定量样品蛋白活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

 

<110>  苏州泽璟生物制药有限公司

 

<120>  一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法

 

<130>  P2011-0037

 

<160>  18   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  962

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  含人蛋白C信号肽C端序列和人前凝血酶-2 N端的扩增产物

 

<400>  1

tgctgcggat ccgcaaacgt cgtaccgcca ccagtgagta ccagactttc ttcaatccga       60

ggacctttgg ctcgggagag gcagactgtg ggctgcgacc tctgttcgag aagaagtcgc      120

tggaggacaa aaccgaaaga gagctcctgg aatcctacat cgacgggcgc attgtggagg      180

gctcggatgc agagatcggc atgtcacctt ggcaggtgat gcttttccgg aagagtcccc      240

aggagctgct gtgtggggcc agcctcatca gtgaccgctg ggtcctcacc gccgcccact      300

gcctcctgta cccgccctgg gacaagaact tcaccgagaa tgaccttctg gtgcgcattg      360

gcaagcactc ccgcaccagg tacgagcgaa acattgaaaa gatatccatg ttggaaaaga      420

tctacatcca ccccaggtac aactggcggg agaacctgga ccgggacatt gccctgatga      480

agctgaagaa gcctgttgcc ttcagtgact acattcaccc tgtgtgtctg cccgacaggg      540

agacggcagc cagcttgctc caggctggat acaaggggcg ggtgacaggc tggggcaacc      600

tgaaggagac gtggacagcc aacgttggta aggggcagcc cagtgtcctg caggtggtga      660

acctgcccat tgtggagcgg ccggtctgca aggactccac ccggatccgc atcactgaca      720

acatgttctg tgctggttac aagcctgatg aagggaaacg aggggatgcc tgtgaaggtg      780

acagtggggg accctttgtc atgaagagcc cctttaacaa ccgctggtat caaatgggca      840

tcgtctcatg gggtgaaggc tgtgaccggg atgggaaata tggcttctac acacatgtgt      900

tccgcctgaa gaagtggata cagaaggtca ttgatcagtt tggagagtag gcggccgcat      960

at                                                                     962

 

<210>  2

<211>  944

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  含人凝血酶原信号肽C端和人前凝血酶-2 N端的扩增产物

 

<400>  2

tgctccagcg ggtccggcga accgccacca gtgagtacca gactttcttc aatccgagga       60

cctttggctc gggagaggca gactgtgggc tgcgacctct gttcgagaag aagtcgctgg      120

aggacaaaac cgaaagagag ctcctggaat cctacatcga cgggcgcatt gtggagggct      180

cggatgcaga gatcggcatg tcaccttggc aggtgatgct tttccggaag agtccccagg      240

agctgctgtg tggggccagc ctcatcagtg accgctgggt cctcaccgcc gcccactgcc      300

tcctgtaccc gccctgggac aagaacttca ccgagaatga ccttctggtg cgcattggca      360

agcactcccg caccaggtac gagcgaaaca ttgaaaagat atccatgttg gaaaagatct      420

acatccaccc caggtacaac tggcgggaga acctggaccg ggacattgcc ctgatgaagc      480

tgaagaagcc tgttgccttc agtgactaca ttcaccctgt gtgtctgccc gacagggaga      540

cggcagccag cttgctccag gctggataca aggggcgggt gacaggctgg ggcaacctga      600

aggagacgtg gacagccaac gttggtaagg ggcagcccag tgtcctgcag gtggtgaacc      660

tgcccattgt ggagcggccg gtctgcaagg actccacccg gatccgcatc actgacaaca      720

tgttctgtgc tggttacaag cctgatgaag ggaaacgagg ggatgcctgt gaaggtgaca      780

gtgggggacc ctttgtcatg aagagcccct ttaacaaccg ctggtatcaa atgggcatcg      840

tctcatgggg tgaaggctgt gaccgggatg ggaaatatgg cttctacaca catgtgttcc      900

gcctgaagaa gtggatacag aaggtcattg atcagtttgg agag                       944

 

<210>  3

<211>  126

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  含人蛋白C信号的扩增产物

 

<400>  3

atgtggcagc tcacaagcct cctgctgttc gtggccacct ggggaatttc cggcacacca       60

gctcctcttg actcagtgtt ctccagcagc gagcgtgccc accaggtgct gcggatccgc      120

aaacgt                                                                 126

 

<210>  4

<211>  129

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  含人凝血酶原信号肽的扩增产物

 

<400>  4

atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct ggctgcctgg ccctggctgc cctgtgtagc       60

cttgtgcaca gccagcatgt gttcctggct cctcagcaag cacggtcgct gctccagcgg      120

gtccggcga                                                              129

 

<210>  5

<211>  1068

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  pc-PT2融合蛋白的编码序列

 

<400>  5

atgtggcagc tcacaagcct cctgctgttc gtggccacct ggggaatttc cggcacacca       60

gctcctcttg actcagtgtt ctccagcagc gagcgtgccc accaggtgct gcggatccgc      120

aaacgtcgta ccgccaccag tgagtaccag actttcttca atccgaggac ctttggctcg      180

ggagaggcag actgtgggct gcgacctctg ttcgagaaga agtcgctgga ggacaaaacc      240

gaaagagagc tcctggaatc ctacatcgac gggcgcattg tggagggctc ggatgcagag      300

atcggcatgt caccttggca ggtgatgctt ttccggaaga gtccccagga gctgctgtgt      360

ggggccagcc tcatcagtga ccgctgggtc ctcaccgccg cccactgcct cctgtacccg      420

ccctgggaca agaacttcac cgagaatgac cttctggtgc gcattggcaa gcactcccgc      480

accaggtacg agcgaaacat tgaaaagata tccatgttgg aaaagatcta catccacccc      540

aggtacaact ggcgggagaa cctggaccgg gacattgccc tgatgaagct gaagaagcct      600

gttgccttca gtgactacat tcaccctgtg tgtctgcccg acagggagac ggcagccagc      660

ttgctccagg ctggatacaa ggggcgggtg acaggctggg gcaacctgaa ggagacgtgg      720

acagccaacg ttggtaaggg gcagcccagt gtcctgcagg tggtgaacct gcccattgtg      780

gagcggccgg tctgcaagga ctccacccgg atccgcatca ctgacaacat gttctgtgct      840

ggttacaagc ctgatgaagg gaaacgaggg gatgcctgtg aaggtgacag tgggggaccc      900

tttgtcatga agagcccctt taacaaccgc tggtatcaaa tgggcatcgt ctcatggggt      960

gaaggctgtg accgggatgg gaaatatggc ttctacacac atgtgttccg cctgaagaag     1020

tggatacaga aggtcattga tcagtttgga gagtaggcgg ccgcatat                  1068

 

<210>  6

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  pc-PT2融合蛋白

 

<400>  6

Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile

1               5                   10                  15     

Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg

            20                  25                  30         

Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr

        35                  40                  45             

Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys

    50                  55                  60                 

Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu

65                  70                  75                  80 

Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser

                85                  90                  95      

Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys

            100                 105                 110        

Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp

        115                 120                 125             

Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn

    130                 135                 140                

Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr

145                 150                 155                 160

Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr

                165                 170                 175    

Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala

            180                 185                 190        

Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro

        195                 200                 205            

Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly

    210                 215                 220                

Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr

225                 230                 235                 240

Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu

                245                 250                 255    

Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile

            260                 265                 270        

Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg

        275                 280                 285            

Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser

    290                 295                 300                

Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu

305                 310                 315                 320

Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg

                325                 330                 335    

Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu

            340                 345                 350

 

<210>  7

<211>  1053

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  th-PT2融合蛋白的编码序列

 

<400>  7

atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct ggctgcctgg ccctggctgc cctgtgtagc       60

cttgtgcaca gccagcatgt gttcctggct cctcagcaag cacggtcgct gctccagcgg      120

gtccggcgaa ccgccaccag tgagtaccag actttcttca atccgaggac ctttggctcg      180

ggagaggcag actgtgggct gcgacctctg ttcgagaaga agtcgctgga ggacaaaacc      240

gaaagagagc tcctggaatc ctacatcgac gggcgcattg tggagggctc ggatgcagag      300

atcggcatgt caccttggca ggtgatgctt ttccggaaga gtccccagga gctgctgtgt      360

ggggccagcc tcatcagtga ccgctgggtc ctcaccgccg cccactgcct cctgtacccg      420

ccctgggaca agaacttcac cgagaatgac cttctggtgc gcattggcaa gcactcccgc      480

accaggtacg agcgaaacat tgaaaagata tccatgttgg aaaagatcta catccacccc      540

aggtacaact ggcgggagaa cctggaccgg gacattgccc tgatgaagct gaagaagcct      600

gttgccttca gtgactacat tcaccctgtg tgtctgcccg acagggagac ggcagccagc      660

ttgctccagg ctggatacaa ggggcgggtg acaggctggg gcaacctgaa ggagacgtgg      720

acagccaacg ttggtaaggg gcagcccagt gtcctgcagg tggtgaacct gcccattgtg      780

gagcggccgg tctgcaagga ctccacccgg atccgcatca ctgacaacat gttctgtgct      840

ggttacaagc ctgatgaagg gaaacgaggg gatgcctgtg aaggtgacag tgggggaccc      900

tttgtcatga agagcccctt taacaaccgc tggtatcaaa tgggcatcgt ctcatggggt      960

gaaggctgtg accgggatgg gaaatatggc ttctacacac atgtgttccg cctgaagaag     1020

tggatacaga aggtcattga tcagtttgga gag                                  1053

 

<210>  8

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  th-PT2融合蛋白

 

<400>  8

Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala

1               5                   10                  15     

Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln

            20                  25                  30         

Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Thr Ala Thr Ser Glu

        35                  40                  45             

Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp

    50                  55                  60                 

Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr

65                  70                  75                  80 

Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly

                85                  90                  95     

Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg

            100                 105                 110         

Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg

        115                 120                 125            

Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys

    130                 135                 140                 

Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg

145                 150                 155                 160

Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile

                165                 170                 175    

Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile

            180                 185                 190        

Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His

        195                 200                 205            

Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala

    210                 215                 220                

Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp

225                 230                 235                 240

Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn

                245                 250                 255    

Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg

            260                 265                 270        

Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys

        275                 280                 285            

Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys

    290                 295                 300                

Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly

305                 310                 315                 320

Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe

                325                 330                 335    

Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu

            340                 345                 350    

 

<210>  9

<211>  1851

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  伊卡因的编码序列

 

<400>  9

atgatccaga ttctcttggt aattatatgc ttagcagttt ttccatatca aggttgctct       60

ataatcctgg gatctgggaa tgttaatgat tatgaagtag tgtatccaca aaaagtcact      120

gcattgccca aaggagcagt tcagcagcct gagcaaaagt atgaagatgc catgcaatat      180

gaatttgaag tgaagggaga gccagtggtc cttcacctag aaaaaaataa agaacttttt      240

tcagaagatt acagtgagac tcattattcg tctgatgaca gagaaattac aacaaaccct      300

tcagttgagg atcactgcta ttatcatgga cggatccaga atgatgctga gtcaactgca      360

agcatcagtg catgcaatgg tttgaaagga catttcaagc ttcgagggga gacgtacttt      420

attgaaccct tgaagattcc cgacagtgaa gcccatgcag tctacaaata tgaaaacata      480

gaaaatgagg atgaagcccc caaaatgtgt ggggtaaccc aggataattg ggaatcagat      540

gaacccatca aaaagacttt ggggttaatt gttcctcctc atgaacgaaa atttgagaaa      600

aaattcattg agcttgtcgt agttgtggac cacagtatgg tcacaaaata caacaatgat      660

tcaactgcta taagaacatg gatatatgaa atgctcaaca ctgtaaatga gatatactta      720

cctttcaata ttcgtgtagc actggttggc ctagaatttt ggtgcaatgg agacttgatt      780

aacgtgacat ccacagcaga tgatactttg cactcatttg gagaatggag agcatcagat      840

ttgctgaatc gaaaaagaca tgatcatgct cagttactca cgaacgtgac actggatcat      900

tccactcttg gaatcacgtt cgtatatggc atgtgcaaat cagatcgttc tgtagaactt      960

attctggatt acagcaacat aacttttaat atggcatata taatagccca tgagatgggt     1020

catagtctgg gcatgttaca tgacacaaaa ttctgtactt gtggggctaa accatgcatt     1080

atgtttggca aagaaagcat tccaccgccc aaagaattca gcagttgtag ttatgaccag     1140

tataacaagt atcttcttaa atataaccca aaatgcattc ttgatccacc tttgagaaaa     1200

gatattgctt cacctgcagt ttgtggaaat gaaatttggg aggaaggaga agaatgtgat     1260

tgtggttctc ctgcagattg tcgaaatcca tgctgtgatg ctgcaacatg taaactgaaa     1320

ccaggggcag aatgtggaaa tggagagtgt tgtgacaagt gcaagattag gaaagcagga     1380

acagaatgcc ggccagcaag ggatgactgt gatgtcgctg aacactgcac tggccaatct     1440

gctgagtgtc ccagaaatga gttccaaagg aatggacaac catgccttaa caactcgggt     1500

tattgctaca atggggattg ccccatcatg ttaaaccaat gtattgctct ctttagtcca     1560

agtgcaactg tggctcaaga ttcatgtttt cagaggaact tgcaaggcag ttactatggc     1620

tactgcacaa aggaaattgg ttactatggt aaaaggtttc catgtgcacc acaagatgta     1680

aaatgtggca gattatactg cttagataat tcattcaaaa aaaatatgcg ttgcaagaac     1740

gactattcat acgcggatga aaataaggga atagttgaac ctggaacaaa atgtgaagat     1800

ggaaaggtct gcatcaacag gaagtgtgtt gatgtgaata cagcctacta a              1851

 

<210>  10

<211>  616

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  伊卡因蛋白

 

<400>  10

Met Ile Gln Ile Leu Leu Val Ile Ile Cys Leu Ala Val Phe Pro Tyr

1               5                   10                  15     

Gln Gly Cys Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu

            20                  25                  30         

Val Val Tyr Pro Gln Lys Val Thr Ala Leu Pro Lys Gly Ala Val Gln

        35                  40                  45             

Gln Pro Glu Gln Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr Glu Phe Glu Val

    50                  55                  60                 

Lys Gly Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn Lys Glu Leu Phe

65                  70                  75                  80 

Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Ser Asp Asp Arg Glu Ile

                85                  90                  95     

Thr Thr Asn Pro Ser Val Glu Asp His Cys Tyr Tyr His Gly Arg Ile

            100                 105                 110        

Gln Asn Asp Ala Glu Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala Cys Asn Gly Leu

        115                 120                 125            

Lys Gly His Phe Lys Leu Arg Gly Glu Thr Tyr Phe Ile Glu Pro Leu

    130                 135                 140                

Lys Ile Pro Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys Tyr Glu Asn Ile

145                 150                 155                 160

Glu Asn Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val Thr Gln Asp Asn

                165                 170                 175    

Trp Glu Ser Asp Glu Pro Ile Lys Lys Thr Leu Gly Leu Ile Val Pro

            180                 185                 190        

Pro His Glu Arg Lys Phe Glu Lys Lys Phe Ile Glu Leu Val Val Val

        195                 200                 205            

Val Asp His Ser Met Val Thr Lys Tyr Asn Asn Asp Ser Thr Ala Ile

    210                 215                 220                

Arg Thr Trp Ile Tyr Glu Met Leu Asn Thr Val Asn Glu Ile Tyr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Phe Asn Ile Arg Val Ala Leu Val Gly Leu Glu Phe Trp Cys Asn

                245                 250                 255     

Gly Asp Leu Ile Asn Val Thr Ser Thr Ala Asp Asp Thr Leu His Ser

            260                 265                 270        

Phe Gly Glu Trp Arg Ala Ser Asp Leu Leu Asn Arg Lys Arg His Asp

        275                 280                 285             

His Ala Gln Leu Leu Thr Asn Val Thr Leu Asp His Ser Thr Leu Gly

    290                 295                 300                

Ile Thr Phe Val Tyr Gly Met Cys Lys Ser Asp Arg Ser Val Glu Leu

305                 310                 315                 320

Ile Leu Asp Tyr Ser Asn Ile Thr Phe Asn Met Ala Tyr Ile Ile Ala

                325                 330                 335    

His Glu Met Gly His Ser Leu Gly Met Leu His Asp Thr Lys Phe Cys

            340                 345                 350        

Thr Cys Gly Ala Lys Pro Cys Ile Met Phe Gly Lys Glu Ser Ile Pro

        355                 360                 365            

Pro Pro Lys Glu Phe Ser Ser Cys Ser Tyr Asp Gln Tyr Asn Lys Tyr

    370                 375                 380                

Leu Leu Lys Tyr Asn Pro Lys Cys Ile Leu Asp Pro Pro Leu Arg Lys

385                 390                 395                 400

Asp Ile Ala Ser Pro Ala Val Cys Gly Asn Glu Ile Trp Glu Glu Gly

                405                 410                 415    

Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asp Cys Arg Asn Pro Cys Cys

            420                 425                 430        

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Lys Pro Gly Ala Glu Cys Gly Asn Gly

        435                 440                 445            

Glu Cys Cys Asp Lys Cys Lys Ile Arg Lys Ala Gly Thr Glu Cys Arg

    450                 455                 460                

Pro Ala Arg Asp Asp Cys Asp Val Ala Glu His Cys Thr Gly Gln Ser

465                 470                 475                 480

Ala Glu Cys Pro Arg Asn Glu Phe Gln Arg Asn Gly Gln Pro Cys Leu

                485                 490                 495    

Asn Asn Ser Gly Tyr Cys Tyr Asn Gly Asp Cys Pro Ile Met Leu Asn

            500                 505                 510        

Gln Cys Ile Ala Leu Phe Ser Pro Ser Ala Thr Val Ala Gln Asp Ser

        515                 520                 525            

Cys Phe Gln Arg Asn Leu Gln Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Cys Thr Lys

    530                 535                 540                

Glu Ile Gly Tyr Tyr Gly Lys Arg Phe Pro Cys Ala Pro Gln Asp Val

545                 550                 555                 560

Lys Cys Gly Arg Leu Tyr Cys Leu Asp Asn Ser Phe Lys Lys Asn Met

                565                 570                 575    

Arg Cys Lys Asn Asp Tyr Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Lys Gly Ile Val

            580                 585                 590        

Glu Pro Gly Thr Lys Cys Glu Asp Gly Lys Val Cys Ile Asn Arg Lys

        595                 600                 605            

Cys Val Asp Val Asn Thr Ala Tyr

    610                 615    

 

<210>  11

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  11

tgctgcggat ccgcaaacgt cgtaccgcca ccagtgagta                             40

 

<210>  12

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  12

atatgcggcc gcctactctc caaactgatc aatga                                  35

 

<210>  13

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  13

tgctccagcg ggtccggcga accgccacca gtgagtacca                             40

 

<210>  14

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  14

ataggtaccg ccgccaccat gtggcagctc acaagcct                               38

 

<210>  15

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  15

tactcactgg tggcggtacg acgtttgcgg atccgcagca                             40

 

<210>  16

<211>  72

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct ggctgcctgg ccctggctgc cctgtgtagc       60

 

cttgtgcaca gc                                                           72

 

<210>  17

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  引物

 

<400>  17

tggtactcac tggtggcggt tcgccggacc cgctggagca                             40

 

<210>  18

<211>  308

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<223>  伊卡因蛋白的氨基酸序列

 

<400>  18

Thr Ala Thr Ser Glu Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly

1               5                   10                  15     

Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser

            20                  25                  30         

Leu Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly

        35                  40                  45             

Arg Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln

    50                  55                  60                  

Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser

65                  70                  75                  80 

Leu Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr

                85                  90                  95     

Pro Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile

            100                 105                 110        

Gly Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser

        115                 120                 125             

Met Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn

    130                 135                 140                

Leu Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe

145                 150                 155                 160

Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala

                165                 170                 175    

Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn

            180                 185                 190        

Leu Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val

        195                 200                 205            

Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp

    210                 215                 220                

Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys

225                 230                 235                 240

Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly

                245                 250                 255    

Pro Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly

            260                 265                 270        

Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe

        275                 280                 285            

Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp

    290                 295                 300                

Gln Phe Gly Glu

305