对辛伐他汀合成表现出改善性质的LovD突变体

摘要

本文公开的发明涉及用于制备辛伐他汀和相关化合物如胡伐他汀的方法和材料。本公开具体教导LovD酰基转移酶多肽的变体可经工程改造以显示促进其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀的性质。设计本文所述材料和方法从而能用最少改动将现有产洛伐他汀的发酵设施转化为制备辛伐他汀和相关化合物。

说明书

政府资助的声明

本发明是在政府支持下由国立卫生研究院(National Institutes of Health) 授予的基金号HL091197资助完成。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请根据119(e)条款要求2009年10月8日提交的美国临时申请序 列第61/249,894号的优先权，其内容通过引用纳入本文。本申请涉及国际 申请号PCT/US2007/012362（国际公开号WO 2007/139871)，其内容通过引 用纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用 微生物宿主的过程。

发明背景

辛伐他汀是可分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物 洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇药，能显著 降低成人的心脏病风险。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分别 作为美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)销售。辛伐他汀是洛伐他汀的更强效 衍生物，并在2005年是美国第二畅销药物，单在美国就有45亿美元的预 期销售。

土曲霉(A.terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(参见例如，J. Kennedy,K.等，Science,1999,284,1368-1372；和C.R.Hutchinson,J.等， Antonie Van Leeuwenhoek 2000,78,287-295)此前已有描述(参见例如，美国 专利号6,391,583，其内容通过引用纳入本文)。在所述基因簇中编码的是 46kD的蛋白质LovD，该蛋白最初鉴定为酯酶同系物。洛伐他汀生物合成 的直接前体红麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB组装 (参见例如，L.Hendrickson,C.R.等，Chem.Biol.1999,6,429-439)，(该酶 也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰基还原酶LovC和CYP450氧化 酶。五碳单元侧链由LovF(洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通过乙酰-CoA和 丙二酰-CoA之间的缩合合成。缩合的二酮由单独LovF结构域进行甲基化 和还原性修饰产生共价连接于LovF酰基载体蛋白(ACP)结构域的磷酸泛酰 巯基乙胺臂上的α-S-甲基丁酰基硫酯(参见例如，J.Kennedy,K.等，Science, 1999,284,1368-1372和C.R.Hutchinson,J.等，Antonie Van Leeuwenhoek 2000,78,287-295)，随后从红麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中灭活LovD 或LovF导致前体红麴素J的积累(参见例如，J.Kennedy,K.等，Science,1999, 284,1368-1372和C.R.Hutchinson,J.等，Antonie Van Leeuwenhoek 2000,78, 287-295)。

一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中经发酵制得，可从洛伐他汀 生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀经 土曲霉宿主的发酵获得。纯化该化合物后，如下进行半合成：1)2-甲基丁 酯侧臂可在碱的存在下水解产生中间体红麴素J；2)将游离酸内酯化；3)将 C13处的醇官能团用保护基团(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保护；4)将显露 的C8醇用酰基底物如2-二甲基丁酰氯酯化产生C13保护形式的辛伐他汀； 以及5)将C13 OH去保护产生辛伐他汀。

此前已描述辛伐他汀的各种多步合成(参见例如，PCT WO 2005/066150 和美国申请号20050080275与20040068123，其内容通过引用纳入本文)。 例如，广泛采用的方法始于洛伐他汀中C8酯的水解产生三醇红麴素J，然 后选择性硅烷化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并使C13醇去保护产 生辛伐他汀(参见例如，W.F.Hoffman,等，J.Med.Chem.1986,29,849-852)。 已研究用脂肪酶和酯酶来酶促转化作为化学衍生的替代(参见例如，PCT  WO 2005/040107，PCT WO 94/26920和T.G.Schimmel等，Appl.Environ. Microbiol.1997,63,1307-1311，其内容通过引用纳入本文)。但是，区域选 择性酯化的要求总是涉及其它醇基团的保护且常引起总体得率降低。因此， 能选择性酰化红麴素J的C8的特异性试剂对于辛伐他汀和其它他汀类似物 的有效合成很重要。

上述方案的变形常见，但是大多数过程总是涉及首先分离洛伐他汀， 水解甲基丁酯侧链，保护游离醇，与酰基底物反应，以及去保护。尽管涉 及的化学转化相对简单，但它们低效且涉及多个步骤，并因此造成目前制 备辛伐他汀的高成本(每颗药3美元)。为此，非常需要能促进高成本效率制 备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料。

发明内容

如下文详述，现可用LovD酰基转移酶多肽的变体在体外或体内产生 辛伐他汀和相关化合物，所述变体经工程改造以显示促进其用于生成辛伐 他汀和/或胡伐他汀(huvastatin)的性能。本文所述材料和方法设计成使得能 用最少改动将现有洛伐他汀制备的发酵设施转化为制备辛伐他汀和相关化 合物。

本发明的实施方式提供设计用于利用制备洛伐他汀的生物方法来制备 洛伐他汀的衍生物辛伐他汀的方法和材料。本发明还提供设计用于利用制 备洛伐他汀的生物方法来制备相关化合物如普伐他汀衍生物胡伐他汀的方 法和材料。本发明的实施方式包括的材料和方法可用于产生辛伐他汀而无 需目前用来产生该化合物的多个化学合成步骤。本发明的典型实施方式不 需要第一步先纯化洛伐他汀然后进一步半合成过程，而是在发酵过程中联 用LovD酰基转移酶多肽的变体和酰基硫酯化合物来产生辛伐他汀和/或胡 伐他汀的制备。

本文公开的发明有多种实施方式。本发明的一种说明性实施方式是 SEQ ID NO:1所示LovD多肽的变体，所述LovD多肽变体包含至少一种特 定氨基酸取代，例如A10V；D12G；K26E；C40A；C60N；A86V；H161Y； A190T；K227R；G275S；V334D；V334F和/或L361M。本发明的一种相 关实施方式是SEQ ID NO:1所示LovD多肽的变体，该LovD多肽的变体包 含一组氨基酸取代，例如一组至少3个氨基酸的取代：在C40和C60位置 氨基酸残基处的取代，和在下组氨基酸残基位置处的另外至少一种取代： A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275；V334；或L361。LovD 多肽的此类取代变体中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO:1所示LovD多 肽上氨基酸残基位置处未见的19种氨基酸中任一种。通常，所述取代变体 与SEQ ID NO:1所示LovD多肽相比呈现一种或多种改变的性质，例如聚 集减少；热稳定性改善；催化活性改善；k_cat/K_m值改善；可溶表达水平改 善；和/或25°C下的全细胞活性改善。

如上所述，本发明的某些实施方式包括氨基酸取代的特定构象。例如， 本发明的一些实施方式中，LovD多肽变体包含以下各组位置的氨基酸取 代：氨基酸残基位置C40、C60和A86；或氨基酸残基位置C40、C60、A86 和A190；或氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86和G275；或氨基酸残 基位置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275；或氨基酸残基 位置C40、C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190和G275；或 氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86、A190和G275；或氨基酸残基位 置C40、C60、A10、D12、K26、A86、A190和G275；或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、K26、A86、A190和G275；或氨基酸残基位置C40、C60、 D12、K26、A86、H161、A190、G275、V334和L361；或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275和V334。这些变体的具 体说明性实施方式包括具有下列氨基酸取代的变体：D12G、C40A、C60N、 A86V、A190T和G275S；或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、 A190T和G275S；或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T； G275S和V334F。

本发明的实施方式包括编码本文所述取代变体的多核苷酸，例如，与 编码本文所述LovD多肽变体的多核苷酸具有至少95%-100%序列相同性的 已分离多核苷酸。本发明的相关实施方式包括含这些多核苷酸的载体(例 如，包括含控制序列的表达载体，所述控制序列被转化有所述载体的宿主 细胞所识别)以及含此类载体的宿主细胞。所述宿主细胞可选为大肠杆菌 (Escherichia coli)，土曲霉(Aspergillus terreus)，红色红曲菌(Monascus  ruber)，紫红色红曲菌(Monascus purpureus)，丛毛红曲菌(Monascus pilosus)， 玻璃质红曲菌(Monascus vitreus)，软毛红曲菌(Monascus pubigerus)，卡氏念 珠菌(Candida cariosilognicola)，米曲霉(Aspergillus oryzea)，斯梯蒙特皮真 菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏拟青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉 (Penicillum citrinum)，产黄青霉(Penicillin chrysogenum)，短尾帚霉 (Scopulariopsis brevicaulis)，粗糙链孢霉(Neurospora crassa)或绿色木霉 (Trichoderma viride)。本发明的相关实施方式是制备LovD多肽变体的方法， 包括将转化有LovD多肽变体编码子的宿主细胞在适于表达多肽的条件下 培养，从而产生LovD多肽变体。在本发明的某些实施方式中，LovD多肽 变体可融合异源氨基酸序列，例如能促进其处理的序列(例如，多组氨酸序 列)。

本发明的另一实施方式是SEQ ID NO:1所示LovD多肽变体的制备方 法，其包括：利用多核苷酸诱变方法产生LovD多核苷酸的突变体群；表 达由所述LovD多核苷酸的突变体群所编码的LovD多肽变体群；从而制备 LovD多肽的变体。所述多核苷酸诱变方法可选为饱和诱变或易错聚合酶链 反应法。本发明的这些实施方式通常包括筛选所述LovD多肽变体的一个 或多个成员以鉴定出与SEQ ID NO:1所示LovD多肽相比具有以下性质的 变体：聚集减少；热稳定性改善；酰基转移酶活性改善；kcat/Km值改善； 可溶表达水平改善；和/或25°C下的全细胞活性改善。所述多核苷酸诱变过 程可选为受控过程，从而在编码以下氨基酸残基位置的密码子处产生取代 突变：A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275；V334；和/或 L361。在本发明的相关实施方式中，所述多核苷酸诱变过程受控从而产生 的变体包含C40A与C60N；以及在编码以下氨基酸残基位置的密码子处的 其它取代突变：A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275；V334； 和/或L361。

本发明的另一实施方式是制备辛伐他汀的方法，其包括以下步骤：混 合红麴素J；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8 羟基的酰基硫酯；和SEQ ID NO:1所示LovD酰基转移酶多肽的某变体， 所述LovD酰基转移酶多肽变体包括以下残基位置的至少一个氨基酸取代： A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275；V334或L361；然后 允许所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯的酰基以区域选择性酰化红麴 素J的C8羟基；从而制得辛伐他汀。在本发明的某些实施方式中，在发酵 培养基中混合红麴素J；酰基硫酯和LovD多肽变体，所述培养基中存在产 生所述LovD酰基转移酶的分离生物体，其中所述分离生物体为以下至少 一种：土曲霉；不表达SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土曲霉；大肠杆菌； 或不表达SEQ ID NO:4所示bioH多肽的大肠杆菌。可选在此类实施方式 中，酰基硫酯选自丁酰基硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基-巯基乙酸硫酯， 包含中等链长(C3-C6)酰基部分和/或能跨越生长在发酵培养基中的大肠杆 菌或土曲霉细胞的细胞膜的酰基硫酯(例如，α-二甲基丁酰基-S-甲基-巯基丙 酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰基-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二 甲基丁酰基-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)及二甲基丁酰基-S-甲基-巯基 丁酸酯(DMB-S-MMB))。

在制备辛伐他汀的方法中，所述分离的生物体可以生长于至少一种以 下条件：温度为25-40°C；持续时间为至少4到至少48小时；pH为7-8； 和/或在含LB、F1或TB培养基的发酵基质中。所述方法可选进一步包含 通过至少一个纯化步骤来纯化由所述方法制得的辛伐他汀，所述步骤包括： 裂解存在于组合物中的分离生物体的细胞；离心；沉淀辛伐他汀的游离酸 形式；将辛伐他汀的游离酸形式转化成辛伐他汀盐；过滤；或高效液相色 谱(HPLC)。在某些实施方式中，所述方法制备物质组合物，其所含红麴素 J是最初与酰基硫酯混合的红麴素J的0%-1%，所述酰基硫酯在LovD酰基 转移酶变体的存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基；和/或使得加 入组合物的红麴素J中至少95%转化成辛伐他汀。可选在这些方法中，LovD 多肽变体包含氨基酸取代：D12G、C40A、C60N、A86V、A190T和G275S； D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T和G275S；或D12G、 K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T；G275S和V334F。本发明 的相关实施方式是物质组合物，其包含：红麴素J；在LovD酰基转移酶存 在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基的酰基硫酯；SEQ ID NO:1所示 LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括以下氨基酸取代： 在氨基酸残基位置C40和C60；以及以下至少一个氨基酸残基位置：A10， D12，K26，A86，A190，H161，K227，G275，V334或L361；以及辛伐他 汀。

本发明的另一实施方式是制备胡伐他汀的方法，其包括以下步骤：混 合经水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给 经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰基硫酯；和SEQ ID NO:1所示LovD酰 基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置 的氨基酸取代：A10；D12；K26；C40；C60；A86；A190；H161；K227； G275；V334和/或L361；然后允许所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯 的酰基来区域选择性酰化经水解普伐他汀四醇的C8羟基；从而制得胡伐他 汀。本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含：经水解的普伐他汀四 醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给经水解普伐他汀四醇的 C8羟基的酰基硫酯；SEQ ID NO:1所示LovD酰基转移酶多肽的某变体， 所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置的氨基酸取代：A10，D12， K26，C40，C60，A86，A190，H161，K227，G275，V334和/或L361；以 及胡伐他汀。可选该LovD多肽变体包含氨基酸取代：D12G、C40A、C60N、 A86V、A190T和G275S；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、 A190T和G275S；或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T； G275S和V334F。

本发明的某些实施方式中，可将其它组分和/或方法步骤与上述的一种 或多种方法和材料联用。例如，上述方法还可包含利用高细胞密度发酵来 提高用于制备辛伐他汀和/或胡伐他汀的一种或多种LovD酰基转移酶变体 的有效浓度，以及优化发酵条件或提高LovD酰基转移酶催化效率等。很 多其它组分或方法可用于提高辛伐他汀或能促进辛伐他汀和/或胡伐他汀生 成的中间体或相关化合物的制备。

本发明的实施方式还包括设计用于促进本发明方法的制品和/或试剂 盒。此类试剂盒通常包括根据本发明所述方法使用盒中元件的说明。此类 试剂盒可包含经区域化的载体用具以在封闭限制件中容纳一种或多种容器 用具如小瓶、管等，各容器用具包含一种待用于本方法的单独元件。一种 所述容器可包括小瓶，例如含有编码LovD酰基转移酶变体的质粒，所述 质粒可选在微生物宿主如大肠杆菌或土曲霉中，而另一管瓶含有硫酯化合 物或类似物，两者均可添加至发酵混合物中以产生辛伐他汀和/或胡伐他汀 或类似物。

下面描述本发明的补充实施方式。

附图简要说明

图1.过量表达酰基转移酶LovD的大肠杆菌菌株用作生物催化剂将红 麴素J(MJ)酸和DMB-S-MMP一步转化成辛伐他汀。辛伐他汀酸形式将在 低pH下自动转化成内酯形式，而该内酯则在高pH条件下转化成酸形式。 野生型LovD的k_cat为0.6分钟^-1。体内实验显示大肠杆菌YT2中表达的野 生型LovD可在12小时内将15mM MJ酸转化成辛伐他汀。

图2.(a)SDS-PAGE凝胶来自大肠杆菌BL21(DE3)/pAW31的LovD蛋 白(WT)；(b)分别为LovD蛋白(WT)和A1-A8的天然凝胶，对所有样品DTT 固定为2mM。A1相比WT具有稍低的寡聚体；A3消除了大多数寡聚体； A2、A6和A8与WT非常相似；突变体A4、A5和A7因不稳定性而显示 较少蛋白；A9因为没有可溶性蛋白而未包括在内。该结果表明只有C1和 C3可引起分子间二硫键。

图3.基于从MJ酸和DMB-S-MMP转化的全细胞生物催化活性(灰色 柱)和野生型LovD与突变体间可溶性蛋白表达水平的比较(黑色柱)。对于 全细胞活性，将LB培养物浓缩10倍以模拟高密度发酵，用15mM MJ酸 和18mM DMB-S-MMP比较转化。采用基于8小时的转化来比较野生型 LovD和突变体间的全细胞活性。野生型LovD转化归一化至100%，数据 点为两次的均值。对于蛋白表达水平试验，从50ml LB培养物中表达蛋白 并用Ni-NTA柱纯化。通过Bradford法测定浓度。也将野生型LovD表达 水平归一化至100%。突变体的全细胞活性与可溶表达的蛋白质成比例，因 此溶解度可能是影响全细胞活性的唯一原因。

图4.含第一或第三半胱氨酸改变的突变体与野生型LovD之间基于8 小时转化的全细胞LovD活性。野生型LovD转化归一化至100%，数据点 为两次的均值。A1显示转化高于其它在第一半胱氨酸位置处的突变体，而 N3则在第三半胱氨酸位置中最高。A1和N3都显示全细胞活性比野生型高 ~25%。

图5.辛伐他汀转化随着时间变化。试验条件同前。YT2/A1N3(●)结合 了A1和N3的益处，是最快的突变体，转化在8小时内完成。YT2/A1和 YT2/N3在10小时内完成反应，YT2/A1的转化稍高于YT2/N3。YT2/pAW31 是野生型，其在12小时内转化15mM MJ酸。全细胞活性更高导致反应时 间更短。与野生型相比，YT2/A1和YT2/N3都将时间缩短~20%，而 YT2/A1N3将时间缩短~50%。

图6.YT2/pAW31和YT2/A1N的高细胞密度发酵。对这两个菌株，先 将细胞在37°C生长至OD₆₀₀约为20，然后将温度降至25°C并添加500μl 1M IPTG以诱导蛋白质表达。蛋白表达~12小时后，停止葡萄糖补料，pH调至 7.8，缓慢添加15g MJ酸和15ml DMB-S-MMP以开始转化。用HPLC检 查转化，一旦反应完成或恒定，即终止反应。通过下游纯化方法回收辛伐 他汀。添加底物后细胞密度的极大下降可通过缓慢添加底物降至最小。转 化速率最初保持恒定，随时间延长可能LovD蛋白被灭活而缓慢下降。

图7.由LovD催化的反应。LovD负责将MJA经α-S-甲基丁酸侧链的 酰化转化成LVA，且还可用DMB-SMMP作为酰基供体合成SVA。

图8.LovD的晶体结构及其与EstB的关系。(A)LovD与EstB之间基 于结构的序列比对。在序列上方显示指定自LovD结构的二级结构元件。 颜色从N末端处的蓝色过渡到C末端处的红色。EstB中的活性位点残基由 氨基酸下方的星号“*”标出。(B)显示G5’-LVA复合体的带状图。(C)LovD 的结构。绿色突出显示EstB中非保守的区段。投射在活性位点周围的5个 环如同接球手手套中的手指。(D)EstB的结构。红紫色突出显示LovD中非 保守的区段。(E)LovD和EstB结构的重叠图。注意到LovD上缺失了EstB 中覆盖活性位点的一个环(残基244-260)。

图9.LovD作为辛伐他汀合成酶的定向进化。(A)用基于琼脂扩散的试 验在全细胞活性试验中定量SVA的量。在点样反应混合物前将粗糙链孢霉 (N.crassa)包埋在琼脂中。编号(1-8)表示添加MJA和DMB-SMMP至表达 野生型LovD的大肠杆菌后的不同孵育时间：2.5，4，5.5，7，8，9，10， 12小时。(B)LovD突变体向更高全细胞活性的定向进化。共有7代LovD 突变体。4代源自随机诱变，包括G1，G2.1，G2.2，G4.1，G4.2和G6。 包括G3和G5的2代源自前代突变体的有益突变。G7通过G6在V334和 L361位置的饱和诱变衍生得到。含2个氨基酸变化的所有突变体进行定点 突变以确定有益或有害突变(G2.1、G4.1和G4.2)。(×)表明突变体具有比前 代降低的全细胞活性。(√)表明突变体具有比前代更高的全细胞活性。

图10.G5突变体的结构提供对于改善催化的认识。在有改善突变体G5 中存在的氨基酸变化位置，突出了其通常离活性位点距离远。距离是从氨 基酸α碳到LVA的亲核性羟基(C8)。

图11.5种LovD结构重叠的侧视图。该图表明两个结构域间由于G5 突变和存在结合键而有铰链旋转。(A)可稳定铰链闭合的两个重要残基 (Val86和Leu134)显示为球体。(B)另2个残基(Val334和Asp320)彼此直接 接触。G6中的V334D突变可导致Asp334和Asp320间的静电推斥，而G7 中的V334F突变可导致苯基侧链和Asp320间的空间位阻。两者都能稳定 铰链的闭合。

图12.比较结合不同配体的LovD活性位点。(A)G5与底物MJA复合。 (B)G5’与产物LVA复合。(C)G5’与产物SVA复合。(D)3种结构的重叠显 示构型变化，特别是在亲核性丝氨酸处，与结合不同配体相关联。虚线代 表氢键。活性位点入口在各图的顶部。一些参与配体结合的残基未显示。

图13.为了仔细研究引起全细胞活性增加的原因，鉴定并列举了所有 改良突变体的动力学参数(k_cat，K_M)、可溶蛋白水平与热稳定性。将LovD突 变体的全细胞活性与G0比较，G0的转化速率为1.7mM/小时，并标准化 至1。MJA的K_M于25℃在DMB-SMMP固定在2mM时获得。DMB-SMMP 的K_M在MJA固定于2mM时获得。§可溶蛋白的量从纯化的蛋白水平测定。 Tm由圆二色性测量。所有结果表示三次测定的均值±SD。

图14.LovD G0和突变体的全细胞活性。在25℃下，G0以每小时～1.7 mM的速率产生SVA。在32℃下，G0，G1，G2.1，G2.2和G3未显示任 何活性。在25℃下，G7显示活性比野生型稍高。在37℃下，只有G7保 持每小时～0.4mM SVA的残余活性。

图15.LovD突变体的动力学特征。LovD突变体的转换率，针对利用 DMB-SMMP为底物生物合成SVA(◆，蓝线，k_cat于左y轴)，利用 MB-SMMP(■，粉线，k_cat于左y轴)或LovF(▲，红线，表观转换率于右Y 轴)为底物生物合成LVA。

图16.LovD G5’结合于LVA和MJA。(A)LovD的结构，从N-末端(蓝 色)到C-末端(红色)的二级结构元件，以及LovD二级结构的拓扑图(箭头表 示β-片层，长方形表示α-螺旋)。LVA显示为灰色棒形。(B)通向LovD活 性位点的带正电通道和带正电脊(圈示区域)可与LovF的ACP结构域和 pPant臂相互作用。(C)疏水和芳族氨基酸参与MJA结合口袋。

图17.与突变相关关键残基和在结合配体后的移动(A)迭合 G0-Semet、G5和G5-MJA的大结构域(残基14-92和204-405)以表示与MJA 相互作用的一些关键残基的移动。自G0-Semet到G5的结构域转动关闭 Arg173的胍基和MJA的C15羧基之间的缺口，这有利于结合MJA。在G5 中Phe148和Tyr188也更靠近MJA。(B)LovD活性位点中LVA和SVA结 合之间的区别。在SVA中添加额外的α-甲基通过接触Phe148产生结构域 间的铰链开口。

图18就G5中有益突变提出的机制。(A)K26E突变可能通过打散螺旋 A表面上成片带正电残基(R22、K23、K26和R28)来改善酶稳定性。该片 区在G0-Semet和G5中都圈出以突出显示。(B)G275S突变看来通过添加 螺旋I上S278的氢键改善酶的稳定性。

图19.LovD的催化残基和提出的LVA生物合成机制。(A)提出的参与 LovD反应的残基。(B)LovD(灰色)和EstB(紫红色)之间活性位点残基的迭 合。(C)利用MJA和MB-LovF ACP为底物生物合成LVA。Ser76起催化 亲核体的作用来催化酯交换反应。Ser76和MJA(C8)的羟基被Tyr188脱质 子化，Tyr188由Lys79稳定化。

图20.X-射线数据采集和原子精修的统计(括号内数字指数据的边界)。 R_合并=∑|I-<I>|²/∑I²，其中I是观察的强度。两项求和都包括所有输入反射， 对超过一种对称等价物取平均。R_工作=∑||F_o|-|F_c||/∑|F_o|，其中F_o和F_c分别指 观察到和计算所得结构因子。R_游离类似于R_工作，但基于反射的子集，该子 集被保留不用于精密化以供交叉验证(Brünger,A.T.(1992)Nature,355, 472-474)。缩写R.M.S.表示均方根值。

具体实施方式

本文所述或所引用的技术和过程通常已充分了解并常采用本领域技术 人员的常规方法，例如，Ausubel等在威利科学出版社（Wiley Interscience  Publishers）1995年的Current Protocols in Molecular Biology (《最新分子生 物学方法》)中描述的广泛应用的分子克隆方法。适用时，除非另有说明， 涉及使用市售可得的试剂盒和试剂的过程通常按生产商给出的方案和/或参 数进行。除非另外定义，本文使用的所有术语、符号和其它科学术语旨在 具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中， 本文出于清楚和/或便于引用对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中 包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的显著区别。描述适用于 本文所公开发明实施方式的方法和材料的公开内容包括，例如，国际公开 号WO 2007/139871和Xie等，Biotechnology and Bioengineering,第102卷 第1期(2008)。说明书和相关权利要求中指向能以数字表征值的所引用全 部数字可用术语“约”修饰。

下文提供某些术语的定义。

“洛伐他汀”(美降之)是由土曲霉生成的真菌聚酮(参见例如，A.W. Alberts,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1980,77,3957-3961和A.Endo, J.Antibiot.1980,33,334-336；以及J.K.Chan,等，J.Am.Chem.Soc.1983, 105,3334-3336；Y.Yoshizawa,等，J.Am.Chem.Soc.1994,116,2693-2694)。 该化合物因其针对胆固醇生物合成的限速步骤—羟甲基戊二酰辅酶A还原 酶(HMGR)的有效抑制活性而为药学上重要的化合物，因而广泛用于治疗高 脂血症、高胆固醇血症等。洛伐他汀也称作美降之。

“辛伐他汀”是洛伐他汀的类似物。它因为没有不良副作用和在胃内的 高吸收而比洛伐他汀更受青睐。而且，已有报道称辛伐他汀通过减缓AD 相关β-淀粉样蛋白质Ab42的生成来预防并降低阿尔茨海默病(AD)的风险。 本领域已知可利用甲基卤在金属酰胺碱的存在下通过将洛伐他汀式中8'-甲 基丁酰氧侧链直接甲基化的方式合成制备辛伐他汀。C-甲基化步骤必须在 极低温度(-75至-30°)下利用强碱于无水条件下进行，这难以在量产中操作 (参见例如，美国专利号5,393,893，美国专利号4,582,915，美国专利号 5,763,646，美国专利号5,763,653；欧洲专利号299,656和国际专利公开号 WO 99/45003，其内容通过引用纳入本文)。本领域已知合成制备辛伐他汀 的其它方法。例如，可用过量氢氧化锂水解洛伐他汀以去除2-甲基丁酰基 侧链并同时打开其六元内酯环以产生三醇酸。然后可加热所述三醇酸化合 物以获得二醇内酯。随后可以保护二醇内酯的内酯环上的羟基以获得叔丁 基二甲基硅烷基醚，然后六氢萘环系统C8处的羟基可在二环己基碳二亚胺 或2,2-二甲基氯的存在下用2,2-二甲基丁酸酰化以产生化合物。然后可在最 终步骤中用四丁基氟化铵去除化合物的叔丁基二甲基硅烷保护基团以产生 辛伐他汀(参见例如，美国专利号4,444,784，其内容通过引用纳入本文)。

本文所用“洛伐他汀衍生物”包括洛伐他汀衍生物或前体，例如普伐他 汀、胡伐他汀、辛伐他汀或经水解的普伐他汀四醇。“红麴素J变体”指本领 域公开的红麴素J变体，例如经水解的普伐他汀四醇或6-羟基-6-去甲基红 麴素J等。本发明的某些实施方式中，“红麴素J变体”指图2中C6位置处 具有取代的红麴素J化合物。描述化合物如辛伐他汀、普伐他汀、红麴素J 及变体等时，本领域技术人员理解该语言旨在涵盖这些化合物以及这些化 合物的盐(例如，本领域已知的药学上可接受的盐)。例如，正如本领域已知， 辛伐他汀可以游离酸形式以及辛伐他汀钠、钾或氨盐，和其它衍生自碱土 元素或其它金属盐的形式存在。

“土曲霉”是土壤中常见的丝状子囊菌。本领域已知多种土曲霉菌株， 例如保藏为ATCC 20542和ATCC 20541的菌株。

如本领域已知，丝状真菌次级代谢产物的生物合成相关的基因可构成 真菌基因组上的一簇，并称作“基因簇”。例如，“产洛伐他汀基因簇”可以指 某组产洛伐他汀的基因，所述基因组包括LovA，即一种P450I；LovC，即 一种脱氢酶；LovD，即一种酯酶和酰基转移酶；和LovF，即一种ScPKS 或LDKS。此前已确定这四个基因(LovA、LovC、LovD和LovF)中每个都 是洛伐他汀合成所需(参见例如美国专利号6,943,017，其内容通过引用纳入 本文)。LovF(LDKS基因)鉴定为聚酮合成酶基因。LovD是推定的酯酶/羧 肽酶样基因。LovF基因的破坏已有先例(参见例如，美国专利号6,943,017， 其内容通过引用纳入本文)。LovD与LovF相互作用产生洛伐他汀；但是生 成辛伐他汀无需该LovD-LovF相互作用。此外，产洛伐他汀基因簇中的另 一基因是LovE，其为能调节其它基因转录的锌指。产洛伐他汀基因簇还包 含LovB(NPKS基因)。

“LDKS”或“LDKS基因”指由产洛伐他汀基因簇的一员—LovF基因编 码的蛋白质。LDKS表示洛伐他汀二酮合成酶。LovF是生成LDKS的基因。 LovF也是生成LovF蛋白质的基因。“LDKS基因”也指生成LDKS的基因。 在洛伐他汀合成中，LDKS通过乙酰-CoA和丙二酰-CoA之间的缩合来合成 红麴素J的五碳单元侧链。缩合的二酮由单独LovF结构域进行甲基化和还 原性修整产生共价连接于LovF的酰基载体蛋白(ACP)的磷酸泛酰巯基乙胺 臂上的α-S-甲基丁酰基硫酯。

本文所用“LovD酰基转移酶”指能利用酰基硫酯区域特异性酰化红麴 素J的C8羟基以生成辛伐他汀的那些多肽如土曲霉LovD多肽(例如，SEQ  ID NO:1)。也如本文所述，该LovD酶可进一步利用酰基硫酯区域特异性 酰化已水解普伐他汀四醇的C8羟基以生成胡伐他汀。

LovD酰基转移酶包括土曲霉LovD多肽(如SEQ ID NO:1)的同源酶， 其可见于，例如但不限于，真菌聚酮基因簇。例如，本领域提供证据表明 美伐他汀生物合成途径中的Mlc催化相同的酰基转移反应(参见例如，Y. Abe,T.等，Mol Genet Genomics.2002,267,636-646)，而角鲨抑素途径中的 酰基转移酶能在ACP结合四酮硫酯和糖苷配基之间催化类似反应(参见例 如R.J.Cox,F.等，Chem Commun(Camb)2004,20,2260-2261)。土曲霉LovD 多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)类似于C型β-乳胺酶，该酶催化β- 内酰胺类抗生素的水解失活(参见例如，E.Lobkovsky,E.M.等，Biochemistry, 1994,33,6762-6772和A.Dubus,D.等，Biochem.J.1993,292,537-543)。土 曲霉LovD多肽(例如SEQ ID NO:1)与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) P99内酰胺酶(参见例如，S.D.Goldberg,等，Protein Sci.2003,12,1633-1645) 的比对显示中等序列同源性，包括潜在保守的活性位点残基，例如催化性 Ser76、Lys79、Tyr188和Lys315(参见例如S.D.Goldberg等，Protein Sci. 2003,12,1633-1645)。

LovD酰基转移酶还可以指与土曲霉LovD多肽(例如SEQ ID NO:1)序 列相关但含有较少氨基酸差异(例如1-10个氨基酸取代突变)的基因工程改 造和天然产生的酶。例如，辛伐他汀可由与土曲霉LovD多肽(例如SEQ ID  NO:1)序列相似的天然产生酶(例如来自美伐他汀簇的MlCH)生成。“LovD 酰基转移酶”还可指土曲霉LovD多肽(SEQ ID NO:1)的突变体。本领域已 知可用标准分子生物学技术产生突变体来制得，例如改善催化效率的SEQ  ID NO:1的突变体等。例如，我们采用合理及定向进化方法来改善土曲霉 LovD的催化转换率。此类突变体通常与SEQ ID NO:1具有50%-99%的序 列相似性。在此情况中，术语“LovD同源酶”包括与SEQ ID NO:1所示氨 基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列相同性 的LovD多肽，其中所述多肽能利用酰基硫酯来区域特异性酰化红麴素J 的C8羟基以产生辛伐他汀和/或利用酰基硫酯来区域特异性酰化经水解普 伐他汀四醇的C8羟基以产生胡伐他汀。此类突变体易于制备并随后在观察 所需化合物如辛伐他汀生成的试验(通常用土曲霉LovD多肽(如SEQ ID NO: 1)作为对照)中鉴定。本发明所述方法可利用这些突变体制备如辛伐他汀或 胡伐他汀。术语"变体LovD多肽”，"LovD多肽变体”“LovD酰基转移酶变 体”等指本文所公开的以及与含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的LovD具 有至少约90%-99%氨基酸序列相同性的活性LovD多肽。此类变体包括， 例如，SEQ ID NO:1中一个或多个氨基酸被取代、添加或缺失的LovD多肽。

对于核酸序列例如编码序列和控制序列，“异源的”指正常情况下不 与重组构建物的某区域相关和/或正常情况下不与特定细胞相关的序列。因 此，核酸构建物的“异源”区域可以是在自然状态下未发现与其他分子相 关联的另一核酸分子内或与结合该分子的可鉴定核酸区段。例如，构建物 的异源区域可包含的编码序列侧接有自然状态下不与之相关连的序列。类 似地，用正常情况下不存在某宿主细胞内的构建物转化的该宿主细胞，对 本发明而言认为是异源(参见例如，美国专利号5,712,146、6,558,942、 6,627,427、5,849,541，其内容通过引用纳入本文)。例如，可分离含Lov基 因的构建物并在不产洛伐他汀的真菌或酵母宿主细胞中表达，而洛伐他汀 可由此生成(参见例如，美国专利号6,391,583和6,943,017，其内容通过引 用纳入本文)。作为另一示例，如本领域已知，原核生物如细菌也可以是宿 主细胞。真菌基因也可克隆入用于在原核生物中表达的表达载体(参见例 如，美国专利号5,849,541，其内容通过引用纳入本文)。

原核生物如大肠杆菌可用作异源宿主。质粒可构建有感兴趣的基因， 且所述质粒可转化入大肠杆菌。可翻译感兴趣基因，且其后可纯化由所述 感兴趣基因衍生的蛋白质。本领域已知该表达和蛋白质纯化方法。例如， 可从土曲霉的基因组DNA独立扩增土曲霉的LovD外显子并利用剪接重叠 延伸PCR来剪接产生连续的开放读框。可引入限制性位点，且可将基因盒 与载体连接以产生能转化入大肠杆菌的表达构建物。由此，大肠杆菌可用 作表达土曲霉基因的异源宿主。大肠杆菌可与生成另一感兴趣底物的另一 菌株共培养。此外，可添加底物至该培养物或共培养物中。本领域已知洛 伐他汀生物合成基因的异源表达(参见例如，美国专利号6,391,583和 6,943,017，其内容通过引用纳入本文)。

作为另一示例，某些聚酮，例如来自真菌或其它生物体的聚酮，可在 大肠杆菌、酵母、和其它异源宿主生物体中异源表达。这些宿主生物体可 补充有其它底物，因为它们可能需要所需PKS的异源表达以及能生成至少 一些PKS所需底物分子的酶(参见例如，美国专利号7,011,959，其内容通 过引用纳入本文)。类似地，真菌Lov基因可在大肠杆菌或其它细菌中表达， 且这些宿主细菌可补充有其它底物，例如酰基-SNAC或其它酰基供体基团。 这些酰基供体基团可以是细胞渗透性的，并进入所述细菌细胞。

“表达载体”指能引入宿主细胞的核酸。如本领域已知，表达载体可永 久或暂时保持在细胞内，作为染色体的部分或是细胞内或任何细胞区室内 的其它DNA，例如细胞质中的复制载体。表达载体还可包括驱动RNA表 达的启动子，RNA通常在细胞或细胞提取物中翻译成多肽。例如，用于纳 入表达载体的合适启动子包括在真核或原核宿主细胞中起作用的那些启动 子。启动子可包含调节序列，使得能相对宿主细胞的生长调节表达或导致 响应化学或物理刺激打开或关闭基因表达。对于大肠杆菌和某些其它细菌 宿主细胞，可使用衍生自生物合成酶基因，赋予抗生素抗性的酶和噬菌体 蛋白的启动子，包括例如，半乳糖、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β- 内酰胺酶(b/a)、噬菌体λPL和T5启动子。此外，也可使用合成启动子如 tac启动子(美国专利号4,551,433)。对于大肠杆菌表达载体，包括大肠杆菌 复制起点如来自pUC、p1P、p1I、pBR和pET(例如pET28)的复制起点是 有益的。为了有效翻译RNA成蛋白质，表达载体通常还含有位于待表达基 因编码序列起始密码子上游的核糖体结合位点序列。表达载体内也可存在 其它元件，例如，增强子，分泌信号序列，转录终止序列，和包含所述载 体的宿主细胞能得以鉴定和/或选择的一种或多种标记基因。可使用选择性 标记即提供抗生素抗性或敏感性的基因，并当所述细胞生长于适当的选择 性培养基中时在经转化细胞上提供可选择表型。例如，可将含Lov基因簇 或其部分的表达载体引入异源宿主如大肠杆菌。因此，重组表达载体可含 有至少一种表达系统，该系统进而可由操作性连接启动子并可选连接终止 序列的至少部分Lov和/或其它生物合成基因编码序列组成，其在相容宿主 细胞内运行以实现编码序列的表达。

例如，"编码序列"可以是"编码"特定基因如来自Lov基因簇的基因的序 列。“编码序列”是置于合适调控序列控制时可在体外或体内被转录(如果是 DNA)和翻译(如果是mRNA)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5’(氨基) 末端起始密码子和3’(羧基)末端翻译终止密码子确定。转录终止序列通常位 于编码序列的3’端。

DNA“控制序列”统指启动子序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸信号、 转录终止序列、上游调控区、增强子等，它们一起提供宿主细胞中编码序 列的转录和翻译。

"操作性连接"指配置所述组件以便行使其常见功能的元件排列。因此， 操作性连接于编码序列的控制序列可影响该编码序列的表达。控制序列不 必与编码序列毗连，只要它们可发挥功能指导编码序列的表达。

“产洛伐他汀生物体”指本领域已知产生洛伐他汀的各种不同生物体。 这些产洛伐他汀的生物体可经过修饰以通过本发明所述方法产生辛伐他 汀。土曲霉是产洛伐他汀生物体的一个示例。报道产生洛伐他汀(洛伐它丁 (mevinolin))的土曲霉以外微生物包括多种红曲霉，例如，红色红曲菌(M. ruber)，紫红色红曲菌(M.purpureus)，丛毛红曲菌(M.pilosus)，玻璃质红曲 菌(M.vitreus)，软毛红曲菌(M.pubigerus)，以及多种青霉菌(Penicillium)， 寄生菌(Hypomyces)，皮真菌(Doratomyces)，茎点霉(Phoma)，正青霉菌 (Eupenicillium)，裸子囊菌(Gymnoascus)和木霉菌(Trichoderma)，拉氏毕赤 酵母(Pichia labacensis)，卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola)，米曲霉 (Aspergillus oryzea)，斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏拟青霉 (Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillum citrinum)，产黄青霉(Penicillin  chrysogenum)，短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)和绿色木霉(Trichoderma  viride)(参见例如，美国专利号6,391,583；Juzlova等，J.Ind.Microbiol. 16:163-170；Gunde-Cimerman等，FEMS Microbiol.Lett.132:39-43(1995) 和Shindia等，Folio Microbiol.42:477-480(1997)，其内容通过引用纳入本 文)。

本文所用“不产洛伐他汀的生物体”指多种未经人工操作不产洛伐他汀 的生物体(例如大肠杆菌)。例如这些生物体可诱导为产生LovD，或在LovD 存在下培养以通过本发明所述方法产生洛伐他汀或辛伐他汀。

“有LDKS基因破坏的土曲霉”的土曲霉包括：没有LDKS基因，具有 经突变LDKS基因，具有经敲除LDKS基因，具有缺失LDKS基因，具有 的LDKS基因其表达被破坏，或具有的LDKS基因被打断。“有LDKS基因 破坏的土曲霉”包括所具有的LDKS基因通过本领域已知方法沉默的土曲 霉。“有LDKS基因破坏的土曲霉”指不能产生功能性LDKS的土曲霉。“有 LDKS基因破坏的土曲霉”还可指产生功能性LDKS的土曲霉。所述LDKS 可用本领域已知方法如基因敲除方法灭活或抑制。存在的LDKS量可用本 领域已知方法降低。抑制、灭活或破坏LDKS基因或蛋白的其它方法包括 但不限于如本领域已知的：反义、siRNA、RNAi或RNA干扰。本文所用 “LDKS基因”也可指LovF基因。LovF基因的破坏为本领域已知(参见例如， 美国专利号6,391,583，其内容通过引用纳入本文)。“有LDKS基因破坏的 土曲霉”通常是经过遗传操作的生物体。本领域已知土曲霉的遗传操作。土 曲霉中Lov的基因破坏已有先例(参见例如，美国专利号6,391,583和 6,943,017，其内容通过引用纳入本文)。土曲霉中，特别是LovF基因(产生 LDKS)的破坏已有先例(参见例如，美国专利号6,943,017，其内容通过引用 纳入本文)。LovF基因的破坏可通过本领域已知的其它方法产生。有LDKS 基因破坏的土曲霉可以是在发酵混合物中。可向有LDKS基因破坏的土曲 霉的发酵混合物中添加底物以产生洛伐他汀类似物。

本文所用“提高辛伐他汀生成的成分或方法”指能加强某些中间体生成 以提高辛伐他汀制备量来用于放大和大规模合成辛伐他汀的合成或天然的 化合物或底物。本领域已知用于加强某些中间体生成的成分和方法。例如， 本领域已知在洛伐他汀制备中添加至发酵混合物以提高中间体如红麴素J 量的化合物(参见例如美国专利号6,943,017，其内容通过引用纳入本文)。 一些这类中间体如红麴素J也可用于生成辛伐他汀。从而，可添加用于提 高红麴素J生成的化合物以增加辛伐他汀生成。例如，可将提高红麴素J 生成的化合物直接加入发酵混合物中以增加产生的辛伐他汀量。用于提高 辛伐他汀生成的成分的一种示例是含有产洛伐他汀基因簇的D4B区段的克 隆，该克隆以ATCC登录号98876保藏。如本领域已知，该克隆可转化入 不产洛伐他汀的生物体来生成红麴素J。该克隆还可转化入产洛伐他汀的生 物体以提高红麴素J的生成并从而增加辛伐他汀的生成。此外，用于提高 辛伐他汀生成的成分的另一示例是LovE/锌指基因，其可转化入产洛伐他汀 的生物体以提高辛伐他汀的生成。这种产洛伐他汀的生物体优选在LDKS 基因中有破坏(参见例如，美国专利号6,391,583，其内容通过引用纳入本 文)。提高辛伐他汀生成的成分与方法可以指很多其它成分和方法而不限于 上述示例。

如本文所述，“酰基供体”或“酰基载体”是具有酰基的化合物，该酰基可 转移给辛伐他汀和/或辛伐他汀前体或相关化合物。“酰基供体”或“酰基载 体”通常是酰基硫酯，其将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基。本领域已 知多种此类试剂，在本文中进一步显示具有该活性(参见例如表1中的说明 性酰基硫酯)。除了本领域已知并在本公开中进一步显示具有该活性的那些 以外，本领域已知(或经从头合成的)的任何具有酰化红麴素J的C8的能力 从而生成辛伐他汀的潜在酰基供体/载体可以通过与本文所述酰基供体(例 如酰基-SNAC)的比较实验方便地鉴定。如本领域所知，酰基可具有式 RCON；其中R可以是烷基或芳基而N可以是-Cl，-OOCR，-NH2，-OR等。 有酰基的化合物包括但不限于酰基氯、酯、酰胺或酐等。这些化合物可以 是脂族或者芳族，取代的或未取代的。示例包括但不限于苯甲酰氯、苯甲 酸酐、苯甲酰胺或苯甲酸乙酯等。酰基供体的其它示例包括但不限于：α- 二甲基丁酰-SNAC，酰基硫酯，酰基-CoA，丁酰-CoA，苯甲酰-CoA，乙酰 乙酰基-CoA，β-羟丁酰-CoA，丙二酰-CoA，棕榈酰-CoA，丁酰硫酯，N- 乙酰基半胱胺硫酯(SNAC)，甲基-巯基乙酸酯(SMTG)，苯甲酰-SNAC，苯 甲酰-SMTG或α-S-甲基丁酰-SNAC。这些化合物可天然或合成产生，且在 一些情况中可穿透细胞膜。例如可在红麴素J存在下添加一些此类化合物 至LovD以产生辛伐他汀。

本文所用“酰基-SNAC”指α-二甲基丁酰-SNAC。如本领域所知，酰基 -SNAC可在体内情况下穿透细胞膜。LovD可利用酰基-SNAC作为底物， 通过区域特异性酰化红麴素J的C8羟基来启动从红麴素J至辛伐他汀的反 应。酰基-SNAC可提供其酰基给LovD。

本发明的典型实施方式

本领域技术人员应理解，本文提供的公开内容允许技术人员产生各种 本发明的实施方式。本发明的说明性实施方式包括：制备辛伐他汀(或相关 化合物如胡伐他汀)的方法，通过联用红麴素J；在LovD(和/或本文所述的 LovD酰基转移酶变体)存在下提供酰基部分给红麴素J的C8羟基的酰基硫 酯；以及LovD酰基转移酶变体，然后使该LovD酰基转移酶变体利用来自 所述酰基硫酯的酰基区域特异性酰化红麴素J的C8羟基，从而制得辛伐他 汀(或相关化合物)。

本发明的另一说明性实施方式是SEQ ID NO:1所示LovD多肽的变体， 其包含以下残基位置处的至少一个氨基酸取代：A10，D12，K26，C40， C60，A86，A190，H161，K227，G275，V334或L361。尽管此类LovD 的单取代变体能显示比野生型蛋白改善的性能，具有多个取代的LovD取 代变体显示进一步改善的性能。因此，技术人员可利用本文提供的公开内 容构建LovD取代变体，其在上述指出的任意第一位置有取代且在上述指 出的任意第二位置处有取代，或者在上述指出的任意第二位置以及任意第 三位置处有取代，或者在上述指出的任意第二位置以及任意第三位置、第 四位置、第五位置等处有取代。例如，本发明的一些实施方式中，所述LovD 多肽变体包含至少一种特定氨基酸取代，例如A10V；D12G；K26E；C40A； C60N；A86V；H161Y；A190T；K227R；G275S；V334D；V334F和/或L361M。 本发明的另一说明性实施方式是SEQ ID NO:1所示LovD多肽的变体，所 述变体LovD多肽包含在以下位置的某组氨基酸取代：氨基酸残基位置C40 和C60；以及至少另一以下氨基酸残基位置：A10；D12；K26；A86；A190； H161；K227；G275；V334；或L361。通常，所述取代变体与SEQ ID NO:1 中所示LovD多肽相比呈现一种或多种改变的性质，例如聚集减少；热稳 定性改善；催化活性改善；kcat/Km值改善；可溶表达水平改善；和/或25°C 下的全细胞活性改善。

为了简化本文所述LovD多肽变体的名称，应注意数字指沿LovD多肽 的氨基酸序列的氨基酸残基位置。氨基酸识别采用氨基酸的单字母符号， 即：

在此情况下，具有“C40A”取代的变体LovD多肽是SEQ ID NO:1在氨 基酸位置40处的半胱氨酸氨基酸(“C”)被丙氨酸(“A”)所取代的多肽。LovD 多肽的此类取代变体中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO:1所示LovD多 肽上氨基酸残基位置处未见的19种氨基酸中任一种。具体地，相关领域教 导了，在系统性实验已确立多肽链中具体位置的特定残基的性质对于维持 蛋白质功能完整性的一些方面(即，如本文所述)起决定作用的情况中，改变 这些"活性"氨基酸位置之一的氨基酸侧链的大小、形状、电荷、氢键能力 或化学反应性很可能在一些方式上影响所述蛋白质的功能(Rudiger等， Peptide Hormones(《肽激素》)，大学园出版社(University Park Press)(1976)). 在此情况中，下文实施例(例如诱变方案和鉴定突变体性能的方法)中所含公 开内容显示仅用常规实验即可确定在本文所述位置的LovD具有1、2、3、 4、5、6、7或更多氨基酸取代(例如，图13中显示的特定取代或在相应野 生型氨基酸残基位置处未见的其它19种氨基酸中任一种)的LovD变体的性 能。

本发明的某些实施方式包括氨基酸取代的特定构象(参见例如图13)。 例如，本发明的一些实施方式中，LovD多肽变体包含以下位置的氨基酸取 代：氨基酸残基位置C40、C60和A86；氨基酸残基位置C40、C60、A86 和A190；氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86和G275；氨基酸残基位 置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275；氨基酸残基位置C40、 C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190和G275；氨基酸残基位 置C40、C60、D12、A86、A190和G275；氨基酸残基位置C40、C60、A10、 D12、K26、A86、A190和G275；氨基酸残基位置C40、C60、D12、K26、 A86、H161、A190和G275；氨基酸残基位置C40、C60、D12、K26、A86、 H161、A190、G275、V334和L361；或氨基酸残基位置C40、C60、D12、 K26、A86、H161、A190、G275和V334。这些变体的具体说明性实施方式 包括具有下列氨基酸取代的变体：D12G、C40A、C60N、A86V、A190T和 G275S；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T和G275S； 或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T；G275S和V334F。

具有氨基酸取代特定构象的一种说明性突变体名为GX12，并包含6处 突变：C40A、C60N、A86V、D12G、G275S和A190T。将GX12的可溶 LovD表达水平，米氏动力学常数(k_cat/K_m)和全细胞活性与野生型酶作比较。 GX12显示k_cat/K_m值改善2.83倍，可溶性表达水平改善2.3倍，而25°C的 全细胞活性改善7.5倍。名为GX27的另一突变体包含8处突变：C40A、 C60N、A86V、D12G、G275S、A190T、11161Y和K26E。将GX27的可溶 LovD表达水平，米氏动力学常数(k_cat/K_m)和全细胞活性与野生型酶作比较。 GX27显示k_cat/K_m值改善3.45倍，可溶性表达水平改善4倍，而25°C的全 细胞活性改善11倍。

本发明的实施方式包括编码本文所述取代变体的多核苷酸，例如，与 编码本文所述LovD多肽变体的多核苷酸具有至少95%-100%序列相同性的 分离的多核苷酸。利用例如SEQ ID NO:5所示LovD多核苷酸，和对密码 子使用的了解(例如，可见于牛津大学出版社（Oxford University Press）的 Benjamin Lewin所编GENES IV(《基因IV》)中第168页)，可以制得本文 所示LovD多肽的任意取代变体如C40A，例如，通过改变编码位置40处 半胱氨酸的密码子(“UGC”)使其转而编码丙氨酸(例如“GCU”)。例如，此类 方法的说明性实施方式见实施例1所示。此外，本领域久已熟知产生变体 多核苷酸与多肽的多种技术，例如定点诱变(参见例如，Carter等，1986， Nucl.Acids Res.13:4331；Zoller等，1987,Nucl.Acids Res.10:6487)。

本发明的相关实施方式包括含这些多核苷酸的载体(例如，包含控制序 列的表达载体，所述控制序列被转化有所述载体的宿主细胞所识别)以及含 此类载体的宿主细胞。所述宿主细胞可选为大肠杆菌(Escherichia coli)，土 曲霉(Aspergillus terreus)，红色红曲菌(Monascus ruber)，紫红色红曲菌 (Monascus purpureus)，丛毛红曲菌(Monascus pilosus)，玻璃质红曲菌 (Monascus vitreus)，软毛红曲菌(Monascus pubigerus)，卡氏念珠菌(Candida  cariosilognicola)，米曲霉(Aspergillus oryzea)，斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces  stemonitis)，宛氏拟青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillum citrinum)， 产黄青霉(Penicillin chrysogenum)，短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)或绿 色木霉(Trichoderma viride)。本发明的相关实施方式是制备LovD多肽变体 的方法，包括将转化有LovD多肽变体编码子的宿主细胞在适于表达多肽 的条件下培养，从而产生LovD多肽变体。在本发明的某些实施方式中， LovD多肽变体可融合有异源氨基酸序列，例如能促进其操作的序列。多种 此类异源序列为本领域已知并已用于此类情况中，例如常用来经Ni-NTA 柱纯化多肽的异源多组氨酸序列。

本发明的另一实施方式是SEQ ID NO:1所示LovD多肽变体的制备方 法，其包括：利用多核苷酸诱变过程产生LovD多核苷酸的突变体群；表 达由所述LovD多核苷酸的突变体群所编码的LovD多肽变体群；从而制备 LovD多肽的变体。所述多核苷酸诱变过程可选为饱和诱变或易错聚合酶链 反应过程。本发明的这些实施方式通常包括筛选所述LovD多肽变体群的 一个或多个成员以鉴定出与SEQ ID NO:1所示LovD多肽相比具有以下性 质的变体：聚集减少；热稳定性改善；酰基转移酶活性改善；kcat/Km值改 善；可溶表达水平改善；和/或25°C下的全细胞活性改善。所述多核苷酸诱 变过程可选为受控过程，从而在编码以下氨基酸残基位置的密码子处产生 取代突变：A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275；V334； 和/或L361。在本发明的相关实施方式中，所述多核苷酸诱变过程受控从而 产生的变体包含C40A与C60N，以及在编码以下氨基酸残基位置的密码子 处的其它取代突变：A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275； V334；和/或L361。

本发明的另一实施方式是制备辛伐他汀的方法，其包括以下步骤：混 合红麴素J；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8 羟基的酰基硫酯；和SEQ ID NO:1所示LovD酰基转移酶多肽的某变体， 所述变体LovD多肽包含：氨基酸残基位置C40和C60；以及以下至少一 个氨基酸残基位置：A10；D12；K26；A86；A190；H161；K227；G275； V334或L361；然后使所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯的酰基区域特 异性酰基化红麴素J的C8羟基；从而制得辛伐他汀。在本发明的某些实施 方式中，在发酵培养基中混合红麴素J，酰基硫酯和LovD多肽变体，所述 培养基中存在产生所述LovD酰基转移酶变体的分离生物体，所述分离生 物体为以下至少一种：土曲霉；不表达SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土 曲霉；大肠杆菌；或不表达SEQ ID NO:4所示bioH多肽的大肠杆菌。可 选在此类实施方式中，酰基硫酯选自丁酰基硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或 甲基-巯基乙酸硫酯，包含中等链长(C3-C6)酰基部分和/或能跨越生长在发 酵培养基中的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜的酰基硫酯(例如，α-二甲基 丁酰基-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰基-S-乙基巯基丙酸 酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰基-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)及二甲 基丁酰基-S-甲基-巯基丁酸酯(DMB-S-MMB))。

在制备辛伐他汀的方法中，所述分离的生物体可以生长于以下至少一 种条件：温度为25-40°C；持续时间为至少4到至少48小时；pH为7-8； 和/或在含LB、F1或TB培养基的发酵基质中。所述方法可选进一步包含 通过至少一个纯化步骤来纯化由所述方法制得的辛伐他汀，所述步骤包括： 裂解组合物中存在的分离生物体的细胞；离心；沉淀辛伐他汀的游离酸形 式；将辛伐他汀的游离酸形式转化成辛伐他汀盐；过滤；或高效液相色谱 (HPLC)。在某些实施方式中，所述方法制备物质复合物，其所含红麴素J 是最初与酰基硫酯混合的红麴素J的0%-1%，所述酰基硫酯在LovD酰基 转移酶变体的存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基；和/或使得加 入组合物中的红麴素J至少已95%转化成辛伐他汀。可选在这些方法中， 所述变体LovD多肽包含氨基酸取代：D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和G275S；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T和G275S； 或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T；G275S和V334F。 本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含：红麴素J；在LovD酰基转 移酶存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基的酰基硫酯；和SEQ ID  NO:1所示LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括在以 下位置的氨基酸取代：氨基酸残基位置C40和C60；以及以下至少一个氨 基酸残基位置：A10，D12，K26，A86，A190，H161，K227，G275，V334 或L361；以及辛伐他汀。

本发明的另一实施方式是制备胡伐他汀的方法，其包括以下步骤：混 合经水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给 经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰基硫酯；和SEQ ID NO:1所示LovD酰 基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置 的氨基酸取代：A10；D12；K26；C40；C60；A86；A190；H161；K227； G275；V334和/或L361；然后使所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯的 酰基来区域特异性酰化经水解普伐他汀四醇的C8羟基；从而制得胡伐他 汀。本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含：经水解的普伐他汀四 醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给经水解普伐他汀四醇的 C8羟基的酰基硫酯；SEQ ID NO:1所示LovD酰基转移酶多肽的某变体， 所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置的氨基酸取代：A10，D12， K26，C40，C60，A86，A190，H161，K227，G275，V334和/或L361；以 及胡伐他汀。可选该LovD多肽变体包含氨基酸取代：D12G、C40A、C60N、 A86V、A190T和G275S；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、 A190T和G275S；或D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T； G275S和V334F。

如下文所详述，所述分离的生物体可在本领域已知的多种发酵条件下 生长，具体条件可以选择，例如基于本发明实施方式中所用特定生物体的 最适生长相关的发酵参数(参见例如，Miyake等，Biosci.Biotechnol. Biochem.,70(5):1154-1159(2006)和Hajjaj等，Applied and Environmental  Microbiology,67:2596-2602(2001)，其内容通过引用纳入本文)。所述生物 体的生长温度通常为30-40°C，持续时间至少4小时到至少48小时。所述 生物体的生长pH通常为6.5-8.5。本发明的某些实施方式中，发酵培养基 的pH可以是6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0 或8.1。在说明性实施方式中，所述生物体在含LB、F1或TB培养基的发 酵培养基中生长。

可选地，在本发明所述方法中与其它成分混合的红麴素J由分离的生 物体在发酵培养基中生成，例如也产生所述LovD酰基转移酶变体的上文 所列生物体之一。或者，在本发明所述方法中与其它成分混合的红麴素J 是由产生该化合物的另一生物体生成，该生物体添加到发酵培养基中并与 所述产LovD酰基转移酶变体的生物体一起生长。本发明的另一实施方式 中，红麴素J衍生自外源性来源并添加入发酵混合物中。可选地，本发明 所述方法产生物质组合物，其中所含红麴素J是组合物中最初所加的 0%-1%。本发明的某些实施方式中，所述方法将组合物中所加红麴素J的 至少95%转化成辛伐他汀。

在本发明的典型实施方式中，可在LovD酰基转移酶存在下将酰基部 分提供给红麴素J的C8羟基的酰基硫酯衍生自外源性来源(例如，化学合 成方法)并添加至发酵混合物。本文公开了多种此类酰基硫酯。所述酰基硫 酯通常是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基-巯基乙酸硫酯。可选地， 所述酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。本发明的某些实施方式 中，所述酰基硫酯能穿过生长于发酵培养基中的大肠杆菌或土曲霉细胞的 细胞膜。所述酰基硫酯通常选自下组：α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯 (DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基-巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁 酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯 (DMB-S-MMB)。在说明性实施方式中，所述酰基硫酯是二甲基丁酰-S-甲基 -巯基丙酸酯，其在发酵培养基中混合至浓度范围为1mM-100mM。

辛伐他汀制备方法的某些实施方式还包括由组合物纯化辛伐他汀的步 骤。例如，本发明的一些实施方式包括至少一个含有将组合物中所存在分 离生物体的细胞裂解的纯化步骤。实施方式可包括至少一个含有将组合物 中所存在分离生物体的细胞或细胞裂解物离心的纯化步骤。实施方式可包 括至少一个含有将组合物中所存在的一种或多种化合物沉淀的纯化步骤。 实施方式可包括至少一个含有将组合物中所存在的一种或多种化合物过滤 的纯化步骤。实施方式可包括至少一个含有将组合物中所存在的一种或多 种化合物用高效液相色谱法(HPLC)分析的纯化步骤。

本文提供的公开内容显示这些方法的多种组合可用来制备辛伐他汀和 胡伐他汀等。例如，本发明的某些实施方式中，宿主生物体产生酰基硫酯 和/或红麴素J。或者，将酰基硫酯和/或红麴素J加至所述生物体作为产辛 伐他汀方法的部分。所述方法还可包括添加具有一种或多种土曲霉基因的 表达载体并将该载体转化入异源宿主，所述基因已知能促进辛伐他汀和/或 胡伐他汀等的生成，例如编码SEQ ID NO:1(和/或本文所述变体)或SEQ ID  NO:2的基因，其中具有酰基转移酶活性的多肽因而得以表达。在另一实施 方式中，红麴素J可产自异源宿主。

本发明的另一实施方式是在表达编码本文所述变体的LovD酰基转移 酶基因的生物体内从红麴素J产生辛伐他汀的方法，其包括将表达LovD酰 基转移酶变体的第一生物体与产生酰基硫酯和/或红麴素J的第二生物体一 起培养(例如，在发酵混合物中)，其中所述酰基硫酯与LovD酰基转移酶基 因产物在红麴素J存在下相互作用以产生辛伐他汀。可选地，所述第一生 物体是天然不产生洛伐他汀的生物体(例如，转导有LovD酰基转移酶变体 编码基因的大肠杆菌)。或者，所述第一生物体是产洛伐他汀生物体如土曲 霉(例如，含有已灭活LovF/LDKS基因的土曲霉)。所述方法还包括添加一 种或多种外源组分至发酵混合物中以提高辛伐他汀前体如红麴素J的生成， 从而提高辛伐他汀的生成。

本发明所述方法还可包括添加其它组分至发酵混合物中以提高红麴素 J的生成并从而提高辛伐他汀和/或胡伐他汀的生成。作为本方法的一种说 明性实施方式，所述组分可以是携带LovE基因的克隆，其中所述生物体转 化有该克隆，而LovE被翻译并从而提高辛伐他汀的生成。作为该方法的另 一说明性实施方式，所述组分可以是含土曲霉基因组D4B区段的克隆 (ATCC登录号98876)，其中所述生物体转化有该克隆使得红麴素J的生成 提高。

本发明的另一实施方式是在外源酰基硫酯存在下于体外或体内将红麴 素J转化成辛伐他汀的方法。所述酰基硫酯优选能穿透细胞膜。本发明的 另一实施方式是在酰基硫酯存在下于生物体内直接将红麴素J转化成辛伐 他汀的方法，其中所述生物体产生LovD。在本发明的说明性实施方式中， 所述生物体是具有已破坏LDKS基因的土曲霉。

本发明另一实施方式是由包括下述步骤的方法制得的辛伐他汀产品： 将红麴素J，在LovD酰基转移酶存在下提供酰基部分给红麴素J的C8羟 基的酰基硫酯，以及LovD酰基转移酶变体混合在一起；并使该LovD酰基 转移酶变体利用来自所述酰基硫酯的酰基区域特异性酰化红麴素J的C8羟 基，从而制得所述辛伐他汀产品。本发明相关实施方式是由包括下述步骤 的方法制得的胡伐他汀产品：将经水解普伐他汀四醇，在LovD酰基转移 酶变体存在下提供酰基部分给经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰基硫酯， 以及LovD酰基转移酶混合在一起；并使该LovD酰基转移酶变体利用来自 所述酰基硫酯的酰基区域特异性酰化经水解普伐他汀四醇的C8羟基；从而 制得所述胡伐他汀产品。

本发明的另一实施方式是制备辛伐他汀的方法，包括在SEQ ID NO:1 所示LovD或本文所述LovD变体存在下将洛伐他汀水解成红麴素J并酰化 红麴素J，其中所述水解和酰化产生辛伐他汀。本发明的另一相关实施方式 是制备胡伐他汀的方法，包括在SEQ ID NO:1所示LovD或本文所述LovD 变体存在下将普伐他汀转变成经水解普伐他汀并酰化红麴素J变体，其中 所述水解和酰化产生胡伐他汀。

本发明的实施方式包括用于制备或由本文所述方法制得的物质组合 物。例如，本发明的一种实施方式是物质组合物，其包含：红麴素J；在 LovD酰基转移酶变体存在下提供酰基部分给红麴素J的C8羟基的酰基硫 酯。这些物质组合物的某些实施方式还包含LovD酰基转移酶变体。这些 物质组合物的某些实施方式还包含辛伐他汀。可选地，所述组合物还包含 分离的生物体，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，土曲霉(Aspergillus terreus)， 红色红曲菌(Monascus ruber)，紫红色红曲菌(Monascus purpureus)，丛毛红 曲菌(Monascus pilosus)，玻璃质红曲菌(Monascus vitreus)，软毛红曲菌 (Monascus pubigerus)，卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola)，米曲霉 (Aspergillus oryzea)，斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏拟青霉 (Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillum citrinum)，产黄青霉(Penicillin  chrysogenum)，短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)或绿色木霉(Trichoderma  viride)。在典型实施方式中，组合物中的生物体是表达SEQ ID NO:1所示 LovD多肽的土曲霉或大肠杆菌。在本发明的一种实施方式中，所述生物体 是不表达SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土曲霉。在本发明的另一实施方 式中，所述生物体是不表达SEQ ID NO:4所示bioH多肽的大肠杆菌。在本 发明的某些实施方式中，组合物中的分离生物体已转导有编码SEQ ID NO: 1所示土曲霉LovD多肽的表达载体。

本文公开了可用于本发明组合物中的多种酰基硫酯。所述酰基硫酯通 常是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基-巯基乙酸硫酯。可选地，所述 酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。本发明的某些实施方式中，所 述酰基硫酯能穿过生长于发酵培养基中的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞 膜。所述酰基硫酯通常选自下组：α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯 (DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基-巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁 酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯 (DMB-S-MMB)。在说明性实施方式中，所述酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S- 甲基-巯基丙酸酯，其在发酵培养基中混合至浓度范围为1mM-100mM，通 常可以约为10、20、30、40、50、60、70、80或90mM。本发明的一些实 施方式中，所述组合物还包含洛伐他汀，且组合物中辛伐他汀的量大于组 合物中洛伐他汀的量。

如下文所详述，本发明用于制备辛伐他汀的方法和材料可以调整用于 生成与辛伐他汀结构相似的化合物如胡伐他汀。在此情况中，本发明的一 种实施方式是制备胡伐他汀的方法，包括以下步骤：将经水解普伐他汀四 醇，在LovD酰基转移酶存在下提供酰基部分给经水解普伐他汀四醇的C8 羟基的酰基硫酯，以及LovD酰基转移酶变体混合在一起；然后使该LovD 酰基转移酶利用来自所述酰基硫酯的酰基区域特异性酰化经水解普伐他汀 四醇的C8羟基；从而制得胡伐他汀。本发明的相关实施方式是物质组合物， 其包含：经水解普伐他汀四醇；在LovD酰基转移酶存在下提供酰基部分 给经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰基硫酯；LovD酰基转移酶变体；和 胡伐他汀。

本发明的另一实施方式是物质组合物，其包含一种或多种胡伐他汀前 体，例如经水解普伐他汀四醇或6-羟基-6-去甲基红麴素J，存在根据对红 麴素J或红麴素J变体如经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰化能力选定的 硫酯。通常，这种组合物还可包括上述生物体。因此，本发明的实施方式 包括制备辛伐他汀或胡伐他汀物质组合物的方法，其基本如本文所公开和 举例说明。

在经改良的产辛伐他汀生物体(例如，有LDKS基因破坏的土曲霉)还产 生洛伐他汀(例如，一些极微残余量)的情况中，本文公开的方法和材料允许 操作所述生物体内的生化途径/过程从而辛伐他汀或相关化合物如胡伐他汀 成为这些途径的主要产物。相关实施方式是物质组合物，其含有生物体和 该生物体产生的辛伐他汀和/或胡伐他汀，其中所述组合物中辛伐他汀和/ 或胡伐他汀的量大于该组合物中洛伐他汀的量。

本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含本文所述LovD变体， 经水解普伐他汀和酰基硫酯。在说明性实施方式中，所述物质组合物包含 产胡伐他汀的大肠杆菌。在相关实施方式中，所述物质组合物是产胡伐他 汀的土曲霉(例如，有LDKS基因破坏的土曲霉)。在经改良的产胡伐他汀生 物体(例如，有LDKS基因破坏的土曲霉)还产生洛伐他汀(例如，一些极微 残余量)的情况中，本文公开的方法和材料允许操作所述生物体内的生化途 径/过程从而胡伐他汀成为这些途径的主要产物。相关实施方式是物质组合 物，其含有生物体和该生物体产生的胡伐他汀，其中所述组合物中胡伐他 汀的量大于该组合物中洛伐他汀的量。

本发明的某些实施方式中，可将其它组分和/或方法步骤与上述的一种 或多种方法和材料联用。例如，所述方法还可包含利用高细胞密度发酵来 提高LovD酰基转移酶的有效浓度，以及优化发酵条件和/或通过蛋白质工 程改造提高LovD酰基转移酶向一种或多种酰基硫酯的催化效率。很多其 它组分或方法可用于提高辛伐他汀或能促进辛伐他汀生成的某中间化合物 的生成。

如本文所述，“区域特异性酰化红麴素J的C8羟基的酰基硫酯”是具有 酰基的化合物，该酰基能用LovD和/或本文所述LovD变体转移至红麴素J 或相关化合物以产生辛伐他汀或相关化合物。本领域已知多种此类试剂， 在本文中进一步显示具有该活性(参见例如表1中的说明性酰基硫酯)。除了 本领域已知并在本公开中进一步显示具有该活性的那些以外，本领域已知 (或经从头合成的)且还具有酰化红麴素J的C8的能力从而生成辛伐他汀的 任何潜在酰基供体/载体可以通过与本文所述酰基供体(例如酰基-SNAC)的 比较实验方便地鉴定。此类实验中，所述酰基硫酯通常是丁酰硫酯，N-乙 酰基半胱胺硫酯或甲基-巯基乙酸硫酯。可选地，所述酰基硫酯包含中等链 长(C3-C6)的酰基部分。本发明的某些实施方式中，所述酰基硫酯能穿过生 长于发酵培养基中的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。所述酰基硫酯通常 选自下组：α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S- 乙基-巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯 (DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)。

如本公开所示，本发明的特性允许用最少实验来方便地鉴定作为“能区 域选择性酰化红麴素J的C8羟基的酰基硫酯”的化合物。在用于鉴定作为 “能区域选择性酰化红麴素J的C8羟基的酰基硫酯”的化合物的一种说明性 过程中，第一步是制备红麴素J和土曲霉的混合物。在第二步中，随后将 该混合物与测试化合物在发酵混合物中混合以允许生长。在第三步中，就 辛伐他汀的存在测试该混合物，例如通过利用HPLC分析来测试，其中存 在辛伐他汀表明该化合物具有此活性。考虑到本领域已知的高通量筛选方 法(参见例如，Kittel等，Metab.Eng.2005,7(1):53-58，其通过引用纳入本 文)，可在大量测试样品上进行此类方法从而方便地确定是否以及何种酰基 供体化合物具有使其能用于本文所述发明的实施方式中的用途。

本发明的实施方式还包括设计用于促进本发明方法的制品和/或试剂 盒。此类试剂盒通常包括根据本发明所述方法使用盒中元件的说明。此类 试剂盒可包含经区域化的载体用具以在封闭限制件中容纳一种或多种容器 用具如小瓶、管等，各容器用具包含一种待用于本方法的单独元件。例如， 一种所述容器可包括小瓶，例如含有编码本文所述LovD变体的质粒，所 述质粒可选在微生物宿主如大肠杆菌或土曲霉中(例如，有LDKS基因破坏 的土曲霉)，而另一瓶含有酰基-SNAC化合物或类似物，两者均可添加至发 酵混合物中以产生辛伐他汀。

在本发明的典型实施方式中，提供含有可用于制备辛伐他汀材料的制 品。该制品包含容器和标签。合适的容器包括例如，大瓶、小瓶、注射器 和试管。该容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。例如，该容器可容纳能 产生辛伐他汀的物质组合物(例如，酰基载体和生物体)。该容器上或与之相 连的标签表明所述组合物是用于检查细胞多肽。所述制品还可包含第二容 器，其含有另一化合物或底物用于例如添加至发酵混合物。例如，该混合 物或底物可用于在辛伐他汀制备中提高某些中间体如红麴素J的生成。还 可包括从商业和使用者立场来看可能需要的其他材料，包括其他缓冲剂、 稀释剂、填充剂、针头、注射器和具有使用说明书的插页。

以下部分讨论本发明的其它生物学方面。

本发明实施方式的生化方面

对LovD生化方面的讨论有助于对本发明某些方面的评价。在紧随部 分中，LovD酰基转移酶是SEQ ID NO:1所示土曲霉LovD多肽，且通常称 作“LovD”或“LovD酶”。如下文实施例中所示，LovD变体可用于使用野生 型LovD的情况中。这些段落中的部分讨论野生型LovD此前已知的生化方 面(例如，国际公开号WO 2007/139871中所公开的)以便更清楚地证明本文 所述发明的实施方式的用途。

在国际公开号WO 2007/139871中，证明了LovD酶对不同酰基供体的 非专一性。本公开教导了酰基载体/供体无需结合于LDKS。或者含硫醇载 体是合适的，包括酰基-CoA(辅酶A)，且更重要地，膜穿透性酰基-SNAC。 LovD无需与LovF相互作用，并能接受来自多种不同供体的酰基。此外， LovD可将多种酰基底物转移给红麴素J的C8羟基以产生各种洛伐他汀类 似物。LovD可用多种酰基底物区域选择性酰化红麴素J中的C8羟基位置。 成功的酰基有α-二甲基丁酰-SNAC，其在LovD和红麴素J存在下产生辛伐 他汀。LovD的转酰基活性已在体外证实，并可在异源宿主中重建。LovD 用α-二甲基丁酸酯直接酰化红麴素J以产生药学上重要的辛伐他汀。α-二 甲基丁酰-SNAC为细胞穿透性。α-二甲基丁酰-SNAC的细胞穿透性质具有 重要意义：可将该化合物作为前体体内给予表达LovD的生物体，例如原 核生物或真核生物。当所述原核生物或真核生物在红麴素J(内源产生或外 源提供给发酵培养基)存在下发酵时可直接产生辛伐他汀。例如，大肠杆菌 可用作生物转化红麴素J成辛伐他汀的微生物宿主。国际公开号WO 2007/139871中，添加红麴素J和二甲基丁酰-SNAC到过量表达LovD酶的 大肠杆菌菌株生长培养物中，然后以良好得率从培养物的发酵液中分离辛 伐他汀。

如上所述，LovD可在洛伐他汀生物合成中催化最终的酰基转移步骤， 并可区域特异性酰化红麴素J的C8羟基。LovD可针对萘烷糖苷配基、酰 基载体和酰基基团显示广泛的底物特异性。当补充有非天然底物α-二甲基 丁酰-SNAC时，LovD可在体外和体内产生药学上重要的辛伐他汀。当提供 α-二甲基丁酰-硫酯前体给LovF缺陷型土曲霉菌株时，洛伐他汀生物合成 途径可重定向为直接产生辛伐他汀。

国际公开号WO 2007/139871教导了LovD对不同酰基取代物的耐受 性，用多种市售可得的酰基-CoA进行转酰基试验。试验采用1mM红麴素 J，4mM酰基-CoA和10uM LovD进行10小时。结果明确表明，LovD多 肽显示针对中等链长(C3-C6)酰基的偏好，丁酰-CoA是最适烷基酰基-CoA 底物。更大的苯甲酰-CoA所检测的最佳酰基底物之一，近70%辛伐他汀转 化成相应的8-苯甲酸基-洛伐他汀类似物(表观k_cat=0.16分钟^-1)。如丁烯酰 -CoA存在下6%红麴素J酰化可见，引入α-β不饱和显著降低了反应率。乙 酰乙酰-CoA和β-羟基丁酰-CoA都是LovD的优良底物，这分别与洛伐他 汀X(参见例如A.Endo,K.等，J.Antibiot,1986,38,321-327)和洛伐他汀M (参见例如，A.Endo,D.等，J.Antibiot.1986,39,1670-1673)从天然宿主的分 离良好一致。所试验的CoA底物中，LovD对丙二酰-和棕榈酰-CoA无活性。

国际公开号WO 2007/139871进一步检查了LovD对其它酰基载体的底 物特异性，特别是更易合成制备且可在体内条件下穿透细胞膜的那些酰基 载体。N-乙酰基半胱胺硫酯(SNAC)已在天然产物生化研究中广泛用作探针 和前体(参见例如，Auclair等，Science,1997,277,367-369)。近来显示甲基 -巯基乙酸酯(SMTG)是红霉素的前体导向生物合成中SNAC的一种符合成 本效益的替代物(参见例如，S.Murli,K.S.等，Appl.Environ.Microbiol.2005, 71,4503-4509)。SNAC和SMTG硫酯有效替换丁酰-CoA，表观k_cat值分别 为0.09分钟^-1和0.23分钟^-1，进一步凸显酰基转移无需LovD和LovF间 的蛋白-蛋白相互作用，以及LovD和磷酸泛酰巯基乙胺臂之间的相互作用。

国际公开号WO 2007/139871教导了合成的α-S-甲基丁酰-SNAC和α- 二甲基丁酰-SNAC可分别用于针对体外化学酶促合成洛伐他汀和辛伐他汀 的试验。结果见国际公开号WO 2007/139871中的图8。此公开教导了天然 的α-S-甲基丁酸酯侧链与丁酰-，戊酰-和己酰-SNAC相比出乎意料的是更 差底物。洛伐他汀合成的表观k_cat(~0.04分钟^-1)比LovD对丁酰-SNAC的 慢50%。这提供证据表明野生型LovD未经针对转移分支底物的优化。在 α-位置添加第二个甲基取代物进一步减缓酰化率，这类似归因于二甲基部 分的位阻增加。国际公开号WO 2007/139871中的公开和本文提供的公开一 起提供证据表明LovD可针对所需特性进行突变，例如涉及支链底物转移， 聚集减少；热稳定性改善；催化活性改善；k_cat/K_m值改善；可溶表达水平 改善；和/或25°C下的全细胞活性改善的那些。(例如，利用定向蛋白进化 方法如下文实施例2中所公开的那些方法)。

整篇申请中引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用全文 纳入本文。

实施例

以下实施例提供可用于实施本文所述发明的各种实施方式的说明性方 法和材料。技术人员了解可调整供本文所述发明的实施方式使用的此技术 的各方面在以下文献中有教导：国际公开号WO 2007/139871；Xie等，Chem  Biol.200613(11):1161-9；Xie等，Appl Environ Microbiol.2007年4月； 73(7):2054-60；Xie等，Biotechnol Bioeng.20091;102(1):20-8；Xie等，J Am  Chem Soc.2009;131(24):8388-9和Gao等，Chem Biol.2009年10月30日； 16(10):1064-74，其内容各通过引用纳入本文。

实施例1：LOVD的定点诱变导致全细胞辛伐他汀生成提高

本实施例证明LovD的定点诱变如何产生能提高全细胞辛伐他汀生成 的LovD变体。

本实施例中，采用定点诱变来改善LovD的溶解度。所得突变体A1N3 在全细胞实验中比野生型更有效。我们还优化了高细胞密度发酵以在更短 时间内产生更多重组蛋白从而提高全细胞LovD活性，这可用作大规模生 成辛伐他汀的平台。LovD蛋白和发酵的组合优化提供的辛伐他汀生成比此 前高许多，辛伐他汀产率~20g/L可作为现行多步方法具有吸引力的替代选 择。

简要来说，当使用大肠杆菌bioH缺陷型菌株YT2/pAW31作为全细胞 生物催化剂时，过量表达的酰基转移酶LovD在12小时内催化转化15mM 红麴素J(MJ)酸和18mM DMB-S-MMP成辛伐他汀。LovD的SDS-PAGE 分析显示，大肠杆菌中一半以上的LovD蛋白为不可溶表达，且LovD的天 然凝胶研究显示LovD的重组表达形成~20%的寡聚体，即使存在高浓度 DTT。为确定负责寡聚化的半胱氨酸残基，通过定点诱变将LovD中的9 个半胱氨酸各自用丙氨酸取代以产生9种突变体(名为A1-A9)。结果表明这 9个半胱氨酸中有7个为LovD的完整单体结构所必需，而第一和第三半胱 氨酸可形成导致寡聚化的分子间二硫键。对这些突变体的进一步研究显示 破坏分子间二硫键(A1和A3)可增加所得蛋白质的溶解度并改善全细胞生 物转化(定义为活性)。由于A1和A3的更高活性，我们进一步研究这两个 位点上其它残基的影响，例如Ser(S)，Thr(T)，Asn(N)和Glu(Q)。我们发 现A1和LovD C60N(N3)比相关位点的其它突变体具有更高的全细胞活性。 两种突变体都显示活性比野生型高~25%。正如我们所预期，双突变体A1N3 结合了两种突变的益处并给出最高的全细胞活性，比野生型改善了~50%。 当采用YT2/A1N3作为全细胞生物催化剂时，经优化的高细胞密度发酵研 究显示所述突变体可在18小时内将45mM MJ酸完全(>99.5%)转化成辛伐 他汀酸，而野生型YT2/pAW31在同一条件下即使用更长时间(26小时)仍仅 能达到91%的转化。配有突变体A1N3和经优化的发酵方法，全过程能够 方便地放大用于辛伐他汀的工业生产。

材料和方法

通用过程

大肠杆菌XL-1 Blue(司查塔基公司(Stratagene))用于DNA克隆。底物 红麴素J(MJ)酸和DMB-S-MMP按此前所述制备(参见例如，Xie等，2007; Appl Environ Microbiol 73:2054-2060)。YT2用作蛋白表达宿主。所有试剂 购自标准源。化合物分析用HPLC进行，采用反相C18柱(奥泰阿波罗 （Alltech Apollo）5u,150mm x 4.6mm)；线性梯度：含60%CH3CN的水 (0.1%三氟乙酸[TFA])-含95%CH3CN的水(0.1%TFA)持续10分钟，流速 为1毫升/分钟。

定点诱变：

通过定点诱变利用pAW31为模板和下列引物产生LovD C40A(A1)、 C49A(A2)、C60A(A3)、C72A(A4)、C89A(A5)、C216A(A6)、C266A(A7)、 C380A(A8)、C395A(A9)、C40S(S1)、C60S(S3)、C40T(T1)、C60T(T3)、 C40N(N1)、C60N(N3)、C40Q(Q1)、C60Q(Q3)突变。用A1为模板， LovD_C60A_PvuII_F和LovD_C60A_PvuII_R为引物产生A1N3双突变体。 通过将密码子序列直接改变为所需氨基酸密码子序列来设计大多数引物， 但有些通过沉默突变引入一个限制性位点以便于克隆。所引入的突变经 DNA测序证实。

下面仅列出正向引物。反向引物是正向引物的反向互补。F表示正向 引物。编号显示突变氨基酸的位置。编号前与编号后的字母显示改变前与 改变后的氨基酸。带边框的碱基对应于待突变的氨基酸遗传编码。 LovD_C40A_NheI_F：ATCATGGCCCGAGATAGGGCAATCTAAATTAT(SEQ  ID NO：6)；LovD_C49A_MluI_F：TCTAAATTATACGCGTTTCGGGGCTCGGAC (SEQ ID NO：7)；LovD_C60A_MfeI_F： GTGCGACGGGACGAGCAATCATGCCGCCGCTACAGGTC(SEQ ID NO：8)； LovD_C72A_F：CAGGTCGACACCCCCCCGGCTCGCCAGTGC(SEQ ID NO：9)； LovD_C89A_F：TCATGGCCCTACAACATGGAGCGCGGTCTC(SEQ ID NO：10)； LovD_C216A_F：CTGCAGGAGAATATCTGCGCCGCTGGGCAT(SEQ ID NO：11)； LovD_C266A_F：GCCGATGGAGAGGAGCTTCGGCGGCCAGG(SEQ ID NO：12)； LovD_C380A_F：CCCAAAGCCGGCCTGACCCTTGCGTTCTT(SEQ ID NO：13)； LovD_C395A_F：TGGAATGACCCGGTCTCGTGATCTGACACG(SEQ ID NO：14)； LovD_C40S_F：GGTCATCATGGCCCGAGATTCAGTGGCAATCTAAATTATA(SEQ  ID NO：15)；LovD_C60S_F： GACGGTGCGACGGGACGAGTCAATCAGCTGCCGCCGCTAC(SEQ ID NO：16)； LovD_C40T_SpeI_F：

CGGTCATCATGGCCCGAGATAGTGGCAATCTAAATTATAC(SEQ ID NO：17)； LovD_C60T_F：GGACGGTGCGACGGGACGAGCAATCAGCTGCCGCCGCTAC (SEQ ID NO：18)；LovD_C40N_F： CGGTCATCATGGCCCGAGATCAGTGGCAATCTAAATTATA(SEQ ID NO：19)； LovD_C60N_F：GGACGGTGCGACGGGACGAGCAATCAGCTGCCGCCGCTAC (SEQ ID NO：20)；LovD_C40Q_F： CGGTCATCATGGCCCGAGATAGTGGCAATCTAAATTATAC(SEQ ID NO：21)； 和LovD_C60Q_F： GGACGGTGCGACGGGACGAGAATCAGCTGCCGCCGCTACA(SEQ ID NO： 22)。

EP-PCR与构建突变体库

Ep-PCR过程改良自已确立方案。反应由以下组成：0.35mM dATP， 0.4mM dCTP，0.2mM dGTP，1.35mM dTTP，4mM MgCl₂，0.25mM MnCl₂ 和2.5U Taq聚合酶。反应混合物进行25轮PCR：94°C 1分钟，55°C 1分 钟和72°C 3分钟。所得PCR产物用DpnI消化，用EcoRI和NdeI进一步消 化，并连接至pET28(a)。将连接混合物转化至YT2并接种到含35mg/L卡 那霉素的LB琼脂上。

蛋白表达与纯化：

将各突变体转化入大肠杆菌YT2菌株并用卡那霉素(Kan)选择。转化株 在500ml LB-Kan培养基中37°C生长至OD₆₀₀ 0.4~0.6，然后加入0.1mM IPTG以诱导蛋白表达，20°C下持续16小时。离心收集细胞，重悬于30ml 缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM DTT，2mM EDTA)并超声裂解。 离心去除细胞碎片和不溶蛋白(16,000g，4°C，1小时)。向澄清的裂解液中 加入2ml Ni-NTA树脂(凯杰公司(Qiagen))。各突变体用具有递增咪唑浓度 的缓冲液A的不连续梯度来纯化。纯(>95%)LovD蛋白洗脱入含250mM 咪唑的缓冲液A中，然后缓冲液更换为无咪唑的缓冲液A。添加甘油至终 浓度10%，将蛋白等分并快速冷冻。

全细胞生物催化：

从MJ酸和DMB-S-MMP全细胞催化合成辛伐他汀酸按前人所述进行 (参见例如，Xie等，2007;Appl Environ Microbiol 73:2054-2060)。培养LovD 野生型和所有突变体以供比较。用新鲜转化菌株的单一菌落接种补充有35 mg/L kan的5ml LB培养物，37°C生长过夜。次日早晨，将100μl过夜培 养物(0.2%)接种至含卡那霉素的50ml LB中。OD₆₀₀达到0.4~0.6时，添加 0.1mM IPTG至培养物，LovD的表达在20°C进行16小时。为模拟高密度 发酵条件，在添加底物前将细胞浓缩10倍。离心收集14ml的等分培养物 (4°C，4000g，10分钟)。将细胞团块温和重悬于1330ml上清液中，然后 添加70ml MJ酸的母液(300mM的水溶液)使终浓度为15mM。然后将浓缩 的培养物重悬并分成7份200μl样品，各样品中加入1μl纯DMB-S-MMP(终 浓度~20mM)。然后将培养物于室温下300rpm振荡。在各时间点，通过添 加10μl 20%SDS以完全裂解细胞然后用500μl EA/2%TFA液-液萃取，进 行全提取。移除有机相，蒸发，再重溶于500μl ACN以供HPLC分析。

选择高活性突变体(筛选)

粗糙链孢霉在SDA斜面上生长10天，用1%吐温-80收获孢子。100ml 熔化的SDA接种有0.3-0.5×10⁸孢子并倾倒入230×230mm平板。将来自突 变库的菌落在含250μl LB培养基(具有35mg/L卡那霉素)的96孔板中培 养。细胞于37°C生长至饱和然后转至复板。用0.1mM IPTG在OD₆₀₀为0.5 时诱导蛋白表达，所述表达在25°C进行16小时。添加5mM MJA和10mM DMB-SMMP以启动反应。一定反应时间(根据母本活性取45分钟-4小时) 后，离心移除细胞(2,000g，4°C，5分钟)。点样到SDA板的上清液量通常 为1~3μl。平板在30°C孵育16~18小时。根据抑制区的视觉比较选择改善 的突变体。

确定全细胞生物催化活性

平行培养野生型LovD和所有突变体以供比较。用新鲜转化YT2感受 态细胞的单一菌落接种补充有35mg/L卡那霉素的5ml LB培养物。37°C 生长过夜后，将100μl培养物接种入补充有35mg/L卡那霉素的50mL LB 培养基。OD₆₀₀达到0.4~0.6时，添加0.1mM IPTG至培养物，所有LovD 变体的表达在25°C进行16小时。为模拟高密度发酵条件，在添加底物前 将细胞浓缩10倍。离心收集各培养物的10ml等分样品(4°C，2,000g，10 分钟)。将细胞团块温和重悬于1ml培养基上清液中，然后添加70μl MJA (300mM母液)至终浓度15mM。然后将浓缩的培养物分成7个200μl等分 样品，各样品中加入1μl纯DMB-SMMP至终浓度20mM。然后将小培养 物于25°C下300rpm振荡。在各时间点，通过添加10μl 20%SDS用于细 胞裂解然后用含1%三氟乙酸的500μl乙酸乙酯提取来进行一个培养物等 分样品的全提取。移除有机相，蒸发，再重溶于500μl乙腈以供HPLC分 析。全细胞活性由转化时程图线性区的拟合确定。

圆二色性TM测定(热稳定性)

通过添加50μg蛋白质至250μl 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)制备样 品。将样品置入光程1cm的石英比色皿中，在珀耳帖控制室内以每分钟1°C 的速率加热。在Jasco旋光分光计(分光公司(Jasco)，马里兰州伊斯顿)中于 222nm下检测椭圆度。变性曲线的中点用Microcal Origin 5.0软件 (OriginLab公司，马萨诸塞州诺汉普顿)测定。

LOVD野生型与突变体的动力学试验：

为得到MJ酸的K_m值和k_cat，将DMB-S-MMP浓度固定于2mM，而 MJ酸的浓度从0.25mM到2mM不等。添加二甲亚砜(DMSO)至终浓度10% 以促进DMB-S-MMP溶解。为比较所有突变体和野生型蛋白质的转换率， 将MJ酸的浓度设为1mM而DMB-S-MMP浓度设为2mM，蛋白质浓度固 定于10uM，反应在室温下进行2小时后，通过添加EA/2%TFA淬灭反应。 干燥有机相，并重溶于500μl ACN以供HPLC分析。

高密度F1补料批式发酵

我们使用此前文章中所述的相同方法，稍加改动(参见例如，Pfeifer等， 2002；Appl Environ Microbiol 68(7):3287-92)。接种基本培养基和发酵培养 基中都排除维生素溶液，但生物素例外，因为已敲除bioH基因的YT2菌 株需要生物素以正常生长。菌株YT2/pAW31或YT2/A1N3在5ml LB培养 基(含35mg/L卡那霉素)中以37°C与250rpm生长过夜，用1ml过夜培养 物接种100ml F1培养基(含35mg/L卡那霉素)。该F1培养基再生长12小 时，将25ml等分样品离心沉淀，细胞团块重悬于10ml F1培养基中并接 种入含1升F1培养基的2.5升Applikon Biobundle罐中。细胞于37°C生长， 实验过程中用2M HCl和半浓缩的NH4OH将H维持在7.1。搅拌速率和 气流速率调整为将溶氧(DO)水平维持在20%以上，通常搅拌维持在1200 rpm而通气控制在0.4~0.5升/分钟。一旦由DO水平快速上升表明发酵罐 中葡萄糖已消耗，用蠕动泵以0.3毫升/分钟递送补料溶液给发酵罐。OD₆₀₀达到20时，用冷却水将发酵温度降至25°C，添加0.5mM IPTG至发酵罐 以诱导蛋白质表达。蛋白表达再保持12小时，然后停止补料和通气，搅拌 降至250rpm并将pH缓慢调节至7.8，将底物MJ酸和DMB-S-MMP加入 发酵罐以启动生物转化。MJ酸溶于水中(添加NaOH以帮助溶解)至终浓度 500mM，DMB-S-MMP以纯物质添加。添加速率控制在4.0mM/h(MJ酸) 以使对细胞的扰动最小，10小时后停止添加。整个过程中用HPLC检查转 化速率。

纯化和下游处理

转化完成或达到平衡时，添加20g SDS至发酵罐并搅拌30分钟以完 全裂解细胞，添加6M HCl将pH调至5.0并搅拌10分钟。加入1L乙酸乙 酯(EA)并再搅拌30分钟以提取产物。将混合物倒入分液漏斗，等待约1小 时并分离。水相再用1L EA提取。合并EA相(~2L)并通过旋转蒸发浓缩至 约500ml，然后将EA溶液用饱和NaCl水溶液洗涤并用无水Na₂SO₄干燥 并过滤。EA溶液浓缩至终体积150ml并用50%饱和NH4OH与50%甲醇 处理至最终pH=9.6。溶液于4°C保持1小时，通过滤纸过滤并用EA充分 洗涤得到白色固体，该固体在真空下干燥过夜并称重。终产物的纯度用 HPLC测定。

实验结果

丙氨酸扫描突变后，9种突变体中的2种显示更高的全细胞活性(参见 例如，Morrison等，2001;Curr Opin Chem Biol 5(3):302-7)：

LovD蛋白用一步式Ni-NTA柱纯化至均质(图2a)。从野生型lovD的 天然凝胶中发现，即使在高DTT浓度下，仍有~20%的LovD蛋白形成寡聚 体。蛋白质之间的二硫键对于蛋白质结晶具有欺骗性，因为单体与寡聚体 是不同物质(参见例如，Nemoto等，2006;J Appl Physiol 100(5):1688-91)。 我们的目的之一是去除分子间二硫键。我们希望通过用丙氨酸取代半胱氨 酸得到LovD突变体，其能在保留酰基转移酶活性的同时破坏分子间二硫 键。我们还发现在大肠杆菌中表达时，所表达LovD蛋白中超过50%为不 可溶的。我们推断当野生型LovD之间的分子间二硫键消除时，LovD的溶 解度可能改变(参见例如，Lindberg等，M.2004;Proc Natl Acad Sci U S A 101(45):15893-8)。

LovD蛋白中有9个半胱氨酸，位于C40、C49、C60、C72、C89、C216、 C266、C380、C395(C1-C9)。我们首先利用同源性分析来鉴定这9个半胱 氨酸中哪些可能暴露表面，并因此可能形成不希望的二硫键。利用具有中 等序列同源性(~20%)的EstB酯酶为模板(参见例如，Wagner等，1997;Acta  Crystallogr D Biol Crystallogr 53(Pt 5):596-8)，发现5个半胱氨酸C1、C2、 C3、C7和C9是形成相关二硫键的可能残基。我们将所有9个半胱氨酸残 基逐个突变成丙氨酸以产生9种单突变体，名为A1-A9。突变体的序列由 DNA测序证实。

我们将所有突变蛋白和野生型LovD蛋白一起跑天然凝胶(图2b)。根据 天然凝胶，A3形成几乎全部单体，而A1的单体稍多于比野生型LovD蛋 白。其余突变体未改变寡聚体的百分比，而有些突变体如A4、A5和A7不 很稳定并快速形成包涵体。A9完全不产生可溶蛋白。结果表明只有第一和 第三半胱氨酸可形成分子间二硫键导致寡聚化。

然后我们测试9种突变体的体内活性与野生型LovD作比较。突变体 和野生型LovD菌株都在LB培养基中生长，表达并在20°C表达16小时后 浓缩10倍以模拟高密度发酵。分别添加MJ酸和DMB-S-MMP至终浓度15 mM和18mM以启动反应。在8小时，取100μl样品培养物以检查从MJ 酸到辛伐他汀酸的总转化。图3显示所有所有突变体相较野生型的相对活 性，将野生型转化标准化至100%。由结果可见大多数突变为不利的，并显 示较低的全细胞活性(A2,A4-A8)或无活性(A9)。我们推断那些半胱氨酸可 能形成使蛋白质结构稳定的分子内二硫键。大多数突变体很可能破坏分子 内二硫键，松开蛋白的三维结构并使蛋白质不稳定而形成包涵体(参见例 如，Wakabayashi等，2007;J Biol Chem 282(38):27841-6)。该结果帮助我们 了解哪个半胱氨酸使蛋白质结构稳定以及哪个半胱氨酸不利于稳定结构。 在所有突变体中，A1显示最高活性，根据相较野生型的转化其活性提高 ~25%，而A3的活性稍高于野生型。C9位置对于LovD稳定性很关键，因 为在表达A9时未测得可溶蛋白质。

全细胞活性更高是因为溶解度更高

有3种可能性会引起更高的全细胞活性。其一是突变体比野生型更可 溶，另一是突变体的转换率比野生型LovD高，或者是两者的组合。为发 现为何A1与A3在全细胞实验中显示更高活性而其它却丧失活性，我们测 定了所有突变体的蛋白表达水平。所有9种突变体和野生型LovD蛋白同 时并在相同条件下纯化。蛋白纯化自50ml LB培养物。LovD洗脱在含有 250mM咪唑的最后部分中。最后部分的浓度用Bradford法以BSA为标准 测定。有意思的是，我们发现突变体与野生型之间可溶蛋白的比例和突变 体与野生型之间转化的比例一致(图3)。A1的溶解度比野生型高28%，而8 小时时间点的A1转换率比野生型高31%。图3显示突变体蛋白的不同溶解 度可能是不同全细胞活性的唯一原因。

为进一步证实LovD突变体的全细胞活性是由于蛋白溶解度不同引起， 用体外试验确定LovD突变体的k_cat和K_m。将DMB-S-MMP的浓度固定在 2mM而MJ酸的浓度从0.25mM到2.0mM不等。测得LovD野生型和选 定突变体A1、A3的k_cat分别为0.62、0.62和0.64分钟^-1，MJ酸的K_m分别 为0.64、0.68和0.66mM。这三种酶之间的动力学常数显示它们之间实际 上没有区别。对于其余LovD突变体蛋白，我们仅检查一个时间点的转化。 该试验将MJ酸和DMB-S-MMP浓度固定于1mM和2mM，LovD蛋白固 定于10uM，2小时的转化显示它们具有相同的转换率。在全细胞实验中， 两种底物的浓度都远高于MJ酸和DMB-S-MMP的K_m，因此全细胞活性只 与k_cat及可溶蛋白的量相关。该体外动力学试验进一步证实全细胞活性的差 异只是因为突变体溶解度的差异。

双突变A1N3显示最高的全细胞活性

丙氨酸扫描突变后，我们发现第一和第三半胱氨酸取代显示活性比野 生型高。我们推断进一步研究这两个位点可能给出更好的突变体。由于半 胱氨酸和丙氨酸之间的不同物理性质和大小，前者为极性且稍大，而后者 为非极性且较小，我们将半胱氨酸改变为其它氨基酸如丝氨酸(S)、苏氨酸 (T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。用同样的定点突变方法产生突变体并分 别定名为S1、S3、T1、T3、N1、N3、Q1和Q3。我们用相同的体内实验 检查所有突变体的全细胞活性。转化显示第一位置的A1仍具有最高活性， 而第三位置的N3具有最高活性(图4)。根据8小时转化，这两种突变体都 有~25%的改善。然后联合这两个突变以通过定点突变产生双重突变体 A1N3。图5中绘出LovD野生型、A1、N3和A1N3的时程。试验采用前 述的相同条件，并每2小时检查转化。如我们所预期，A1N3组合了两种突 变的有益性质，并在~8小时内完成反应。A1N3比野生型快约50%，而比 单一突变体A1和N3快约20%。体外试验和蛋白表达水平实验也证明双重 突变体A1N3的更高活性是因为该蛋白的溶解度更高。双重突变体A1N3 的结果显示在蛋白不同位置的突变有协同性(参见例如，Geddie等，2004;J  Biol Chem 279(25):26462-8)。

高细胞密度发酵

我们的最终目标是证明我们的方法能用于大规模辛伐他汀生产，因此 我们优化高细胞密度发酵并测试野生型LovD及双重突变体A1N3。研究了 葡萄糖限制(葡萄糖为有限源)和DO限制(溶氧为有限源)以比较全细胞活性 (参见例如，Qoronfleh,1999;Appl Biochem Biotechnol 80(2):107-20)。我们 发现来自葡萄糖限制的特定LovD活性远高于来自DO限制的活性，尽管它 们的OD₆₀₀读数非常相似，这可能是因为葡萄糖和乙酸累积影响了细胞生 长和重组蛋白表达。因此在我们的发酵过程中，DO水平保持在20%以上来 使葡萄糖和乙酸浓度最低。我们还发现25°C时的表达给出最高的全细胞活 性。升高温度导致更多LovD沉淀，而降低温度导致细胞生长缓慢并需要 更长的表达时间。与LovD全细胞活性相关的另一重要因素是pH值。细胞 在pH=7.1下生长和表达，该pH对反应无效。在将MJ酸转化成辛伐他汀 中，pH 7.8给出最高的全细胞活性，因此我们在添加底物前缓慢升高pH至 7.8。在转化中底物添加也非常重要。高浓度的MJ酸和DMB-S-MMP对细 胞有害，因此我们缓慢添加这两种底物以使对细胞的扰动最小。缓慢添加 底物至发酵罐仍导致细胞吸光度迅速降低(图6)。添加底物至发酵罐后，用 HPLC追踪辛伐他汀酸的形成。YT2/A1N3用18小时将45mM MJ酸完全 转化成辛伐他汀酸，而YT2/pAW31在26小时中有91%的转化。即使延长 反应时间，pAW31/YT2的转化不能再提高。YT2/A1N3和YT2/pAW31的 平均反应速率分别为2.5mM/h和1.6mM/h，这表示大规模发酵中双重突变 体的全细胞活性效率是野生型的150%。

在下游纯化处理中，将细胞完全裂解以释放产物，因为几乎一半产物 保留在细胞内。难以直接从培养液中以酸或内酯形式回收纯的辛伐他汀， 我们以铵盐形式回收产物。裂解细胞后，将pH缓慢调节至5.0以避免HCl 局部高浓度产生辛伐他汀丁内酯形式。用EA提取产物并浓缩后，添加50% 甲醇和50%饱和NH4OH混合物至EA溶液以转化辛伐他汀酸成辛伐他汀铵 盐(SAS)。一旦形成SAS，将盐从EA相沉淀出来。SAS干燥过夜并称重以 计算得率。对于该最佳突变体A1N3，我们可添加用以完全转化成辛伐他汀 的最高MJ酸量为45mM。添加更多底物导致较低的最终转化。在1升发 酵罐中从45mM MJ酸开始，最终可自细胞液中回收36mmol SAS。从MJ 酸到SAS的总得率是80%。大多数损失是在提取步骤中。通过对回收过程 的优化和对蛋白质的进一步改进，可回收更多产物，且总得率将更高。

总之，我们通过丙氨酸扫描突变探索了LovD中9个半胱氨酸中的每 一个。我们发现9个半胱氨酸中的两个(C1和C3)负责分子间二硫键形成， 而其余半胱氨酸(C2，C4-C8)对于稳定蛋白结构很重要。C9对于LovD正确 折叠成为可溶性形式是必要的。两个突变体A1和A3显示更高的全细胞活 性，因为它们比野生型更可溶。在第一位和第三位的不同残基取代显示A1 和N3具有比其它突变体更快的转化。所有突变体中双重突变体A1N3显示 最高活性，意味着两种突变协同作用。对高细胞密度发酵优化后，我们用 F1基本培养基比较LovD野生型和突变体A1N3的反应速率。突变体 YT2/A1N3显示能力改善并能在18小时内将45mM MJ酸转化成辛伐他汀， 而野生型YT2/pAW31用时更长且在相同条件下只能达到91%。我们用随 机诱变和DNA改组方法基于A1N3进一步改善LovD的热稳定性和转换率。

实施例2：辛伐他汀合成酶的定向进化和结构鉴定

本实施例证明LovD的定向诱变如何产生能提高全细胞辛伐他汀生成 的LovD变体。

本实施例中，我们采用定向蛋白进化(参见例如，Arnold等，(1999)Curr. Opin.Chem.Biol.3,54-59)来改善LovD的SV合成酶活性。在7轮筛选后， 分离出具有显著改善催化活性和更高热稳定性的LovD突变体。平行获取7 个X射线晶体结构，包括母本LovD G0，改善型突变体G5，和G5与MJA、 LVA及SVA的共结晶结构。对于催化机制，底物及产物结合，与LovF的 蛋白-蛋白相互作用，和关于有益突变对催化的影响的可能解释，晶体结构 提供了原子分辨率详细情况。

天然产物生物合成途径中所见的修饰酶催化多种反应，包括酰基转移 (参见例如，Loncaric等，(2006)Chem.Biol.13,309-317)，糖基化(参见例如， Zhang等，(2006)Science 313,1291-1294)，羟基化(参见例如，Rix等，(2002) Nat.Prod.Rep.19,542-580)和卤化(参见例如，Neumann等，(2008)Chem. Biol.15,99-109)。许多这些酶通过区域选择性和立体选择性转化将生物学 上无活性的前体修饰成药学活性分子。因此，修饰酶对于半合成衍生物和 药库的合成是有吸引力的候选生物催化剂(参见例如，Zhou等，(2008)Curr. Opin.Biotechnol.19,590-596)。LovD是发现于土曲霉的酰基转移酶，负责 通过酰化α-S-甲基丁酸酯侧链将无活性前体红麴素J酸(MJA)转化成降胆固 醇药物洛伐他汀(LV，酸形式为洛伐他汀酸：LVA)(参见例如，Kennedy等， (1999)Science 284,1368-1372和Xie等，(2006)Chem.Biol.13,1161-1169) (图7)。疏水性α-S-甲基丁酰侧链对LVA结合HMG-CoA还原酶的重要性 已经在结构上得到证实(参见例如，Istvan等，(2001)Science 292, 1160-1164)。将LV侧链化学修饰为α-二甲基丁酸酯得到半合成衍生物辛伐 他汀(SV，酸形式为辛伐他汀酸：SVA)，其为重磅药品中的活性药 物成分(参见例如，Hoffman等，(1986)J.Med.Chem.29,849-852)。从LV 半合成SV是多步骤的化学过程，因此是设计有效生物催化方法的努力追求 目标(参见例如，Morgan等，WO 2005040107和Berg等，WO 2007147801)。 因此，LovD是用作此类生物催化剂的首要候选。

LovD是413个氨基酸的蛋白质，根据一级序列分析预测具有α/β水解 酶折叠(参见例如，Kennedy等，(1999)Science 284,1368-1372)。已知与LovD 结构同源的酶之一是头孢菌素酯酶，EstB(PDB ID 1CI9,26%序列相同性)， 来自唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)(参见例如，Wagner等， (2002)Protein Sci.11,467-478)。通过LovD与EstB的比对(图8A)指出可能 的通用碱基Tyr188，以及含活性位点亲核性Ser76的保守SXXK片(参见例 如，Petersen等，(2001)J.Biotechnol.89,11-25)。在LVA生物合成中，α-S- 甲基丁酸酯侧链由洛伐他汀二酮合成酶(LDKS)LovF合成，然后由LovD通 过此前未见的聚酮卸载机制区域选择性转至MJA的C8羟基(参见例如，Xie 等，(2009)J.Am.Chem.Soc.131,8388-8389)。LovD和LovF的酰基载体蛋 白(ACP)结构域间的蛋白-蛋白相互作用促进土曲霉中这一高效的修饰反 应。我们此前探索了LovD的底物非专一性并已显示它还能通过利用小分 子底物α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-SMMP)为酰基供体来合成 SVA(参见例如，Xie等，(2007)73,2054-2060)(图7)。以大肠杆菌为表达宿 主建立了能以低通量产生SVA的全细胞生物催化平台，用于将MJA转化 成SVA(参见例如，Xie等，(2007)73,2054-2060)。但是，和许多从其天然 环境移除的酶一样，作为生物催化剂的LovD在催化上未达最佳，且受累 于弱热稳定性(参见例如，Arnold,F.H.(2001)Nature 409,253-257)。用 DMB-SMMP合成SVA的催化活性比结合LovF的天然底物减弱~1,300倍 (参见例如，Xie等，(2009)J.Am.Chem.Soc.131,8388-8389)，表明有充分 机会通过蛋白工程改造努力而进行优化。此外，LovD功能的结构基础和底 物选择尚未阐明，限制了我们合理优化非天然二甲基丁酰底物结合并改善 LovD作为SV合成酶的效率的能力。

如下所述，我们采用定向蛋白进化(参见例如，Arnold等，(1999)Curr. Opin.Chem.Biol.3,54-59)来改善LovD的SV合成酶活性，然后鉴定这些 LovD变体的晶体结构，来对催化机理，底物与产物结合，与LovF的蛋白- 蛋白相互作用，以及关于有益突变影响催化的可能解释提供原子分辨率的 详情。

结果

开发基于琼脂的扩散筛选方法

我们开发了高通量筛选方法用以分析表达LovD突变体的大肠杆菌， 所述突变体在从MJA和DMB-SMMP合成SVA中具有改善的性质。该试 验依赖于他汀对粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的生长抑制，这一性质此前 用于产高LV的土曲霉菌株筛选(参见例如，Kumar等，(2000)J.Microbiol. Methods 40,99-104)。我们发现SVA能在次微克量下抑制粗糙链孢霉的生 长，而由MJA抑制需要百微克的量。为证明该试验的灵敏度和可行性，对 表达野生型LovD的大肠杆菌培养物补充10mM MJA和15mM DMB-SMMP。在不同时间点，将2μL等分样品直接点样在以0.3~0.5x108 个孢子/L密度包埋有粗糙链孢霉的沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud's Dextrose  Agar)(SDA)板上。30°C孵育16小时后，对含有不同程度MJA至SVA转 化(由HPLC证实)的样品观察到不同的抑菌区(图9A)。基于此筛选策略， 对全细胞LovD活性的任何显著影响例如溶解度、催化效率和稳定性的改 善，都能引起可测的表型变化。

筛选具有增强全细胞活性的LOVD变体

用于定向进化的起始LovD(0代或G0)是此前鉴定的双重突变体 C40A/C60N(参见例如，Xie等，(2009)Biotechnol.Bioeng.102,20-28)。G0 经合理工程改造为较不易有二硫键介导的聚集，并用于结晶研究(参见例 如，Xie等，(2009)Biotechnol.Bioeng.102,20-28)。用饱和诱变或每轮平均 产生2.5个氨基酸变化的易错聚合酶链反应(ep-PCR)产生突变库(参见例如， Fromant等，(1995)Anal.Biochem.224,347-353)。在每轮筛选中，将突变 库连接入pET28(a)，然后电转入YT2感受态细胞(参见例如，Xie等，(2007) Metab.Eng.9,379-386)。在96孔板中培养单独的突变体，然后诱导LovD 表达，添加MJA和DMB-SMMP，点样到粗糙链孢霉包埋板上。图13显示 4轮ep-PCR(G1,G2,G4,G6)、1轮饱和诱变(G7)和2次迭代组合个体有益 突变(G3,G5)后所得全细胞活性的逐步改善，最优突变体G7显示作为SV 合成酶的全细胞活性相比G0提高~11倍(图9B)。突变体G2.1含有氨基酸 改变D12G和G275S。与G1相比，用G1为模板构建相应的单突变体显示 单独D12G具有较大负效应，而单独G275S具有弱正效应。该结果提示G2.1 中的两个突变协同作用提高LovD活性。将来自G2.1的突变和同一轮 ep-PCR所回收G2.2中的A190T组合产生下一代突变体G3。。用G3为模 板的Ep-PCR产生G4.1和G4.2，各含有不同的双重突变组合，分别为 A10V/K26E与H161Y/K227R。定点诱变证实A10V和K227R对LovD的活 性都有负作用。去除这些突变并组合K26E和H161Y得到改善的突变体G5， 其全细胞活性比G0改善~6倍。此时对G5突变体进行结构研究以提供对所 累积有益突变的认识。平行地，另一轮ep-PCR给出含有益突变V334D和 L361M的G6。用饱和诱变来优化334和361位置处突变的组合效应。回收 到的最优突变体是G7，其全细胞活性额外提高20%。意外的是，我们发现 当334位改变成苯丙氨酸时，此前认为有益的L361M突变回复成亮氨酸。 G7中L361M的定点突变证实在V334F突变的情况中亮氨酸实际上是更有 利的残基。

LOVD变体的体外鉴定

为了仔细研究引起全细胞活性增加的原因，鉴定了所有改良突变体的 动力学参数(k_cat,K_M)、可溶蛋白水平与热稳定性并列举于图13。LovD突变 体对MJA和DMB-SMMP的结合亲和性(K_M)各自在较窄范围内(对MJA为 0.7mM-0.9mM，而对DMB-SMMP为0.6mM-0.7mM)。考虑到筛选试 验中所用的高底物浓度(MJA和DMB-SMMP的~10K_M)，对任一底物的K_M未见改善并不意外。观察到的全细胞活性改善主要是由于突变体k_cat和可溶 蛋白水平的提高。从G1到G3，k_cat和可溶蛋白水平同时分别提高了~3倍 和~1.5倍。令人注目的是，G3的蛋白表达水平达到205mg/L。相反，k_cat的改善是第4至第7轮中全细胞活性提高的唯一原因。最应注意的是，G5 到G7的单一V334F突变使催化转换率几乎翻倍。此外，在升高温度表达 时突变体的全细胞活性反映了热稳定性的提高(图14)。尽管G0-G3突变体 在32°C表达时无可测活性，后代突变体还是保持了显著的SV合成酶活性， G7突变体显示的活性与G0在25°C时相当。此外，G7突变体甚至在37°C 表达时仍有活性。突变体热稳定性的提高对于LovD用作SV半合成的生物 催化剂具有重要的实践意义。

为检查突变体对合成天然生物产物LVA的活性，我们用α-甲基丁酰 -SMMP(MB-SMMP)和MJA进行动力学试验。在对LVA合成的k_cat改善中 观察到类似趋势(图15)，表明LovD对于酰基基团(MB或DMB)的相对底物 特异性没有改变。有意思的是，当LovF用于LVA合成的动力学试验时(图 7)，我们观察到LovD突变体活性的进行性丧失(图15)。G7突变体显示出 针对LovF的活性比G0母本降低27倍，这很可能是由于催化所需蛋白-蛋 白相互作用的退化(参见例如，Xie等，(2009)J.Am.Chem.Soc.131， 8388-8389)。因此，定向进化中累积的突变可能逐步改变了LovD的构象而 削弱其与LovF的联系，但未影响结合SMMP-结合酰基。

LOVD总体结构

确定了7种LovD晶体结构以帮助阐明LovD催化反应的机理和催化改 善的可能基础。这些包括(1)G0，(2)硒代甲硫氨酸G0(G0-Semet)，(3)改善 型突变体G5，(4)复合有底物MJA的G5，复合有(5)LVA，(6)SVA和(7)MJA 的S76A活性位点经突变的G5(称作G5’)。除G0外，这些结构的分辨限度 为2.5-2.0。天然G0结构以3.4分辨，但在G0-Semet变体中改善至 2.5。图20中提供精修统计。

LovD G0-Semet的品体结构揭示了α/β水解酶折叠的变化(参见例如， Heikinheimo等，(1999)Structure 7，R141-R146和Nardini等，(1999)Curr. Opin.Struct.Biol.9，732-737)。其由两个结构域组成。第一结构域(残基1-92 和204-413)是中央的7链反向平行β-片层，在任一面侧接有α-螺旋(图8B 和16A)。Glu388和Pro389之间形成顺式肽键，造成片层中的纽结。第二 结构域较小(残基93-203)且主要为α-螺旋。两个结构域之间的界面处形成 深且窄的裂缝(11x6)。裂缝底部是在酰基转移反应中起亲核作用的催化 性Ser76。

LOVD和ESTB之间的比较

活性位点裂缝环绕有宽的环形脊，这在同源酶EstB中没有。这些结构 可与RMS迭合，270对α-碳(约2/3的结构)仅偏差1.5(图8E)。两种酶的 核心惊人相似，但它们在活性位点外周环的大小和构造都有显著差异。 LovD中，这些环跨活性位点给出环形脊或接球手手套的形状，手指由5个 环构成：残基114-125、147-173、243-258、321-327和388-391(图8C)。 LovD中这些环里第一和最后一个分别比EstB长11和19个残基。第二个 环离活性位点的距离比EstB远7延伸了“手套”的控制范围。最值得注 意的是，LovD分子中缺少23残基环，该环若存在则会阻挡手套的控制范 围并盖住活性位点入口(对应于EstB中残基244-260)(图8D)。

围绕活性位点的脊的形状和直径(直径17的圆)满足容纳LovD天然 结合伴侣的要求，所述结合伴侣是LovF的ACP。此外，从LovD的活性位 点延伸的带正电通道和带正电脊表面进一步提示其结合ACP，后者的表面 倾向于带负电(图16B)(参见例如，Lai等，(2006)Biochemistry 45, 14869-14879)。LovD的边缘与活性位点Ser76间的距离为~20与LovF 的ACP结构域的磷酸泛酰巯基乙胺(Ppant)臂的长度大致相同。

突变体G5的晶体结构

对LovD G0-Semet结构的认识使得可能将本研究所示突变时(组合中) 促进LovD G5突变体催化活性的残基进行三维定位，所述突变体的k_cat改 善~4倍。这些残基广泛散布于空间，不形成共同接触。它们也没有共同的 物理环境，定位于埋入区和溶剂暴露区。此外，这些残基离活性位点Ser76 的距离相对较大，范围就Thr190和Gly12而言分别从10到32(图10)。 残基彼此间及残基与活性位点间缺乏连接性是很多定向进化实验中的常见 现象(参见例如，Hsu等，(2005)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 102,9122-9126, Oue等，(1999)J.Biol.Chem.274,2344-2349,and Zhao等，(1999)Protein Eng. 12,47-53)。

但是，G5的晶体结构提供证据表明六个突变提供的活性提高可归因于 这些突变使更为闭合形式活性位点裂缝稳定的能力。G0-Semet结构与G5 的比较揭示了5°的结构域-结构域铰链转动，裂缝收窄约0.5并产生原子 移动，离铰链最远的原子移动多达3(图11A)。G5结合LVA的后续结构 显示由14°铰链转动产生沿同一轨迹的更大移动。该观察提示G5变体中的 有益突变帮助促进催化所需的构象变化。

LovD闭合构象的稳定化可能通过定位催化关键残基来增强活性。例 如，当迭合G0-Semet，G5和G5-MJA的大结构域(残基14-92和204-405) 时，显然从G0-Semet到G5的结构域转动将Arg173的胍基和MJA的C15 羧化物间的间隙闭拢0.5这一转动可归因于G5突变(且可能归因于晶体 堆积的差异)而非配体结合，因为该比较是在两种非配体结构间进行。配体 结合产生从G5到G5-MJA的进一步转动，使Arg173和MJA之间的间隙再 闭拢2.2，从而在两个基团间形成氢键。类似地，G5突变使G0-Semet位 置的Phe148和Tyr188侧链的更靠近底物(G5-MJA)，尽管它们因离铰链轴 更近而移动较小(图17A)。

具体是A86V突变看来负责稳定铰链的闭合。它的两个额外甲基埋入 结构域间边界内，起楔子作用推动铰链轴远侧的Leu134，从而使铰链轴近 侧的活性位点裂缝合拢(图11A)。K26E和G275S突变的有益效果较不明显。 K26E突变可能通过打散螺旋A表面上成片带正电残基(R22、K23、K26和 R28)来改善酶稳定性(图18A)(参见例如，Schweiker等，(2007)Protein Sci.16， 2694-2702)。G275S突变看来通过添加与螺旋IN末端的氢键和降低主链的 扭转挠性来改善酶稳定性(图18B)。

LOVD与MJA、LVA和SVA的共结晶

复合有底物及产物的LovD G5’的结构说明这些配体的结合模式，并提 示酰基转移的催化机理。底物MJA以其C8羟基结合在结构域间裂缝的深 处，与Ser76、Tyr188及意外结合的甲酸分子(用作冷冻捕获剂)形成氢键(图 12A)。有预期C8羟基与Ser76羟基在反应序列不同步骤中发动同一酰基基 团上的亲核攻击，这两个羟基的毗邻与此预期一致(图19B)。MJA萘烷环 系的两面夹在Trp390和Tyr188的芳环之间(图16C)。观察到Phe363、Ile325、 Tyr327、Phe148、Ler149及肽平面Gly364、Gly365与Gly366和环系边的 其它疏水及范德华力相互作用(图16C)。MJA的亲水尾部(即萘烷环上的C1 取代基)从活性位点延展入本体溶剂。C11羟基与Glu388侧链和Trp390的 主链酰胺成氢键，后者由水分子介导。C15羧酸与Arg173形成盐桥。

LovD G5’突变体与LVA复合的晶体结构揭示了α-S-甲基丁酰基团的位 置。正如MJA复合物中，LVA的萘烷环和亲水尾部与类似几何形状结合。 有意思的是，额外的甲基丁酰基团平行延伸向MJA亲水尾部(图12B)。两 个尾部的毗邻使LVA产生发夹形状，萘烷环在两个尾部间形成发夹弯。疏 水侧链结合位置很可能是酰基供体结合的位点。尾部的毗邻还提示当MJA 在甲基丁酰底物之前结合时MJA如何竞争性抑制酰基转移反应(参见例如， Xie等，(2006)Chem.Biol.13，1161-1169)。由于MJA的亲水尾部分阻挡甲 基丁酰基团到达活性位点，需要底物的有序结合。

LovD G5’与LVA和SVA的复合物之间的结构比较提示在容纳非天然 产物SVA时涉及一些张力(图12C)。SVA与LVA相比含有一个额外甲基， 其位于α-S-甲基丁酰部分。仅用大结构域中α-碳迭合两种结构显示大结构 域和萘烷环中几乎一致的原子排列(图12D)。但该额外甲基(连接于C2’)和 Phe148侧链的接触看来推开结构域之间的裂缝。因此，Phe148从其在LVA 复合物中的位置移开约0.8(图17B)。还有绕α-二甲基丁酰基部分C1’-C2’ 键的30°转动。这些转动对两种底物的相对催化速率的影响似乎较小；直接 参与酰基转移的原子附近的移动很小。这与LovD利用α-二甲基丁酰基团 作为底物代替天然α-甲基丁酰基团来催化酰基转移的能力一致。但是，进 一步氨基酸突变如前述Phe148，可能改进与α-二甲基丁酰基底物或其它变 化的适配。这里给出的结构为此类设计努力提供了框架。

本实施例中，我们显示7种氨基酸改变引起LovD的SV合成酶活性提 高～11倍。考虑到在我们对底物和菌株优化的前期努力后，G0已是充分的 SV合成酶，该增强水平很显著。尽管G7的动力学活性远低于LovD用酰 基-LovF催化的天然反应，G7是利用全细胞平台大量合成SVA的强效突变 体。事实上，应用于高密度发酵环境中时，可在一天内将30g/L以上的MJA 定量转化成SVA。实现G7活性的较少定向进化轮次也证明LovD作为生物 催化剂是高度可进化的。

本研究中解析的X射线晶体结构提供了对LovD酶学不同方面的认识。 其中，获取了LovD催化三聚体Ser76-Lys79-Tyr188的空间排列，该空间排 列显示与酯酶EstB一致(图19)。Tyr188(作为酚盐)看来是启动2种完成酰 基转移反应所需亲核攻击的通用碱基(参见例如，Oefner等，(1990)Nature 343，284-288)。首个亲核攻击由Ser76对α-S-甲基丁酰基进行，而第二攻击 由MJA的C8羟基对酰化酶中间体进行。两种反应中，攻击羟基必需通过 脱质子化来活化(图19C)。Tyr188良好定位以使两个羟基脱质子，与脱辅基 酶蛋白中的Ser76和G5-MJA中的MJA形成氢键。Lys79也良好定位以通 过与G5-MJA复合物中Tyr188接替形成氢键来协助活化两个羟基。Tyr188 或Lys79定点突变为丙氨酸导致活性完全丧失。

α-S-甲基丁酰结合袋的详情提示如何稳定酰基转移反应的过渡态。正如 在MJA复合物中，LVA的C8氧维持与Tyr188的氢键，但邻近的水分子 已被α-S-甲基丁酰基团的羰基氧置换。该羰基氧与Ala76(即，G0-Semet中 的Ser76)和Gly366的主链酰胺形成氢键对。氢键的几何形状看来是理想的， 酰胺的氢原子直接指向羰基氧上的两个孤电子对。这些氢键看来很适于稳 定四面体过渡态。蛋白质接触甲基丁酰基团脂族部分的最接近处是脂族或 芳族碳：Ala75(Cβ)、Phe148(Cζ)、Tyr146(Cζ)和Asn270(Cβ)。需注意， α-S-甲基丁酰脂族碳也围绕有3个带正电侧链：Arg73、Lys79和Arg173， 都在4.1以内。这些正电荷可能帮助稳定酰基转移中所形成氧阴离子孔的 负电荷。事实上，G5-MJA复合物内该位置中意外存在的结合甲酸阴离子证 明了袋对负电荷的亲和性。

晶体结构为催化效率增强提供了看来合理的解释。配体结合后，LovD 经历了构象变化，类似于接球手手套合拢。图11A中所示的结构域移动将 催化残基位置彼此间和与配体更接近，用以增强催化速率。G5结构提示有 益突变提供预定位活性位点残基的替代方式以提高催化效率。尽管在G5 的结构研究后分别发现G6和G7的V334D和V334F突变，上述分子解释 也可适用于使额外单突变的有益性质合理化。Val334位于螺旋K和片层12 之间环的中部。Val334的两个侧链甲基直接接触螺旋K上Asp320的侧链， 用作结构域-结构域铰链之一并接触Tyr188所处的环(图11B)。因此，V334 的突变可导致结构域绕螺旋K铰链移动。例如，G6中的V334D突变将导 致Asp334和Asp320间的静电推斥。类似地，G7中V334F突变可导致苯 基侧链和Asp320侧链间的空间位阻，进一步合拢活性位点裂缝并使关键残 基(如Tyr188)进入催化更佳位置。另一方面，LovD突变体的更紧凑构象与 结合LovF不太兼容，后者看来偏好LovD的开放构象。

本文公开的这些结果具有意义，部分是因为辛伐他汀(SV)是重磅降胆 固醇药物的活性药物成分。因此，从洛伐他汀(LV)半合成SV是设 计有效生物催化方法的努力追求目标。我们此前开发的SV生物合成平台是 强大的，但因缺乏强效生物催化剂而仍是次优的。本研究中，我们采用定 向进化来工程改造LovD。通过充分设计的筛选方法获得多种更好的突变 体，且最佳突变体“G7”在SV生物合成中显示比母本G0提高~11倍。催化 效率、溶解度和热稳定性同时有改善，显示我们的选择系统的能力。更惊 人的是，我们确定了7个X射线晶体结构，包括母本LovD G0，改善型突 变体G5，和G5与MJA、LVA及SVA的共结晶结构。这些结构信息不但 帮助我们理解LovD的催化机理，还提供对突变如何影响LovD总体性能的 深入认识。LovD G0与G5间的结构比较提示有益突变有助于促进催化所需 的更紧凑构象。LovD与底物MJA、产物LVA及SVA的共结晶揭示了酰基 转移反应如何通过兵乓机制进行，MJA如何成为竞争性抑制剂，以及催化 活性如何调整以适应其非天然产物。因此，我们的研究可对生物催化剂开 发具有显著影响，并提供对LovD酶学基础理解的深入认识。

实验过程

EP-PCR与构建突变体库

Ep-PCR过程改良自从已确立方案(参见例如，Fromant等，(1995)Anal. Biochem.224,347-353)。反应由以下组成：0.35mM dATP，0.4mM dCTP， 0.2mM dGTP，1.35mM dTTP，4mM MgCl₂，0.25mM MnCl₂和2.5U Taq 聚合酶。反应混合物进行25轮PCR：94°C 1分钟，55°C 1分钟和72°C 3 分钟。所得PCR产物用DpnI消化，用EcoRI和NdeI进一步消化，并连接 至pET28(a)。将连接混合物转化至YT2并接种到含35mg/L卡那霉素的LB 琼脂上。

选择高活性突变体

粗糙链孢霉在SDA斜面上生长10天，用1%吐温-80收获孢子。100ml 熔化的SDA接种有0.3-0.5×10⁸孢子并倾倒入230×230mm平板。将来自突 变库的菌落在含250μl LB培养基(具有35mg/L卡那霉素)的96孔板中培 养。细胞于37°C生长至饱和然后转至复板。用0.1mM IPTG在OD₆₀₀为0.5 时诱导蛋白表达，所述表达在25°C进行16小时。添加5mM MJA和10mM DMB-SMMP以启动反应。一定反应时间(根据母本活性取45分钟-4小时) 后，离心移除细胞(2,000g，4°C，5分钟)。点样到SDA板的上清液量通常 为1~3μl。平板在30°C孵育16~18小时。根据抑制区的视觉比较选择改善 的突变体。

定点诱变

采用标准策略用相关模板进行定点突变。引物订购自 IDT(集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies）)。所有突变由DNA 测序证实(加利福尼亚州洛杉矶的Laragen公司)。

饱和诱变

LovD G6基因在V334和L361位置随机突变。由于这两个残基彼此接 近，用单对引物引入两处随机突变。用PCR扩增两个区段并用重叠延伸剪 接(SOE)PCR连接在一起给出完整的LovD基因，然后将该基因引入 pET28(a)。

确定全细胞生物催化活性

平行培养母本LovD和所有突变体以供比较。用新鲜转化YT2感受态 细胞的单一菌落接种补充有35mg/L卡那霉素的5ml LB培养物。37°C生 长过夜后，将100μl培养物接种入补充有35mg/L卡那霉素的50mL LB培 养基。OD₆₀₀达到0.4~0.6时，添加0.1mM IPTG至培养物，所有LovD变 体的表达在25°C进行16小时。为模拟高密度发酵条件，然后在添加底物 前将细胞浓缩10倍。离心收集各培养物的10ml等分样品(4°C，2,000g， 10分钟)。将细胞团块温和重悬于1ml培养基上清液中，然后添加70μl MJA(300mM母液)至终浓度15mM。然后将浓缩的培养物分成7等份200μl 样品，各样品中加入1μl纯DMB-SMMP至终浓度20mM。然后将小培养 物于25°C下300rpm振荡。在各时间点，通过添加10μl 20% SDS用于细 胞裂解然后用含1%三氟乙酸的500μl乙酸乙酯提取，进行一个培养物等分 样品的全体取。移除有机相，蒸发，再重溶于500μl乙腈以供HPLC分析。 全细胞活性由转化时程图线性区的拟合确定。

LOVD变体对MJA和DMB-SMMP的动力学试验

为得到MJA的K_m值和k_cat，将DMB-SMMP浓度固定于2mM，而 MJA的浓度从0.25mM到5mM不等。为得到DMB-SMMP的K_m值和k_cat， 将MJA浓度固定于2mM，而DMB-SMMP的浓度从0.5mM到5mM不等。 添加二甲亚砜(DMSO)至终浓度10%以促进DMB-SMMP溶解。在动力学试 验的不同时间点，移除反应混合物的等分样品，用1%TFA淬灭并用含1% 乙酸的EA提取。分离有机相，干燥，用乙腈(ACN)重溶，并通过贝克曼金 (Beckman Gold)HPLC采用反相C18柱(阿尔泰克阿波罗公司，5μ,150mm x 4.6mm)和线性梯度：含60%ACN的水(0.1%三氟乙酸(TFA))-含95%ACN 的水(0.1%TFA)持续10分钟，1毫升/分钟。通过将238nm的峰积分测定 MJA至SVA的转化。

LOVD变体对MB-SMMP的动力学试验

为比较LovD突变体对用MB-SMMP为底物合成洛伐他汀的k_cat，MJA 和MB-SMMP均固定在2mM。添加DMSO至终浓度10%以促进MB-SMMP 溶解。在动力学试验的不同时间点，移除反应混合物的等分样品，用1%TFA 淬灭并用含1%乙酸的EA提取。分离有机相，干燥，用ACN重溶并采用 上述相同的程序进行HPLC分析。

LOVD变体对LOVF的体外试验

将50μM LovF与1μM LovD变体，2mM MJA，2mM丙二酰-CoA， 2mM S-(5’-腺苷)-L-甲硫氨酸氯(SAM)，2mM NADPH在pH 7.4的100mM PBS中一起孵育。在1和2小时时间点，移除反应混合物的等分样品，用 1%TFA淬灭并用含1%乙酸的EA提取。分离有机相，干燥，用ACN重溶 并采用上述相同的程序进行HPLC分析。

比较可溶LOVD的表达水平

将编码LovD突变体的各表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。转化体 在含35mg/L卡那霉素的50mL LB培养基中37°C培养至光密度(OD₆₀₀)值 为0.4~0.6。用0.1mM IPTG诱导蛋白表达，然后表达在25°C进行16小时。 离心收集细胞(2,000g,4°C,15分钟)，重悬于7ml缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM DTT，2mM EDTA)并超声裂解。离心去除细胞碎 片和不溶蛋白(20,000g，4°C，1小时)。澄清的细胞裂解液中，各样品加入 0.5ml Ni-NTA树脂(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen))。然后用具 有递增咪唑浓度(10,20和250mM)的缓冲液A的不连续梯度来纯化各突变 体。LovD变体用5mL含250mM咪唑的缓冲液A洗脱。蛋白质浓度用 SDS-PAGE定性评估，并通过Bradford蛋白试验用牛血清白蛋白(BSA)作为 标准定量测定。

圆二色性T_M测定

通过添加50μg蛋白质至250μl 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)制备样 品。将样品置入光程1cm的石英比色皿中，在珀耳帖控制室内以每分钟1°C 的速率加热。在Jasco旋光分光计(分光公司，马里兰州伊斯顿)中以222nm 检测椭圆度。变性曲线的中点用Microcal Origin 5.0软件(OriginLab公司， 马萨诸塞州诺汉普顿)测定。

登录号

G0、SeMet G0、G5、G5-MJA、G5’-MJA、G5’-LVA和G5’-SVA的坐 标和结构因子分别以3HL9、3HLB、3HLC、3HLD、3HLE、3HLF和3HLG 保藏于蛋白质数据库(Protein Data Bank)。

其它实验过程和数据

结晶：LovD蛋白如此前所述纯化(参见例如，Xie等，(2006)Chem.Biol. 13,1161-1169)，但硒代甲硫氨酸基G0例外，采用基本培养基纯化(参见例 如，Doublie,S.(2007)Methods Mol.Biol.363,91-108)。蛋白质用50mM Tris  pH 8.0,150mM NaCl和5mM DTT透析过夜(采用Spectra/Por分子多孔膜 管MWCO 6~8,000)。LovD蛋白浓缩至所需浓度(用亚米康（Amicon）Ultra 15MWCO 30,000)。

LovD G0(7.6mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用2:1的蛋白对储存溶液比 例以总液滴尺寸3μl使G0的晶体在室温下生长。用20%PEG 3350，0.1M HEPES pH 7.0，0.25M(NH₄)₂SO₄和10mM DTT为储存溶液时，3~4天内得 到衍射品质晶体。在数据采集的准备中，晶体短暂浸没在30%/70%的甘油/ 储存溶液混合物中并快速冷冻。复合物中未观察到MJA的存在。

LovD G0硒代甲硫氨酰(5mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用1:2的蛋白对 储存溶液比例以总液滴尺寸3μl使LovD硒代甲硫氨酰G0的晶体在室温下 生长。用22%PEG 3350，0.1M Bis-Tris pH 6.5，0.25M(NH₄)₂SO₄和10mM DTT为储存溶液时，5~6天内得到衍射品质晶体。在数据采集的准备中， 晶体短暂浸没在30%/70%的甘油/储存溶液混合物中并快速冷冻。

LovD G5(69mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用2:1的蛋白对储存溶液比 例以总液滴尺寸3μl使G5的晶体在室温下生长。用40%PEG 400，0.1M HEPES pH 7.5，0.25M MgCl₂和10mM DTT为储存溶液时，3~4天内得到 衍射品质晶体。在数据采集的准备中，晶体短暂浸没在30%/70%的甘油/ 储存溶液混合物中并快速冷冻。

LovD G5＋MJA(50mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用1:1的蛋白对储 存溶液比例以总液滴尺寸4μl使G5G5+MJA(MJA 100X摩尔过滤)的晶体 在室温下生长。用16%PEG 3350，0.1M甲酸镁，0.1M Bis-Tris pH 6.5和 10mM DTT为储存溶液时，5~6天内得到衍射品质晶体。在数据采集的准 备中，晶体短暂浸没在4M甲酸锂中并快速冷冻。

LovD G5＋MJA(66mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用1:2的蛋白对储 存溶液比例以总液滴尺寸3μl使G5’+MJA(100X摩尔过量的MJA)的晶体 在室温下生长。用12.5%PEG 1000，0.1M乙酸钙，0.1M咪唑，pH 8.0和 10mM DTT为储存溶液时，4~5天内得到衍射品质晶体。在数据采集的准 备中，晶体短暂浸没在30%/70%的甘油/储存溶液混合物中并快速冷冻。

LovD G5’＋SVA(60mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用1:1的蛋白对储 存溶液比例以总液滴尺寸4μl使G5’的晶体在室温下生长。用20%PEG MME 550，0.1M HEPES pH 8.0，0.05M MgCl₂和10mM DTT为储存溶液时， 3~4天内得到衍射品质晶体。将50%甘油和30%PEG MME 550的母液混合 至70%/30%比例，无MgCl₂。将SVA(200mM)以等份加至上述混合物，在 数据采集前将晶体浸没10分钟并快速冷冻。

LovD G5’＋LVA (60mg/ml):通过悬滴蒸汽扩散法用1:1的蛋白对储 存溶液比例以总液滴尺寸4μl使G5’的晶体在室温下生长。用15%PEG MME 550，0.1M HEPES pH 8.0，0.05M MgCl₂和10mM DTT为储存溶液时， 3~4天内得到衍射品质晶体。将50%甘油和30%PEG MME 550的母液混合 至70%/30%比例，无MgCl₂。将LVA(200mM)以等份加至上述混合物，在 数据采集前将晶体浸没10分钟并快速冷冻。

数据采集

在先进光子源(Advanced Photon Source,APS)束线24-ID-C上用ADSC Quantum 315 3X3 CCD阵列采集X射线衍射数据。将晶体在低温氮流中冷 至100K。用DENZO/SCALEPACK进行数据还原和定标(参见例如， Otwinowski等，(1997)Method Enzymol.276,307-326)。用XDS对LovD G0 数据进行标定(参见例如，Kabsch,W.(1993)J Appl.Crystallogr.26, 795-800)，衍射模式显示非缺面对称或外延孪晶的迹象，XDS擅于标定此 类模式。利用CCP4程序FREERFLAG36从倒易晶格随机选出所有反射的 5%。精修过程中保持同组游离R标记(free R flag)。精修程序切换中小心确 保保持游离R标记。同步加速器中采集的G5’-MJA数据在低分辨率壳由于 检测器过载而不完整。用来自内部来源(装有HTC成像板的Rigaku FR-E转 动阳极发生器)的数据补充过载的反射。

结构确定与精修：

利用程序BALBES(参见例如，Long等，(2008)Acta Crystallogr.,Sect.D: Biol.Crystallogr.64,125-132)以来自唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）的 EstB的坐标为搜索模型(PDB代码1CI8)(参见例如，Wagner等，(2002) Protein Sci.11,467-478)用分子置换在空间群P1中确定LovD G0的结构。 这两个序列在227个残基中有32%的相同性。不对称单元中发现4个LovD 分子。第一个精修步骤用CNS进行(参见例如，Brunger等，(1998)Acta  Crystallogr.D Biol.Crystallogr.54,905-921)，采用模拟退火和偶联梯度算 法，辅以氢键势函数(参见例如，Fabiola等，(2002)Protein Sci.11, 1415-1423)。全过程采用紧密的四倍非晶体对称性制约。后几轮精修用 REFMAC5进行(参见例如，Murshudov等，Acta Crystallogr.,Sect.D:Biol. Crystallogr.53,240-255)，以受益于结构域紊乱的TLS参数化(参见例如， Winn等，(2003)Method Enzymol.374,300-321)。各步精修后，采用2Fo-Fc 和Fo-Fc差异图在Coot中目测检查模型(参见例如，Emsley等，(2004)Acta  Crystallogr.,Sect.D:Biol.Crystallogr.60,2126-2132)。所有连接碳原子和主 链氮原子的氢原子包括在其几何计算的位置处，并用骑式模型(riding model) 精修。

利用程序PHASER(参见例如，McCoy等，(2007)J.Appl.Crystallogr.40, 658-674)并以LovD G0的坐标为搜索模型通过分子置换解析C2空间群中硒 代甲硫氨酰LovD G0的结构。再次在不对称单元中发现4个LovD分子。 分子置换方案的准确性由硒代甲硫氨酸侧链上异常差异傅立叶图 (anomalous difference Fourier map)中分立峰的出现得到证实。CNS和 REFMAC5都用于精修。先采用紧密的四倍对称性制约，然后在精修末期 缩减至中等强度。

利用程序PHASER并以硒代甲硫氨酰LovD的坐标为搜索模型通过分 子置换在P2₁2₁2₁空间群中解析LovD G5突变体的结构。在不对称单元中发 现单个LovD G5突变体分子。用REFMAC5和COOT精修所述结构。

LovD G5-MJA、G5’-MJA、S5’-SVA和S5’-LVA的结构与未复合的LovD G5突变体为同晶形。用差异傅立叶法获得相位，并如上精修。

所有模型用下列结构验证工具证实：PROCHECK(参见例如，Laskowski 等，(1993)J.Appl.Crystallogr.26,283-291)，ERRAT(参见例如，Colovos 等，(1993)Protein Sci.2,1511-1519)，和VERIFY3D(参见例如，Luthy等， (1992)Nature 356,83-85)。最终模型的坐标和合并的结构因子已保藏至蛋白 质数据库。图20中列出了相应的PDB代码。

本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明 本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。本文所述以外 对发明模型和方法的各种改良通过以上描述和教导对本领域技术人员显而 易见，所述改良同样旨在落入本发明的范围内。可以实施此类改良或其它 实施方式而不偏离本发明的真实范围和精神。

表格

表1A.酰基硫酯作为LovD的底物^[a]

[a]反应产物由LC-MS证实。反应条件：10μM LovD，1mM红麴素J， 4mM酰基硫酯，50mM HEPES，pH 7.9，25°C，10小时。[b]转化率 用HPLC(238nm)通过红麴素J转化成相应洛伐他汀类似物的百分数来 测量。[c]产物的游离酸形式的HPLC(C18反相)滞留时间。

表1B:硫酯底物初速度的比较。

a反应条件：1mM MJ，4mM硫酯底物，10uM纯LovD，50mM HEPES，

pH 7.9；初速度定义为线性范围内初始转化的速率。

表2.本研究中所筛选大肠杆菌BW25113突变体的列表。BioH显示为负责 DMB-S-MMP水解的唯一酶。

表3：不同表达条件的蛋白得率比较^a

^a所报道得率代表在相应条件下观察到的最高得率。

^b采用全细胞裂解液如材料与方法中所述由体外试验评估蛋白得率。用 观察到的转化以转换率0.6分钟^-1评估LovD浓度。

表4：多肽和多核苷酸序列信息

土曲霉LOVD转酯酶登录号AAD34555

Kennedy等，Science.1999May 21;284(5418):1368-72

MGSIIDAAAAADPVVLMETAFRKAVKSRQIPGAVIMARDCSGNLNYTRCFGARTVRR DECNQLPPLQVDTPCRLASATKLLTTIMALQCMERGLVDLDETVDRLLPDLSAMPVL EGFDDAGNARLRERRGKITLRHLLTHTSGLSYVFLHPLLREYMAQGHLQSAEKFGIQ SRLAPPAVNDPGAEWIYGANLDWAGKLVERATGLDLEQYLQENICAPLGITDMTFKL QQRPDMLARRADQTHRNSADGRLRYDDSVYFRADGEECFGGQGVFSGPGSYMKVLHS LLKRDGLLLQPQTVDLMFQPALEPRLEEQMNQHMDASPHINYGGPMPMVLRRSFGLG GIIALEDLDGENWRRKGSLTFGGGPNIVWQIDPKAGLCTLAFFQLEPWNDPVCRDLT RTFEHAIYAQYQQG (SEQ ID NO:1).

桔青霉MlcH转酯酶，登录号BAC20561

Abe等，Mol.Genet.Genomics 267(5),636-646(2002)

MAPSIDVIPTAASTAAGMISDMEAAFKSAVKLKQIPGAVVMARSMNGDIDYTRCFGA RTVERDECQRLPPMEIDTPLRLASATKLLTTIMALQCMEQGLVDLDENVNRLLPDLS DMQVLTGFDAAGNAIMRDREGIIKLRHLLTHTSGLSYAFLHPLLQEYMAKGYLKTAE KFGIQSRLAPPAINDPGVEWIYGANLDWAGKLIERATGVDLEEFMQKNICEPLGITD MTFKLQQRPDMLARRSDQTRRNENGSLRYDDSVYFRHDGEECFGGQGVFCGPESYMK VLNSLMKHDGLLLKKDTIELMFQPALDAELEKKMNDHMDTTPHINYGAALPPVMRRN FGLGGIIAMGDLDGHNWRREGSLTFGGGPNIVWQIDPTVGLCTLVVFQLEPWNDPIC KDLTRKFEKAMYSQVKCRN (SEQ ID NO:2).

土曲霉LOVF聚酮合成酶AAD34559

Kennedy等，Science.1999May 21;284(5418):1368-72

MTPLDAPGAPAPIAMVGMGCRFGGGATDPQKLWKLLEEGGSAWSKIPPSRFNVGGVY HPNGQRVGSMHVRGGHFLDEDPALFDASFFNMSTEVASCMDPQYRLILEVVYEALEA AGIPLEQVSGSKTGVFAGTMYHDYQGSFQRQPEALPRYFITGNAGTMLANRVSHFYD LRGPSVSIDTACSTTLTALHLAIQSLRAGESDMAIVAGANLLLNPDVFTTMSNLGFL SSDGISYSFDSRADGYGRGEGVAAIVLKTLPDAVRDGDPIRLIVRETAINQDGRTPA ISTPSGEAQECLIQDCYQKAQLDPKQTSYVEAHGTGTRAGDPLELAVISAAFPGQQI QVGSVKANIGHTEAVSGLASLIKVALAVEKGVIPPNARFLQPSKKLLKDTHIQIPLC SQSWIPTDGVRRASINNFGFGGANAHAIVEQYGPFAETSICPPNGYSGNYDGNLGTD QAHIYVLSAKDENSCMRMVSRLCDYATHARPADDLQLLANIAYTLGSRRSNFRWKAV CTAHSLTGLAQNLAGEGMRPSKSADQVRLGWVFTGQGAQWFAMGRELIEMYPVFKEA LLECDGYIKEMGSTWSIIEELSRPETESRVDQAEFSLPLSTALQIALVRLLWSWNIQ PVAVTSHSSGEAAAAYAIGALTARSAIGISYIRGALTARDRLASVHKGGMLAVGLSR SEVGIYIRQVPLQSEECLVVGCVNSPSSVTVSGDLSAIAKLEELLHADRIFARRLKV TQAFHSSHMNSMTDAFRAGLTELFGADPSDAANASKDVIYASPRTGARLHDMNRLRD PIHWVECMLHPVEFESAFRRMCLDENDHMPKVDRVIEIGPHGALGGPIKQIMQLPEL ATCDIPYLSCLSRGKSSLSTLRLLASELIRAGFPVDLNAINFPRGCEAARVQVLSDL PPYPWNHETRYWKEPRISQSARQRKGPVHDLIGLQEPLNLPLARSWHNVLRVSDLPW LRDHVVGSHIVFPGAGFVCMAVMGISTLCSSDHESDDISYILRDVNFAQALILPADG EEGIDLRLTICAPDQSLGSQDWQRFLVHSITADKNDWTEHCTGLVRAEMDQPPSSLS NQQRIDPRPWSRKTAPQELWDSLHRVGIRHGPFFRNITCIESDGRGSWCTFAIADTA SAMPHAYESQHIVHPTTLDSAVQAAYTTLPFAGSRIKSAMVPARVGCMKISSRLADL EARDMLRAQAKMHSQSPSALVTDVAVFDEADPVGGPVMELEGLVFQSLGASLGTSDR DSTDPGNTCSSWHWAPDISLVNPGWLEKTLGTGIQEHEISLILELRRCSVHFIQEAM ESLSVGDVERLSGHLAKFYAWMQKQLACAQNGELGPESSSWTRDSEQARCSLRSRVV AGSTNGEMICRLGSVLPAILRREVDPLEVMMDGHLLSRYYVDALKWSRSNAQASELV RLCCHKNPRARILEIGGGTGGCTQLVVDSLGPNPPVGRYDFTDVSAGFFEAARKRFA GWQNVMDFRKLDIEDDPEAQGFVCGSYDVVLACQVLHATSNMQRTLTNVRKLLKPGG KLILVETTRDELDLFFTFGLLPGWWLSEEPERQSTPSLSPTMWRSMLHTTGFNGVEV EARDCDSHEFYMISTMMSTAVQATPMSCSVKLPEVLLVYVDSSTPMSWISDLQGEIR GRNCSVTSLQALRQVPPTEGQICVFLGEVEHSMLGSVTNDDFTLLTSMLQLAGGTLW VTQGATMKSDDPLKALHLGLLRTMRNESHGKRFVSLDLDPSRNPWTGDSRDAIVSVL DLISMSDEKEFDYAERDGVIHVPRAFSDSINGGEEDGYALEPFQDSQHLLRLDIQTP GLLDSLHFTKRNVDTYEPDKLPDDWVEIEPRAFGLNFRDIMVAMGQLESNVMGFECA GVVTSLSETARTIAPGLAVGDRVCALMNGHWASRVTTSRTNVVRIPETLSFPHAASI PLAFTTAYISLYTVARILPGETVLIHAGAGGVGQAAIILAQLTGAEVFTTAGSETKR NLLIDKFHLDPDHVFSSRDSSFVDGIKTRTRGKGVDVVLNSLAGPLLQKSFDCLARF GRFVEIGKKDLEQNSRLDMSTFVRNVSFSSVDILYWQQAKPAEIFQAMSEVILLWER TAIGLIHPISEYPMSALEKAFRTMQSGQHVGKIVVTVAPDDAVLVRQERMPLFLKPN VSYLVAGGLGGIGRRICEWLVDRGARYLIILSRTARVDPVVTSLQERGCTVSVQACD VADESQLEAALQQCRAEEMPPIRGVIQGAMVLKDALVSQMTADGFHAALRPKVQGSW NLHRIASDVDFFVMLSSLVGVMGGAGQANYAAAGAFQDALAEHRMAHNQPAVTIDLG MVQSIGYVAETDSAVAERLQRIGYQPLHEEEVLDVLEQAISPVCSPAAPTRPAVIVT GINTRPGPHWAHADWMQEARFAGIKYRDPLRDNHGALSLTPAEDDNLHARLNRAISQ QESIAVIMEAMSCKLISMFGLTDSEMSATQTLAGIGVDSLVAIELRNWITAKFNVDI SVFELMEGRTIAKVAEVVLQRYKA (SEQ ID NO:3).

大肠杆菌羧酸酯酶bioH，登录号Q8FCT4

Welsch等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),17020-17024(2002)

MNNIWWQTKGQGNVHLVLLHGWGLNAEVWRCIDEELSSHFTLHLVDLPGFGRSRGFG ALSLADMAEAVLQQAPDKAIWLGWSLGGLVASQIALTHPERVQALVTVASSPCFSAR DEWPGIKPDVLAGFQQQLSDDFQRTVERFLALQTMGTETARQDARALKKTVLALPMP EVDVLNGGLEILKTVDLRQPLQNVSMPFLRLYGYLDGLVPRKVVPMLDKLWPHSESY IFAKAAHAPFISHPAEFCHLLVALKQRV (SEQ ID NO:4).

编码土曲霉LOVD转酯酶的多核苷酸EMBLCDS:AAD34555

Kennedy等，Science.1999May 21;284(5418):1368-72

ATGGGATCCATCATTGATGCTGCTGCGGCAGCGGATCCGGTTGTTCTGATGGAAACC GCCTTCCGCAAGGCCGTGAAATCCAGGCAGATCCCCGGGGCGGTCATCATGGCCCGA GATTGCAGTGGCAATCTAAATTATACGCGCTGCTTCGGGGCTCGGACGGTGCGACGG GACGAGTGCAATCAGCTGCCGCCGCTACAGGTCGACACCCCCTGCCGGCTCGCCAGT GCGACCAAGCTGCTGACCACGATCATGGCCCTACAATGCATGGAGCGCGGTCTCGTG GACTTGGATGAGACGGTGGATAGGCTGCTTCCGGATTTGAGCGCGATGCCCGTGCTG GAGGGGTTTGACGACGCGGGAAACGCAAGATTGCGAGAGCGTCGGGGGAAGATCACG CTGCGGCACCTGCTGACGCATACATCGGGACTGTCGTACGTCTTCCTCCATCCGTTG CTCCGGGAATACATGGCCCAGGGCCACCTCCAGTCGGCAGAAAAGTTTGGCATCCAG AGTCGCCTGGCGCCGCCGGCCGTCAACGACCCTGGGGCGGAGTGGATCTACGGCGCC AACCTGGACTGGGCGGGTAAGCTCGTCGAGCGGGCCACCGGCCTCGACCTGGAGCAG TACCTGCAGGAGAATATCTGTGCGCCGCTGGGCATCACCGACATGACCTTTAAGCTG CAGCAACGGCCGGATATGCTTGCGCGCCGGGCCGACCAAACGCACCGCAACTCGGCG GATGGGCGCCTGCGCTACGACGACTCGGTCTACTTCCGGGCCGATGGAGAGGAGTGC TTCGGCGGCCAGGGGGTGTTCTCGGGCCCTGGGTCCTATATGAAGGTGCTTCACTCG CTGTTGAAGCGAGACGGGCTCCTGCTGCAGCCACAGACCGTGGACTTGATGTTTCAG CCTGCCCTCGAGCCGCGACTCGAAGAGCAGATGAACCAGCACATGGACGCCAGCCCA CATATCAACTACGGTGGGCCGATGCCCATGGTCCTTCGTCGCAGCTTTGGGCTGGGG GGGATCATCGCCTTGGAGGATCTGGACGGAGAGAACTGGCGCCGAAAAGGTTCCTTG ACCTTTGGGGGTGGCCCAAACATTGTGTGGCAAATCGACCCCAAAGCCGGCCTGTGC ACCCTTGCGTTCTTCCAACTGGAACCCTGGAATGACCCGGTCTGTCGTGATCTGACA CGCACATTCGAGCATGCCATCTATGCGCAGTACCAGCAGGGTTAA (SEQ ID NO:5)