法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-08-03
授权
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2013-07-24
专利申请权的转移 IPC(主分类):A23L1/305 变更前: 变更后: 登记生效日:20130701 申请日:20101203
专利申请权、专利权的转移
2012-12-19
实质审查的生效 IPC(主分类):A23L1/305 申请日:20101203
实质审查的生效
2012-09-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于在人受试者中诱导耐受的营养配方或补充物，其包含含牛奶肽的水解产物和/或所述水解产物的含肽部分和/或一种或多种来源于牛奶中存在的蛋白质的肽，其中所述包含于所述水解产物或水解产物部分中的肽包含含有T细胞表位的肽，或其中所述一种或多种肽为含有T细胞表位的肽，以及其中在摄入所述营养配方后，所述含有T细胞表位的肽能够驱使免疫反应朝向耐受。
在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的多个文件。这些文件的公开内容，虽然不认为与本发明的专利性相关，但以其整体通过引用结合于此。更具体地，所有参考文件通过引用结合，引用程度如同具体和单独地指出每一篇独立的文件通过引用结合。
背景技术
牛奶过敏是幼儿中最常见的食物过敏之一，其中所有婴儿的大约2 %-2.5 %经历对牛奶的过敏。大多数儿童在3岁前失去其对牛奶的过敏反应，但这些婴儿中的15%会将其对牛奶的敏感性保留到生命的第二个十年中。因此，有牛奶过敏的受试者存在于所有的年龄组。过敏性疾病如奶过敏是由分泌包括IL-4、IL-5和/或IL-13在内的过敏性、炎症因子的T细胞亚类的激活所引起的免疫病症(Schmidt-Weber等，Allergy 2002，第57卷，第762-768页)。T细胞的该亚类控制抗原特异性B细胞至IgE的同种型转换，并因此在过敏性症状的起始和耐受诱导中起关键作用。(Kondo等，Pediatr. Allergy Immunol. 2008，第19卷，第592-598页)。因此，过敏原特异性T细胞的调节是控制过敏性疾病的有前景的策略。
为了避免在牛奶过敏受试者中，尤其在有牛奶过敏的婴儿中在暴露于牛奶后的过敏反应，目前大部分使用代替牛奶营养的奶代替物配方。这些配方还为受试者提供完全的营养源。奶代替物包括游离氨基酸(例如NutramigenTM AA，Neocate)、基于大豆的配方(例如Pregomin)或基于部分水解蛋白质或广泛水解蛋白质的低变应原配方(例如NutramigenTM、Alimentum和Pregestemil)。如果过敏受试者对蛋白质水解产物配方无反应，则非奶来源的基于氨基酸的配方既适合于治疗轻度-中度奶过敏，又适合于治疗严重的奶过敏。基于大豆的配方有过敏性敏感的风险，因为一些对奶过敏的受试者也可能对大豆过敏。与广泛水解产物相比，部分水解产物配方的特征在于更大比例的长氨基酸链(肽)，认为该配方更可口。它们通常打算用于预防应用，一般不被认为适于治疗奶过敏/不耐受。另一方面，广泛水解蛋白质主要包含游离氨基酸和短肽。因为其高营养质量及其氨基酸组成，酪蛋白和乳清是最常用的用于水解产物的蛋白质来源。
因此，市场上大多数的当前的牛奶代替物配方是以已水解到不同程度的牛奶和/或氨基酸配方为基础的。将这些牛奶配方用于代替牛奶，从而减少在牛奶过敏受试者中的过敏反应。此外，牛奶配方可在处于形成奶过敏的风险中的受试者中潜在地预防牛奶过敏的形成。然而，偶然观察到即使广泛水解产物也在敏化婴儿中引起过敏反应(Rosendal等。Journal of Dairy Science 2000，第83卷，第10期，第2200-2210页)。
因此，对奶过敏的现时治疗是完全避免牛奶和食物。因此，以下物质会大大地提升有牛奶过敏或有形成牛奶过敏的风险的受试者的生命质量：在摄入所述物质后，其可驱使免疫反应朝向对牛奶或含有牛奶的食物的耐受。本发明解决了该需要。
发明公开
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于诱导人受试者的耐受的营养配方或补充物，所述营养配方或补充物包含含牛奶肽的水解产物和/或所述水解产物的含肽组分和/或一种或多种来源于牛奶中存在的蛋白质的肽，其中所述包含于所述水解产物或水解产物部分中的肽包含含有T细胞表位的肽，或其中所述一种或多种肽为含有T细胞表位的肽，以及其中在摄入所述营养配方后，所述含有T细胞表位的肽能够驱使免疫反应朝向耐受。
本文所用的术语“营养配方”描述固态或液态配方，因此其可被人受试者作为营养而食用或饮用。本发明的营养配方对于液态配方优选具有至少1 kcal(千卡)/100ml，更优选至少10 kcal/100ml，以及甚至更优选50 kcal/100ml的营养价值；对于干燥食物配方优选具有至少1 kcal/100g，更优选至少10 kcal/100g，甚至更优选至少50 kcal/100g例如至少100 kcal/100g，以及最优选至少300 kcal/100g的营养价值。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的营养配方对于液态配方具有至少50-200 kcal/100ml的营养价值和对于干燥食物配方具有至少300-600 kcal/100g的营养价值。营养配方区别于疫苗。与疫苗相比，营养配方不包含任何佐剂(除非因为污染)、活化或灭活的病毒化合物(除非因为污染)、活化或灭活的细菌化合物(除非因为污染)以及致病化合物(除非因为污染)。
本文所用的术语“补充物”涉及营养补充物，其为营养或者其它带有营养或生理作用的物质的浓缩来源，其目的在于补充正常饮食。
除以上叙述的成分之外，还可从脂质、矿物质、碳水化合物、氨基酸、氨基酸螯合物、合成代谢性营养物、维生素、抗氧化剂、益生菌菌株和抗脂肪肝剂中选择另外的成分以提供最佳的持续能量和合成代谢性营养配方。所述营养配方可为营养补充物或可提供完整的营养。优选所述营养配方呈干燥食物浓缩物的形式。本发明的营养配方以递增优选为人受试者提供至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少90%的人受试者的每日卡路里需求。本领域的技术人员熟知每日卡路里需求取决于人受试者的性别、身高和年龄。例如，一名体重80kg以及身高180cm的30岁男性有约2900 cal（卡路里）的每日卡路里需求以维持其体重，而一名体重55kg以及身高165cm的30岁女性有约2100 cal的每日卡路里需求量以维持其体重。在一个优选的实施方案中，本发明的营养配方是婴儿配方或用于婴儿或青少年的营养产品。
本文所用的术语“肽”描述氨基酸线性分子链，包括单链分子或其片段。本发明的肽以以递增优选包含约2-100个氨基酸，约5-50个氨基酸，或约5-40个氨基酸。肽可进一步形成由至少两个相同或相异的分子组成的寡聚物。将这样的多聚体的相应高级结构相应地称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。此外，术语“肽”也包括其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物所置换的这类肽的肽模拟物。这样的功能类似物包括除20种基因编码氨基酸之外的所有已知的氨基酸，例如硒代半胱氨酸。术语“肽”也涉天然修饰的肽，其中修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰来实现。在本发明中必须将肽与蛋白质区别开。本发明的蛋白质描述了由氨基酸构成的有机复合物，所述氨基酸以直链形式排列并折叠成球状形式。此外，本发明的蛋白质描述多于100个氨基酸的氨基酸。肽可例如重组地、(半)合成地制备，或获取自天然来源(例如在蛋白质水解之后)，全部根据本领域已知的方法进行。
本文所用的术语“含牛奶肽的水解产物”定义包含来源于水解牛奶蛋白质(例如牛酪蛋白或牛乳清)的肽的配方。在这点上，水解蛋白质是已分解成肽和/或组分氨基酸的蛋白质。虽然有很多实现蛋白质水解的方法，但最常用方法中的两种为在强酸或强碱中长期煮沸，或使用酶(例如胰蛋白酶)以刺激天然存在的水解过程。优选使用酶或酶的混合物实现来源于奶的蛋白质的水解。牛奶水解产物可包含来源于奶的肽，其中已将所述奶的蛋白质水解至不同程度。因此，可区分部分水解的含牛奶肽的水解产物和广泛水解的含牛奶肽的水解产物。在这点上，部分水解的含牛奶肽的水解产物包含多于20%的完整牛奶蛋白质，而广泛水解的含牛奶肽的水解产物包含少于1%的大小大于1.5kD的肽。此外，广泛水解的含牛奶肽的水解产物优选为低变应原的。
本文所用的术语“来源于牛奶的肽”定义这样的肽，所述肽有作为牛奶蛋白质的部分氨基酸序列的氨基酸序列。这样的肽可如上述通过水解获得或可通过技术人员已知的方法以及本发明实施例中描述的方法在体外合成。
本发明的术语“含有T细胞表位的肽”描述这样的肽，所述肽包含能够与存在于T细胞上的表面受体结合的表位。优选所述表位能够与T细胞受体(TCR)结合。
术语“水解产物的含肽部分”是指包含至少2个，优选至少5个，更优选至少10个和最优选至少20个氨基酸的肽的混合物，所述肽已通过技术人员已知的过滤技术从本发明的水解产物中分离。此外，本文在下文描述了从本发明的水解产物中分离肽的技术。
本发明的术语“耐受”是指免疫耐受。免疫耐受在本文定义为淋巴组织对特定抗原或抗原组形成特异性惰性或部分惰性。该特定抗原或抗原组能够在摄入特定抗原或抗原组后的特应性人受试者中诱导免疫反应。因此，在摄入本发明的一种或多种含有T细胞表位的肽后诱导本发明的对特定抗原或抗原组的耐受。不希望受理论所束缚，可例如通过特异性过敏原反应性T细胞的无反应性和缺失的机制来诱导耐受。或者，可例如通过可向致耐受性或抑制性T细胞表型(调控性T细胞)的发育方向驱使T细胞发育的细胞的因子(即细胞因子)来诱导耐受。
在这点上，术语“在摄入营养配方后能够驱使免疫反应朝向耐受的含有T细胞表位的肽”指定有助于淋巴组织形成对特定抗原或抗原组的特异性惰性的肽，其中肽的这种活性是通过与T细胞表面受体相结合而获得的。因此，含有T细胞表位的肽以允许驱使免疫反应朝向耐受的量存在于营养形成物中。与在没有预先的耐受诱导的情况下与抗原接触后的免疫反应相比，优选免疫反应通过诱导耐受降低至少20%，例如至少50%，例如至少75%，优选至少90%，更优选至少95%，和最优选100%。测定耐受的方法为本领域所知，包括例如本发明的实施例中所描述的方法。因此，耐受可通过例如测定从T细胞中释放的促炎因子(例如白细胞介素或干扰素)的量或T细胞的增殖来确定。可通过本领域技术人员已知的方法，来鉴定以下肽，其为在摄入营养配方后能够驱使免疫反应朝向耐受的含有T细胞表位的肽，所述方法例如在本文下文中描述于本发明的实施例中。因此，以下肽为在摄入营养配方后能够驱使免疫反应朝向耐受的含有T细胞表位的肽：其可抑制T细胞的增殖和/或下调释放于PBMC的上清液中的促炎细胞因子和/或使T辅助细胞2 (TH2)分化的细胞因子的释放。
按照本发明，令人惊奇地发现可将包含于牛奶水解产物中的含有T细胞表位的肽和来源于牛奶中存在的蛋白质的含有T细胞表位的肽，用于耐受的诱导。正如根据以下实施例所显而易见的，本发明人已发现当有后续暴露于奶过敏原时，包含于奶水解产物中的肽和来源于牛奶中存在的蛋白质的肽可显著地降低T细胞的增殖，推测通过阻断T细胞受体和MHCII结合来进行。当有后续暴露于奶过敏原时，包含于奶水解产物中的特定肽或者与牛奶肽的部分序列对应的合成肽甚至可阻断T细胞的增殖。尽管在本领域中已描述牛奶蛋白质中的T细胞表位(例如，Kondo等，Pediatr. Allergy Immunol. 2008, 第19卷, 第592-598页; Elsayed等, Mol. Immunol. 2004, 卷41(12), 第1225-34页; Ruiter等, Clin. Exp. Allergy 2006, 卷36(3), 第303-10页; Ruiter等, Int. Arch. Allergy Immunol. 2007; 卷143(2), 第119-26页;或Nakajima-Adachi等, J. Allergy Clin. Immunol. 1998; 卷101(5),第660-71页)，但之前未描述过牛奶衍生肽可诱导耐受。此外，按照本发明，已发现包含于牛奶水解产物中的含有T细胞表位的肽和来源于牛奶中存在的蛋白质的含有T细胞表位的肽，降低使T辅助细胞2 (TH2)分化的细胞因子的水平以及促炎细胞因子的水平(与由奶蛋白质诱导的所述细胞因子的水平相比)。如免疫学领域中已知的，促炎细胞因子对肠屏障完整性有有害作用，并因此涉及过敏性疾病以及炎性疾病的形成。已知在促炎细胞因子之中特别是IL-4和IFN-γ破坏肠表面衬里的上皮细胞之间的黏着，因此危及肠屏障完整性。因此，肠随着暴露于肠壁中的免疫细胞的过敏原和饮食/微生物抗原增加而变得更可透过。
因此，不希望受理论所束缚，认为耐受由牛奶衍生肽直接诱导。之前牛奶水解产物和肽仅用于代替牛奶。通过代替牛奶，避免了过敏反应和过敏反应的形成。本文提供的发现显示包含于牛奶水解产物中的含有T细胞表位的肽和来源于牛奶中存在的蛋白质的含有T细胞表位的肽可另外且意料之外地用于诱导人受试者中的耐受。
在一个优选实施方案中本发明涉及上文描述的营养配方，其中对牛奶、包含于牛奶中的蛋白质或包含于牛奶中的过敏原诱导耐受。
牛奶、包含于牛奶中的蛋白质和包含于牛奶中的过敏原例如包含于含有牛奶成分的任何食物。非限制性实例为奶、凝乳、乳脂、奶油、酸奶和包含任何这些的食物。
本文所用的术语“过敏原”描述在特应性(过敏性)人受试者中能够刺激超敏反应的抗原。此外，过敏原通常是对机体而言外来的物质，并且只在特应性人受试者中可引起过敏反应。
本发明还涉及用于治疗或预防炎性肠病的营养配方或补充物，其包含含牛奶肽的水解产物和/或所述水解产物的含肽部分和/或一种或多种来源于牛奶中存在的蛋白质的肽，其中所述包含于所述水解产物或水解产物部分中的肽包括含有T细胞表位的肽，或其中所述一种或多种肽为含有T细胞表位的肽，并且其中在摄入所述营养配方后所述含有T细胞表位的肽能够下调促炎细胞因子。
本文所用的术语“炎性肠病”定义胃肠道的炎性病况组。炎性肠病的主要类型是克罗恩病和溃疡性结肠炎。克罗恩病和溃疡性结肠炎之间的主要区别在于炎性变化的位置和性质。克罗恩病可影响胃肠道从口到肛门(跳跃性病变)的任何部分，但大部分病例开始于回肠末端。相反，溃疡性结肠炎受限于结肠和直肠。在一个优选的实施方案中炎性肠病存在于有奶过敏或有形成奶过敏风险的人受试者中。在又一个优选实施方案中，炎性肠病选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃食管反流疾病(GERD)、胃肠炎、结肠炎和/或食管炎中的一种或多种。GERD是由食管中反常的回流引起的疾病。具体而言，胃食管反流疾病(GERD)、胃肠炎、结肠炎和/或食管炎常见于有牛奶过敏的人受试者中。
关于本发明，术语“促炎细胞因子”是由免疫系统的细胞、优选地由抗原呈递细胞或T细胞和最优选地由T细胞在人受试者中释放，并介导和/或增强炎性疾病的细胞因子。炎性细胞因子的非限制性实例是IL-12、IL-17、IL-5、IL-4、IFN-γ、IL-8、TNF-α、IL-6或IL-1。用于测定由免疫系统的细胞释放的细胞因子水平的方法为技术人员所熟知，包括实施例中描述的方法。因此，所述方法包括例如测定培养上清液中的细胞因子水平。
术语“能够在摄入营养配方后下调促炎细胞因子的含有T细胞表位的肽”是指在可下调促炎细胞因子水平的营养配方中的含有T细胞表位的肽，所述促炎细胞因子释放自免疫细胞，优选T细胞或APC，更优选T细胞。此外，将这些有能力的含有T细胞表位的肽以足以在摄入所述营养配方后下调促炎细胞因子的量施用于人受试者。与在与抗原接触后的特应性免疫反应中的促炎细胞因子水平相比，优选促炎细胞因子水平下调至少20%，例如至少50%，例如至少75%，优选至少90%，更优选至少95%，和最优选100%。在摄入营养配方后能够下调促炎细胞因子的含有T细胞表位的肽可通过本领域技术人员已知的方法鉴定，所述方法例如在本发明下文的实施例中描述。因此，测定在暴露于肽后在PBMC的培养上清液中释放的促炎细胞因子的水平，鉴定在摄入营养配方后能够下调促炎细胞因子的含有T细胞表位的肽。
如本文所描述的，本发明意料之外地发现来源于牛奶的本发明的含有T细胞表位的肽能够下调炎性细胞因子，所述细胞因子在暴露于过敏原或饮食/微生物抗原后或受过敏原或饮食/微生物抗原所刺激而释放。因此，本发明的营养配方适合于治疗炎性肠病。
本发明一个优选的实施方案涉及本发明的营养配方，其中一种或多种肽为从含牛奶肽的水解产物中分离的含有T细胞表位的肽。
如上所详述，含牛奶肽的水解产物包含来源于水解牛奶蛋白质的肽。这些肽可通过本领域技术人员所熟知的标准技术从含牛奶肽的水解产物中分离。因此，分析纯化通常利用三种特性中的至少一种以分离肽。首先，可将肽根据其等电点通过使其穿过pH梯度凝胶或离子交换柱而纯化。第二，可根据肽的大小或分子量通过大小排阻层析或通过SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析来分离肽。第三，另一种肽纯化方法可包括膜过滤(例如，超滤)，其产生适于预期应用的肽混合物。经常通过用2D-PAGE来纯化肽，然后用肽质量指纹法来分析肽以建立肽身份。获自水解产物的经分离和鉴定的肽然后可通过应用技术人员已知的标准方法重组制备，并单独使用或者与本发明的含牛奶肽的水解产物结合使用。
本发明另一个优选的实施方案涉及本发明的营养配方，其中所述一种或多种肽具有SEQ ID NO：3和/或4的氨基酸序列。
如以下实施例所示，当用牛奶蛋白质重刺激时，SEQ ID NO：3 (图2，Cas3，αS1-肽3)和SEQ ID NO：4 (图2，Cas4，αS1-肽4)的氨基酸序列抑制T细胞的增殖，从而诱导对牛奶蛋白质的耐受(参考图4)。
本发明的又一个优选实施方案涉及本发明的营养配方，其中含牛奶肽的水解产物是广泛水解的含牛奶肽的水解产物。
本发明更优选的实施方案涉及本发明的营养配方，其中广泛水解的含牛奶肽的水解产物为NutramigenTM、NutramigenTM基料或广泛水解的牛酪蛋白水解产物。
如本发明以下实施例所示，当用牛奶蛋白质重刺激T细胞时，广泛水解的含牛奶肽的水解产物能够抑制T细胞的增殖。因此诱导了对牛奶蛋白质的耐受。因此，VTP 3、VTP11和VTP15 (参考图1)对诱导耐受最有效，因此是按照本发明的包含广泛水解的含牛奶肽的水解产物的营养配方的优选实例；VTP3为NutramigenTM，VTP11为NutramigenTM基料以及VTP15为用于NutramigenTM中的广泛水解的牛酪蛋白。可通过Mead Johnson Nutrition，2400 West Lloyd Expressway Evansville，Indiana 47721-0001，USA购买VTP3、VTP 11和VTP 15。VTP3、VTP 11和VTP 15包含广泛水解的牛酪蛋白。图8提供了包含于VTP3、VTP 11和VTP 15中的酪蛋白衍生肽的概况。VTP15仅由图8列出的肽组成。NutramigenTM (VTP3)除包含图8中列出的肽还包含以下成分：葡萄糖浆、植物油(棕榈油精油(palm olein oil)、椰子油、大豆油、高油酸葵花油)、改性玉米淀粉< 2 %，磷酸钙< 1%，柠檬酸钙、柠檬酸钾、氯化钾、L-胱氨酸、氯化胆碱、L-酪氨酸、肌醇、氧化镁、L-色氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、牛磺酸、L-肉碱、DL-α-醋酸维生素E、硫酸锌、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、棕榈酸视黄酯、硫酸锰、盐酸硫胺、核黄素、盐酸吡哆醇、碘化钠、叶酸、维生素K1、钼酸钠、氯化铬、维生素D3、亚硒酸钠、生物素、维生素B12。
本发明的又一个优选实施方案涉及本发明的营养配方，其中人受试者是儿童或青少年。
按照本领域提供的定义在本文使用术语“儿童”或术语“青少年”。因此，术语“儿童”意指在出生阶段和约10岁之间的人受试者，而术语“青少年”意指在约10岁和青春期（性成熟之前）之间的人受试者。
本发明在又一个优选的实施方案中涉及本发明的营养配方，其中人受试者是成人。
按照本领域中提供的定义在本文使用术语“成人”。因此，该术语意指青春期之后（性成熟之后）的人受试者。
本发明的又一个优选的实施方案涉及本发明的营养配方，其中人受试者有牛奶过敏。
术语“牛奶过敏”描述食物过敏，即在人受试者中对包含于牛奶中的一种或多种蛋白质的免疫不良反应。主要的症状是胃肠症状、皮肤病学症状和呼吸症状。这些可译成皮疹、荨麻疹、呕吐、腹泻、便秘和不良应激。临床谱延伸至各种病症：过敏反应、特应性皮炎、喘鸣、婴儿腹痛、胃食管反流疾病(GERD)、食管炎、结肠炎、胃肠炎、头痛/偏头痛和便秘。
在本发明的营养配方的另一个优选的实施方案中，所述营养配方另外包含碳水化合物、核酸、脂质、矿物质、合成代谢性营养物、维生素、抗氧化剂、益生菌菌株和抗脂肪肝剂中的一种或多种。
优选地加入本发明营养配方的这些另外化合物以提供本文上述营养配方的营养价值。也可优选将它们加入以提供完整的营养、最佳持续能量和/或合成代谢性营养配方。脂质的非限制性实例包括椰子油、大豆油和甘油单酯和甘油二酯。例示性碳水化合物为例如葡萄糖、可食用乳糖和水解的玉米淀粉。矿物质和维生素的非限制性实例分别为钙、磷、钾、钠、氯化物、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘以及维生素A、E、D、C和复合维生素B。益生菌菌株包括例如乳酸菌(LAB)和双歧杆菌。抗氧化剂的实例包括天然抗氧化剂，例如抗坏血酸(AA, E300)和生育酚(E306)，以及合成抗氧化剂，例如没食子酸丙酯(PG, E310)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁羟基茴香醚(BHA, E320)和丁羟甲苯(BHT, E321)。核酸的非限制性实例是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
本发明的又一个优选实施方案涉及本发明的营养配方，其中瞬时诱导耐受。
按照本发明的术语耐受的“瞬时”诱导涉及以下免疫耐受：在人受试者中在摄入本发明的营养配方后诱导所述免疫耐受持续有限时间段，所述人受试者优选为有牛奶过敏或有形成牛奶过敏的风险的人受试者。在这点上，短暂的时间段规定人受试者不会获得持久耐受。瞬时耐受优选涉及诱导持续至少半天、例如持续至少一天、例如持续至少两天、优选持续至少一星期，更优选持续至少两星期、甚至更优选持续至少一个月和最优选持续至少3个月的耐受。按照本发明，诱导瞬时耐受持续少于6个月。
附图简述
附图显示：
图1：命名为VTP1-VTP16的奶试验样品的概述，所述样品获自不同的供应商，并包括完整牛奶蛋白质配方、部分水解和广泛水解的酪蛋白和乳清蛋白质以及氨基酸牛奶配方和氨基酸配方。
图2：合成的肽和蛋白质。列出了所述肽或蛋白质的名称、其氨基酸序列、长度、pI和分子量(kDa)。
图3：在增殖测定中分析的个体的人口统计学表征、临床表征和血清学表征。
图4：用PBMC进行增殖测定以测定对奶样品VTP1-VTP16的T细胞反应性。用奶样品、牛奶过敏原(rαS1-酪蛋白、rαS2-酪蛋白、nα-酪蛋白)、αS1-酪蛋白衍生肽(αS1-肽1- αS1-肽6)、桦树花粉过敏原rBet v 1a和草花粉过敏原Phl p 5-肽1刺激来自6名非过敏性个体和来自7名牛奶过敏患者的PBMC。显示刺激指数。
图5：为了分析在PBMC中不同奶样品(VTP1-VTP16)诱导哪些细胞因子，在PBMC的上清液中进行luminex-分析。显示对已用奶样品VTP1-VTP16 (1-16)或培养基(17)刺激的来自6名非过敏性个体(NA)和5名牛奶过敏患者(CMA)的PBMC培养物上清液中的细胞因子水平(y轴：pg/ml)的分析。
图6：进行使用非过敏性个体(AB)的耐受实验以显示肽可以过敏原特异性方式诱导对T细胞的免疫耐受(tolerize T-cell)。在非过敏性个体的实验中亦可显示耐受，因为将耐受测定为T细胞反应性下降(Ebner等，J. Immunol. 1995，第154卷，第1932-1940页)。只要非过敏性个体包含过敏原反应性T细胞，即可在T细胞水平检测对所述过敏原的耐受。
将PBMC分离，并通过MACS分离技术获得富含T细胞和抗原呈递细胞(APC)的级分。将T细胞级分与大量的肽(αS1-酪蛋白肽1、αS1-酪蛋白肽2、αS1-酪蛋白肽3和对照肽Phl p 5-肽1)或乳清广泛水解产物(VTP8)或乳清/酪蛋白部分水解产物(VTP6)预孵育过夜。第二天将T细胞和APC混合，并用完整的牛奶蛋白样品(VTP13、VTP14)或用完整的rαS1-酪蛋白刺激。
用相同的个体进行两个实验。在组图a和c中显示每分钟计数(cpm；反映T细胞增殖)，在组图b和d中显示刺激指数(SI)。
图7：针对其诱导对T细胞的免疫耐受的能力评价奶水解产物的使用非过敏性个体(KFI)所进行的耐受实验。将T细胞级分与大量NutramigenTM基料(VTP11)、酪蛋白广泛水解产物(VTP15)、完整的牛奶乳清蛋白质(VTP14)、NutramigenTM (VTP3)、合成肽(αS1-酪蛋白肽4和对照肽Phl p 5-Pep 1)或缓冲液(UCO)预孵育过夜。第二天将T细胞和APC混合，并用奶样品(VPT14、VTP1)刺激。T细胞刺激以每分钟计数(cpm)给出或给出为刺激指数(SI)。显示个体实验的cpm及其平均值。突出用10 μg VTP14刺激所获得的数据。
图8：包含于VTP3、VTP 11和VTP 15 (图1)的酪蛋白衍生肽的概况。列出了Ionscore、所述肽的氨基酸序列、疏水性评分和苦味评分。
实施本发明的最佳方式
实施例阐明本发明。
实施例1：
实验过程
生物材料与患者
命名为VTP1-VTP16的奶样品获自不同供应商，并包括完整的牛奶蛋白质、部分水解的、广泛水解的以及氨基酸配方。通过IgE免疫筛选从制备自牛乳腺的cDNA表达文库中分离编码αS1-酪蛋白(rαS1-cas)的cDNA (Schulmeister等，J. Immunol. 2009)。将重组过敏原表达于大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21 Codon Plus (DE3)-RIPL (Stratagene，La Jolla，CA)中作为六聚组氨酸标记的蛋白质，并通过Ni2+亲和层析(QIAGEN，Hilden，德国)纯化。重组的Bet v1a购买自Biomay (Vienna，奥地利)。
在本地市场购买含有3.5%脂肪的经巴氏灭菌的牛奶(N?M，奥地利，批号：22 550 2：00)，以及从Sigma-Aldrich (Vienna，奥地利)购买天然的牛奶蛋白质。
通过用纯化的rαS1-cas、rαS2-cas、rβ-cas、rκ-cas、rα-la、rβ-lg，和rlf (Charles，River，Kissleg，德国)免疫兔三次来获得兔血清。
使用ImmunoCAP系统(Phadia，Uppsala，瑞典)根据对牛奶提取物的阳性病史、阳性皮肤穿刺反应或特异性IgE的测定来选择牛奶过敏患者。
将在消耗奶后没有任何问题的人招募为对照。他们包括非过敏者以及对除奶之外的过敏原来源有IgE介导的过敏的患者。
奶样品的表征
用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(Biorad，Hercules，CA)评估奶样品VTP1-VTP16的组成。
将VTP1-VTP16的1μg等分试样点样于硝酸纤维素膜上用于免疫印迹分析(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)。将硝酸纤维素条带用PBST (PBS，0.5% v/v Tween 20)封闭并在4℃下暴露于1：10、1：20或1：2000稀释的奶过敏患者血清、健康个体血清或兔抗血清中过夜。用在PBST中1：15稀释的125I标记的抗人IgE抗体(IBL，汉堡，德国)检测结合的人IgE抗体，或用在PBST中1：2000稀释的125I标记的抗兔IgG (Perkin Elmer，美国)检测结合的兔IgG，并在-80℃下通过用带有增感屏的Kodak XOMAT胶卷(Kodak，奥地利)的放射自显影法显影。
按照制造商说明书以0.1 EU/ml -1.0 EU/ml灵敏度范围通过鲎变形细胞溶解物测定(Lonza，Basel，瑞士)定量本研究中使用的奶样品的内毒素水平。
大鼠嗜碱性粒细胞白血病(RBL)测定
对于IgE抗体介导速发型反应的定量，如前述(Schulmeister等，J Immunol. 2009，卷182(11)，第7019-29页)进行huRBL细胞介体释放测定。简而言之，将用人FcεRI受体转染的RBL细胞(克隆RBL-703/21)与来自牛奶过敏患者的血清孵育过夜。第二天清洗所述细胞，加入100 μl奶组分(浓度：0.3 μg/ml)并在37℃，7% CO2，95%湿度下孵育1小时。将上清液等分试样与测定溶液(0.1 M柠檬酸或柠檬酸钠，pH 4.5 + 160μM 4-甲基伞形酮基(umbelliferyl)-N-乙酰基-β-D-葡糖酰胺)混合，并在37℃，7% CO2，95%湿度中孵育1小时。用荧光微量培养板读数器测定荧光，因而可计算特异性释放。减去单独用缓冲液获得的数值，超过总释放的5%的值视作阳性。
细胞制备和淋巴组织增生性测定
将来自非过敏性个体和牛奶过敏患者的PBMC用菲可(Ficoll)密度梯度离心(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)从肝素化血液中分离。在96孔板(Nunclone；Nalgen Nunc International，Roskilde，丹麦)中，在补充了2mM L-谷氨酰胺(GIBCO，Auckland，NZ)、50 μM b-巯基乙醇(GIBCO)和0.1 mg/ml庆大霉素(GIBCO)的200 μl无血清Ultra Culture培养基(UltraCulture，Lonza，Verviers，比利时)中以一式三份培养PBMC (2x105个细胞/孔)。在有或没有不同浓度的各种水解样品的情况下在37℃下在含有5% CO2的潮湿环境中孵育所述细胞7天。用不同浓度刺激细胞，将4U IL-2/孔(Roche，Mannheim，德国)用作阳性对照和将仅培养基用作阴性对照。在孵育6天后，将0.5 mCi 3H-胸苷(GE Healthcare)加入每个孔达16 h，然后通过液体闪烁计数测定掺入的放射性。增殖表示为使用microbeta闪烁计数器(Wallac ADL，Freiburg，德国)的每分钟计数(c.p.m.，三重测定的平均值)。刺激指数(SI)计算为抗原c.p.m.和培养基对照c.p.m.的商。
上清液中细胞因子水平的分析
使用基于xMAP Luminex荧光珠粒的技术(Luminex Corp.，Austin，TX)在收集自培养第6天的PBMC培养物的上清液中测量细胞因子水平(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。根据制造商说明书(R&D Systems，Wiesbaden，德国)进行所述测定，并在Luminex 100系统(Luminex Corp.)上读取荧光信号。检测限对于IL-2是3.2 pg/ml，对于IL-4是3.5 pg/ml，对于IL-5是1.9 pg/ml，对于IL-6是5.5 pg/ml，对于IL-10是3.1 pg/ml，对于IL-12是57 pg/ml，对于IL-13是47 pg/ml，对于IFN-γ是2.9 pg/ml，对于TNF-α是5.3 pg/ml，对于GM-CSF是3.3 pg/ml，对于TGF-β1是21 pg/ml，对于TGF-β2是178 pg/ml，以及对于TGF-β3是5 pg/ml。
耐受诱导实验
对于耐受诱导实验，将来自健康供体的PBMC通过菲可密度梯度分离，以及将所述细胞进一步分成两部分。用人Pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国)富集T细胞，而用人CD3 MicroBeads (Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国)通过磁力细胞分选富集抗原呈递细胞。通过FACS分析确定细胞级分的纯度。
将包含T细胞的细胞级分与不同的肽或仅培养基在37℃和5% CO2和95%湿度下孵育过夜，抗原呈递细胞级分在相同的条件下没有任何抗原的情况下保持过夜。第二天，用DPBS (GIBCO)清洗T细胞级分三次，以及将T细胞和抗原呈递细胞级分混合。如上述将所述细胞(2x105个细胞/孔)在96孔板中一式三份培养。用不同浓度的奶样品、4U IL-2 /孔或仅培养基刺激细胞。如对淋巴组织增生性测定所描述那样进行分析。
实施例2：
结果
健康的非过敏性个体对牛奶过敏原表现出正常的IgG应答但无IgE应答。在实验中比较了在牛奶过敏性个体和健康非过敏性个体中的定量(增殖)和定性(即细胞因子)应答两者。
所述实验鉴定了水解产物中的小肽，其可阻断T细胞受体和MHCII，使得在有对奶过敏原的随后暴露时有有限增殖或没有增殖。因此，所述实验鉴定了片段，使得可诱导对牛奶过敏原的耐受。
另一种方法是将已预暴露于肽/水解产物的T细胞混合于T-APC的培养物中，已将所述T-APC预孵育并用完整蛋白质制备物重刺激。这应显示肽抑制/阻抑对完整奶蛋白质攻击的应答的能力。
迄今为止用16个牛奶样品以及用αS1酪蛋白衍生肽和对照抗原关于淋巴组织增生性应答测试了6名非过敏性和7名牛奶过敏性个体。非过敏性个体和牛奶过敏患者诱导了可比的刺激指数。与其它奶样品相比，NutramigenTM样品诱导了较弱的T细胞增殖。氨基酸配方诱导了最弱的应答。将通过SDS-PAGE和质谱分析鉴定为完整牛奶蛋白质源的VTP13和14，用作耐受实验的对照，因为它们诱导了强的淋巴组织增生性应答。通过luminex分析关于13种细胞因子分泌分析来自11名测试个体的培养上清液。这些结果因以下两个原因非常引人关注及惊人：首先，细胞因子水平分析显示NutramigenTM样品(VTP3、4、11、12、15)以低量诱导促使Th2分化的细胞因子(GM-CSF、IL-5和IL-13)以及促炎细胞因子(IL-6、TNF-α和IFN-γ)。相反，已发现在样品VTP2、VTP5和VTP14中促炎细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-6)的强诱导，所述样品是仅部分水解的蛋白质或包含完整的蛋白质。具体而言，IFN-γ的诱导似乎成问题，因为存在IFN-γ可损害上皮细胞的证据。在用非过敏性个体和用过敏性个体进行的实验中，除了在非过敏性个体中上调较强的IFN-γ外，分泌的细胞因子的量在相同范围中。
某些牛奶衍生肽(例如，αS1酪蛋白)在PBMC中诱导T细胞增殖。因为在某些条件(例如，没有适当共刺激下结合到T细胞受体，生命婴儿期早期存在大量的T细胞反应性肽)下任何T细胞反应性肽亦可诱导T细胞耐受，假定可将αS1酪蛋白衍生T细胞反应性肽用于诱导耐受以鉴定额外的T细胞反应性肽。在这点上，证明了可合成制备的αS1酪蛋白衍生肽的致耐受性活性。将来自反应性个体的PBMC分为T细胞级分和包含APC的T细胞耗竭的级分(抗CD3偶联珠粒)。将T细胞级分与酪蛋白衍生肽和对照肽(草花粉过敏原Bet v1、Phl p 5衍生肽)预孵育，清洗，然后与所述肽一起暴露于APC级分。使用该测定，有可能证明这些酪蛋白衍生肽的奶特异性致耐受性活性。
在努力探索致耐受肽的过程中成功建立了培养条件。在下一步中鉴定了一种αS1酪蛋白衍生候选肽，其在两个独立实验中显示抑制T细胞应答。αS1酪蛋白衍生肽3当加入到分离的T细胞级分时，抑制当用乳清蛋白浓缩物VTP14或rαS1酪蛋白重刺激时的在混合的T细胞-APC级分中的增殖。对肽4获得类似的结果。此外，研究了酪蛋白水解产物VTP3 (NutramigenTM)、VTP11、VTP14和VTP15对完整牛奶蛋白质诱导的增殖的潜在抑制作用，并已发现尤其与NutramigenTM (VTP3)的预孵育能够诱导耐受。
<110> 美赞臣营养品公司
<120> 用于耐受诱导的包含含牛奶肽的水解产物和/或其衍生肽的营养配方
<130> R3074 EP
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 牛(Bos taurus)
<400> 1
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu
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<211> 33
<212> PRT
<213> 牛
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Ser
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<212> PRT
<213> 牛
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35
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<212> PRT
<213> 牛
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<212> PRT
<213> 牛
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<213> 牛
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<212> PRT
<213> 牛
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<211> 213
<212> PRT
<213> 牛
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<213> 疣皮桦(Betula verrucosa)
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<212> PRT
<213> 梯牧草(Phleum pratense)
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<213> 牛
<400> 12
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Pro Gln Tyr Leu Lys Thr Val Tyr Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro
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Trp Ile Gln Pro Lys Thr Lys Val Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu
195 200 205
机译： 营养制剂，其包含水解产物，所述水解产物包含用于诱导耐受性的牛奶肽和/或由其衍生的肽
机译： 营养制剂，其包含用于耐受诱导的含牛奶肽的水解产物和/或其衍生的肽
机译： 营养制剂，其包含用于耐受诱导的含牛奶肽的水解产物和/或其衍生的肽
