一种还原降解释药的喜树碱超分子胶束前药及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种还原降解释药的喜树碱超分子胶束前药及制备方法和应用，即针对喜树碱溶解性不好，通过超分子胶束对喜树碱进行物理包裹，合成一种可在人体环境中发生纳米尺度分子自组装、粒径在100nm左右且分布范围窄、在血液中能长效循环、对癌变组织靶向性的、药物释放速率可控的高分子纳米胶束。提高喜树碱的水溶性，最大限度减低其毒副作用，同时提高疗效和生物利用度，以期克服目前喜树碱临床治疗效果不理想的瓶颈。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术、纳米医药及新材料技术领域，具体地说是一种还原降解释药的喜树碱超分子胶束前药及制备方法和应用。 

背景技术

喜树碱（CPT）对治疗多种恶性肿瘤具有显著疗效，其通过作用于DNA拓扑异构酶 I（DNA topoisomerase I）来抑制DNA复制、转录和有丝分裂。其闭合的的内酯环形式也即E环是抑制肿瘤的有效成份，但在生理pH下，E环20位羟基能与邻位的酯羰基形成分子内氢键，使E环易于水解并开环形成羧酸盐形式而导致其活性大大降低，且其水溶性很差，这阻碍了喜树碱在临床上的应用。

为了改善喜树碱的水溶性，Jianjun Cheng等（Molecular Pharmaceutics1, 2004, 183-193）将喜树碱（CPT）连接在环糊精聚合物（CDP）上，对喜树碱进行改性，合成了高分子前药CDP-CPT，从而提高了喜树碱的水溶性，降低了其毒副作用，但由于其自身缺乏被动靶向，生物降解能力差，并且不具有细胞内定点稳定释药的功能，限制了其在临床应用。

经过对现有文献的检索发现，二硫键（-S-S-）是一类还原敏感化学键，在人体谷胱甘肽的还原作用下可发生断裂。同时研究发现，人体细胞外谷胱甘肽浓度很低，约2-20微摩尔/升，不足以使二硫键断裂。而细胞内谷胱甘肽浓度可达10毫摩尔/升，特别是癌细胞内谷胱甘肽浓度甚至高达40毫摩尔/升，足以使二硫键断裂。引入二硫键并以PEG为载体的纳米胶束包裹喜树碱药物，在人体内可以实现细胞内定点释药、对病变组织具有被动靶向，提高水溶性，降低药物毒副作用，具有较高的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肺癌、前列腺癌等广谱抗癌前药及制备方法，即针对喜树碱药物的不足，充分模拟人体内环境的特点，结合纳米生物医药的最新研究成果，利用胶束和喜树碱发生纳米尺度自组装的原理，设计、合成、组装一类粒径在100 nm左右、粒径分布范围窄、在血液中能长效循环、对癌变组织靶向性的纳米胶束载药系统，以提高喜树碱的水溶性，同时最大限度减低其毒副作用，提高疗效和生物利用度，以期克服目前治疗肺癌、前列腺癌、乳腺癌等临床应用受到制约的屏障。

本发明的具体技术方案是：

一种还原降解释药的喜树碱超分子胶束前药，该前药由超分子胶束与喜树碱自组装而成，所述超分子胶束具有下式结构：

                                                

其中：n为聚合度；超分子胶束的粒径能够控制在70～100nm，mPEG的分子量在1000～5000 Da，优选1900 Da。

其前药的制备过程如下： 

第一步：合成 polymer1；

取摩尔比为1:1.1的N, N^‘-双丙烯酰胱胺（BCA）和N-（2-氨乙基）胺基-β-环糊精（EDA-β-CD）溶解在甲醇和水（体积比为9:1）的混合液中在60℃，黑暗和N₂保护的条件下反应4天，然后加入10%过量的EDA-β-CD以除掉未反应完的N, N^‘-双丙烯酰胱胺（BCA），继续反应2h，透析4天，冷冻干燥；

所述的透析冷冻干燥是指：用透析袋将过滤后的反应液置于去离子水中透析96 h后冷冻干燥。

第二步：合成polymer2；

A 取mPEG1900，4-二甲氨基吡啶，吡啶溶于重蒸的二氯乙烷中；

B 取金刚烷酰氯溶于重蒸的二氯乙烷中（金刚烷酰氯和mPEG1900的摩尔比为2.5:1）；

在冰浴和N₂气保护的条件下将B缓慢滴加到A中，滴加完毕后反应3h，然后将温度升到60℃，反应20h，在乙醚中重沉淀，沉淀物溶解在温乙醇中，重复该操作3次；

所述的重沉淀是指：将浓缩后的反应溶液逐滴滴入搅拌的乙醚中，过滤，将所得沉淀溶于温乙醇中，重复上述操作３次得polymer2。

第三步：超分子胶束；

取等摩尔的polymer1和polymer2溶解在二甲基甲酰胺中，激烈搅拌，然后缓慢加入去离子水，在室温下搅拌5h，透析2天除去二甲基甲酰胺。

第四步：载喜树碱超分子胶束自组装；

取超分子胶束和喜树碱溶于二甲基亚砜中搅拌使超分子胶束和喜树碱充分混合均匀，用冷冻法除去二甲基亚砜,然后缓慢滴加去离子水，超声，并用0.45μm的过滤头过滤，冷冻干燥。

第五步：纳米胶束系统的构筑及表征；

将上述超分子胶束溶于去离子水中，研究自组装成纳米胶束的条件，测定胶束的临界聚集浓度；用透射电镜观测其形貌，用动态光散射测定粒径、粒径分布及Zeta电位；用紫外吸收法测定其药物的释放，用凝胶渗透色谱（GPC）考查胶束的降解过程。

第六步：纳米胶束的降解与释药性能研究；

研究纳米胶束在生理pH值（pH= 7.4）和还原环境中的大分子药物的降解情况及药物释药性能。

第七步：载喜树碱胶束的毒性评价；

通过观察小鼠成纤维细胞（L929）的凋亡，评价载喜树碱胶束对细胞的毒性。

本发明的前药在人体细胞内谷胱甘肽还原作用下使疏水链上的二硫键发生断裂，喜树碱从中释放，在治疗肺癌、前列腺癌方面的应用。

本发明提高喜树碱的水溶性，最大限度减低其毒副作用，同时提高疗效和生物利用度，以期克服目前喜树碱临床治疗效果不理想的瓶颈。

附图说明

图1为超分子胶束的制备流程图；

图2为喜树碱超分子胶束的自组装模型图；

图3为polymer1的¹H NMR谱图；

图4为polymer2的¹H NMR谱图；

图5为超分子胶束的¹H NMR谱图；

图6为超分子胶束的透射电镜（TEM）图；

图7为喜树碱超分子胶束的透射电镜（TEM）图；

图8为超分子胶束的粒径及粒径分布图；

图9为还原降解过程中超分子胶束粒径随时间变化曲线图；

图10为喜树碱超分子胶束的释药性能曲线图；

图11为喜树碱超分子胶束的细胞毒性评价图。

具体实施方法

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

a）polymer1的合成

取BCA（0.5mol）和EDA-β-CD（0.5mol）溶解在甲醇和水（体积比为9:1）的混合液中在60℃，黑暗和N₂保护的条件下反应4天，然后加入10%过量的EDA-β-CD以除掉未反应完 的BCA，继续反应2h。最后用3500的透析袋透析4天，冷冻干燥，产率57%。

b) polymer2的合成

A 取mPEG1900（0.32mmol），4-二甲氨基吡啶（0.7mmol），吡啶（0.7mmol）溶于10ml重蒸的二氯乙烷中。

B 取金刚烷酰氯（139mg）溶于15ml重蒸的二氯乙烷中。

在冰浴和N₂气保护的条件下将B缓慢滴加到A中，滴加完毕后反应3h，然后将温度升到60℃，反应20h，在乙醚中沉淀，沉淀物溶解在温乙醇中，在0℃下结晶，重复该操作3次，产率70%。

c) 超分子胶束的合成

取等摩尔的polymer1和polymer2溶解在1.0ml的二甲基甲酰胺中，激烈搅拌，然后缓慢加入9ml的去离子水，在室温下搅拌5h，透析2天除去二甲基甲酰胺。

d) 载喜树碱超分子胶束的自组装

取超分子胶束（20mg）和1.0mg的喜树碱溶于二甲基亚砜（1.0ml）中搅拌使超分子胶束和喜树碱充分混合均匀，用冷冻法除去二甲基亚砜,然后缓慢滴加去离子水（1ml），超声20min，并用0.45um的过滤头过滤，冷冻干燥。

应用例1

a）超分子胶束的降解

于上述超分子胶束中加入足量二硫苏糖醇（DTT）对超分子胶束进行还原降解，每隔一段时间取样1mL，通过DLS测其粒径的变化。如图9所示，随着时间的增加，胶束粒径逐渐增大，表明在DTT的还原作用下，二硫键断裂，超分子胶束发生降解而团聚使粒径增大。

b) 载喜树碱超分子胶束的释放

将载药胶束（400 μg/mL）的PBS溶液装入透析袋中，再将透析袋置于40 mL PBS （pH= 7.4, NaCl= 0.15 g/L）的烧杯中，于37 ℃中恒温振荡，每隔一定时间取出0.5 mL透析液并补充0.5 mL的PBS，用紫外分光光度计测定CPT的累计释放浓度，计算其时间累积释放量。如图10所示，物理包裹后的CPT有着明显的缓释效果，且随着DTT浓度的增加，释药速度也随之提高，表明该胶束对肿瘤细胞有一定的定点释药功能。

c) 载喜树碱超分子胶束体外毒性的研究

采用MTT比色法。在37℃，5%CO₂的环境下体外培养小鼠成纤维细胞L929，并种在96孔板上，加入一系列浓度的CPT，BAC-EDA-β-CD- AD-PEG1900、CPT和BAC-EDA-β-CD- AD-PEG1900样品，用酶标仪测定96孔板上各孔细胞液的吸光度（OD），细胞成活率按照以下公式算得：

细胞成活率=（OD_样品/OD_控制）× 100 %

OD_样品：为加入各浓度样品细胞液的吸光度；

OD_控制：为空白培养液的吸光度。

每个样品设置6组平行样，细胞存活率结果如图11所示，说明在超分子胶束里的CPT对细胞的毒性有着明显的降低。

上述实施例及应用例仅用于说明本发明，但不局限于此，应该理解为不脱离本发明的精神范围内还有多种变通和替换方案。