法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-05-04
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20140723 终止日期:20170417 申请日:20120417
专利权的终止
2014-07-23
授权
授权
2012-11-07
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N21/55 申请日:20120417
实质审查的生效
2012-09-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种种质资源中特定DNA序列鉴定技术,特别是基于表面等离子共振技术,核酸适配体与未标记和标记的样品特异性竞争识别,采用免疫球蛋白E修饰的传感元件间接鉴定种质资源中特定DNA序列的方法。
背景技术
种质资源是国民经济可持续发展的基础性战略资源。然而,近年来,我国种质资源流失严重,一方面我国拥有的人类遗传资源、重要经济作物资源、药用资源、工业微生物资源等通过非正当途径大量流失到国外;另一方面一些发达国家在我国建立植物提取物粗加工基地,掠夺性地从我国引进优等药材和资源性提取物。此外,长期以来,我国种质资源鉴定通常是根据形态标记来进行的,如株高、穗长、粒色等。此种形态标记简单直观,但存在数少、多态性差、易受环境条件影响等缺点。因此,导致我国种质资源保护工作面临着巨大的挑战,严重缺乏能满足巨大数量和多种类型物种资源检测鉴定的分析技术。
近10年来,在人类基因组研究计划的推动下,结合现代检测鉴定技术,分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。荧光定量PCR技术可以通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,但该技术目前并不能准确地鉴定种质资源;而建立在PCR基础上直接测序的方法,成本昂贵,无法实现快速高通量检测鉴定。可以说,在物种遗传标记等真实性检测鉴定技术方面我国基本处于空白状态。以表面等离子体共振谱仪为技术平台,可以为种质资源中特定DNA序列的快速鉴定提供一种简便可靠的方法,大大缩短了检测鉴定时间,有望发展成为种质资源鉴定的标准化检测平台。但其存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如,采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore,其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此,如何实现同一传感芯片检测不同特定DNA序列已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。
发明内容
为了解决现有特定DNA序列分析技术存在的耗材量大、造价昂贵等问题,同时满足对种质资源中各种DNA序列的鉴定要求,本发明提供了一种种质资源中特定DNA的表面等离子体共振鉴定方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点,满足对种质资源中特定DNA序列的鉴定要求。
本发明的技术方案为:一种应用表面等离子共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法,利用同一传感芯片对不同种质资源中特定DNA序列进行鉴定;其特征在于包括以下步骤:
(一)传感芯片表面适配体固定:选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片,通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体,在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体;
(二)对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记,标记方法根据待测物基团不同;所述标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。如将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后,再与免疫球蛋白E的氨基偶联,形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物,待用;
(三)标准溶液配制:用0.01-0.1mol/L(pH=7.4)的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液,浓度为0.1ng/mL至1mg/mL,加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合,获得特定单链DNA标准溶液,其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量;
(四)建立对照曲线:采用表面等离子共振谱仪测量,以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准,通过微泵通入5-100μL特定单链DNA标准溶液,记录下表面等离子体共振仪光谱图,获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A;
(五)检测鉴定:提取种质资源总DNA,进行不对称PCR扩增反应,获得单链DNA;对于待测单链DNA样品进行一系列预处理,取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后,竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体,其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量;采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图;通过检测免疫球蛋白E,间接鉴定特定DNA是否存在;对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A,当B小于A时,说明种质资源中含有特定DNA序列,当B等于A时,说明不含有特定DNA序列;
(六)通入0.01-0.05mol/L(pH为2-3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液,冲洗传感芯片表面,进行传感元件再生,用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。
可以采用核酸适配体为识别分子,核酸适配体序列与待测物直接相关。
所述步骤(一)传感器表面适配体固定,包括如下步骤:
(1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中,在工作通道中进行在线传感表面修饰;
(2)通入0.02mol/L(pH=7.4)的磷酸盐缓冲液;
(3)通入5-50μL浓度为1-50μg/L生物素修饰的免疫球蛋白E适配体溶液,进行在线偶联至基线稳定;
(4)重复步骤(2)至(3),获得免疫球蛋白E适配体修饰的传感芯片。
可以采用免疫球蛋白E标记待测物,与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。
所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。
所述步骤(四)和(五)中通过检测免疫球蛋白E的含量,间接鉴定特定DNA是否存在,提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性,适用于各种种质资源中特定DNA序列的检测。
本发明的有益效果:
(1)本发明解决种质资源中特定DNA序列鉴定芯片的专一性差问题,引入免疫球蛋白E作为标记分子,采用生物素标记的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰,将种质资源中特定DNA序列的鉴定转换为对免疫球蛋白E的测量,实现传感芯片的通用性,使用同一传感芯片对种质资源中不同特定DNA序列进行鉴定。具体检测原理见附图1;
(2)本发明解决芯片稳定性差问题,采用适配体作为芯片表面通用配体,再生容易。可重复使用性强,极大地延长了芯片的使用寿命,降低检测成本;
(3)本发明解决试剂消耗量大问题,采用待测样品中DNA序列和免疫球蛋白E标记的特定DNA序列竞争识别特定DNA的适配体时,相对于以往的竞争抑制结合思想,无须加入过量的适配体,既实现了响应信号放大,也节省了试剂消耗;
(4)本发明提高了检测灵敏度,操作中可选用纳米粒子修饰的特定DNA适配体,基于表面等离子体共振检测时,信号显著增加。
附图说明
图1是本发明所述的种质资源中特定DNA序列鉴定原理图;其中 为特定DNA序列,为样品中待鉴定DNA序列,为免疫球蛋白E标记的特定DNA序列,为特定DNA的适配体,为免疫球蛋白E的适配体,为纳米粒子。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。
实施例:选择水稻显性早熟基因Ehd的一段SSR序列为鉴定对象,具体操作步骤如下:
(1)传感器表面适配体固定:选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片,通过通入20μL浓度为30μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体,在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体;
(2)水稻显性早熟基因Ehd特定SSR序列和免疫球蛋白E偶联:将特定SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后,再与免疫球蛋白E的氨基偶联,形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-特定SSR序列偶联物,待用;
(3)标准溶液配制:用0.02mol/L(pH=7.4)的HEPBS缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液,浓度为0.1ng/mL至1mg/mL,加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合,获得特定单链DNA标准溶液,其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量;
(4)建立对照曲线:采用表面等离子共振谱仪测量,以0.02mol/L的HEPBS缓冲液为测量基准,通过微泵通入30μL特定单链DNA标准溶液,记录下表面等离子体共振仪光谱图,获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A;
(5)特定SSR单链鉴定方法
将处理后的样品通过(1)修饰好的传感芯片表面进行鉴定,具体步骤为:
1)对待测单链DNA样品进行一系列预处理,取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后,竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体,其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量;
2)将处理后的待测溶液流过传感芯片表面10min,记录下工作通道和参比通道的表面等离子体共振仪光谱图稳定值B;
3)对比待测单链DNA的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A;当B值小于A值时,种质资源中存在特定DNA序列,否则反之;
4)对传感芯片进行再生,通入20mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液10min,用以破坏免疫球蛋白E与芯片上适配体的结合,并通入缓冲液冲洗。
本发明为了叙述的准确和方便,在实施例中以水稻显性早熟基因Ehd的一段SSR序列进行详细描述,但本发明同样适用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。传感器表面再生所用溶液选择0.02mol/L(pH=2.4)甘氨酸-盐酸溶液,但还可以选择盐溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液,如0.5mol/L氢氧化钠溶液或10 mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液,破坏凝血酶与适配体的结合,因此上述内容均在本发明保护范围之内。此外,根据实施例1的方法进行检测样品,与现有表面等离子体检测技术相比,准确度提高2~10倍,探头寿命延长10倍以上,现有表面等离子体检测技术不能准确检测的短链特定DNA序列等(小分子量<1000 Da),可以采用本发明的方法获得准确的检测结果。
机译: 一种制备包含重链和轻链的免疫球蛋白的方法,该免疫球蛋白对特定的已鉴定抗原具有特异性,编码相同的DNA序列,该DNA序列的可复制表达载体,以及用该载体转化的重组宿主细胞
机译: 具有天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶活性的DNA序列和蛋白的用途,用于检测抑制天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物活性的物质以及鉴定具有除草剂作用的物质的方法,该物质可抑制天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物中的氨基甲酸酯转移酶,基于DNA序列表达的测试系统以及天冬氨酸氨基甲酸酯转移酶植物的抑制剂
机译: 用于鉴定西方拟南芥的物种特定基因组DNA序列及其在制茶样品中腰果皮检测中的应用方法