反式-4-(5S)S-3,5-双(三氟甲基)苯基甲基(2-甲基-2H-四唑-5-基)氨基-2,3,4,5-四氢-7,9-二甲基-1H-1-苯并氮杂*-1-基甲基-环己烷羧酸

摘要

本发明公开了命名为反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸的化合物，其为游离酸或者其药学上可接受的盐、水合物和结晶水合物的形式；药物制剂；及其使用方法。

说明书

本发明涉及反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四 唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧 酸、该化合物的药学上可接受的盐和结晶形式，以及它们的制备方法和应用 该化合物的治疗方法。

血脂异常是心血管疾病(CD)的主要风险因素。伴有正常或者升高水平 的低密度胆固醇(LDL-c)的高密度脂蛋白胆因醇(HDL-c)的低血浆水平是 发展动脉粥样硬化症和相关的冠状动脉病的重要风险因素。胆甾基(或者胆 固醇)酯转换蛋白(CETP)是一种促进HDL中胆固醇酯与富含甘油三酯-的 脂蛋白中甘油三酯交换的糖蛋白。CETP活性的最终结果是减少HDL胆固醇 和增加LDL胆固醇。普遍认为这对脂蛋白分布的影响是促进动脉粥样硬化， 特别是在脂质分布构成对CHD具有升高风险的对象中。

公开的PCT申请WO 06/002342公开了某些可以用于治疗心血管疾病的 化合物，它们具有以下结构(其中R¹-R⁶描述在该申请中)。

尽管存在上述发明，但是仍然迫切需要可以用于治疗心血管疾病(包括 动脉粥样硬化症和/或血脂异常)的有效化合物。

需要提供能够经口服给药有效治疗心血管疾病的化合物，其在比如胃中 的酸性环境中是稳定的。此外，一旦给药，该化合物需要表现出足够高的生 物利用度和/或口服接触量，以获得更有效的治疗。

本发明致力于满足这些需求，提供了适于治疗心血管疾病(包括但不限 于血脂异常和动脉粥样硬化症)的化合物。本发明提供了表现出特别有利和 预想不到的性能的化合物。本发明所要求化合物的物理和药理学性能使得其 特别适于被配制成用于口服给药的片剂。所述特别有利的性能尤其包括：更 高的稳定性、溶解性和/或生物利用度。

本发明提供了具有以下所示的式I结构的化合物，反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5- 双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基 -1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸(根据它的化学文摘索引名称确定， 在本文中还称为BCCA)，和该化合物的药学上可接受的盐。

该化合物BCCA，可以为游离酸(在本文中称为BCCA游离酸)或者其 药学上可接受的盐，为溶剂化物(在本文中称为BCCA·溶剂化物)和水合物 (在本文中称为BCCA·水合物)。所述溶剂化物分子包括水(为水合物)、甲 醇、乙醇、甲酸、乙酸和异丙醇。

本发明提供了BCCA化合物、其药学上可接受的盐、或者其水合物或溶 剂化物。在一种形式中，化合物BCCA以游离酸的形式提供。在其他形式中， BCCA以结晶形式的BCCA·水合物或者BCCA(游离酸或者盐)·溶剂化物形 式提供。在另外的其他形式中，本发明提供从BCCA·水合物或者BCCA·溶剂 化物至无定形固体形式的BCCA。

本发明提供了结晶形式的BCCA·水合物化合物，其特征在于由CuKα源 获得的X-射线粉末衍射图案，其包括在以下位置的峰：a)7.5、 9.2、10.7和15.5+/-0.2(2θ值)；b)7.5、9.2、10.7、13.8、15.0、15.5 和19.5+/-0.2(2θ值)；或者c)7.5、9.2、10.7、13.8、11.3、15.0、15.5、 17.7、19.5和25.1+/-0.2(2θ值)。

在另一形式中，本发明提供了结晶形式的BCCA·水合物的化合物，其特 征在于包括以下峰的固态NMR谱，以金刚烷(δ＝29.5ppm)作为参照，所 述峰位于：a)175.6、168.0、611、212和18.3+/-0.2ppm；b)175.6、168.0、 145.6、144.8、611、45.0、21.2和18.3+/-0.2ppm；或者c)175.6、168.0、145.6、 144.8、139.9、136.3、61.1、53.0、49.8、45.0、21.2和18.2+/-0.2ppm。

在另一形式中，BCCA以结晶形式的BCCA·水合物提供，其特征在于以 下至少一种：a)由CuKα源获得的X-射线粉末衍射图案，其 包括在7.5、9.2、10.7和15.5+-0.2(2θ值)处的峰；或者b)固态NMR 谱，其包括以金刚烷作为参考(δ＝29.5ppm)，位于175.6、168.0、61.1、21.2 和18.3+/-0.2ppm处的峰。

本发明提供了结晶形式的BCCA·半叔丁胺盐·半乙醇溶剂化物的化合 物，其特征在于由CuKα源获得的X-射线粉末衍射图案，其 包括在以下位置的峰：a)5.5、9.0、14.3、22.0和22.5+/-0.2(2θ值)； 或者b)5.5、9.0、14.3、17.5、18.2、19.4、20.6、22.0和22.5+/-0.2(2θ 值)；或者c)5.5、9.0、13.2、13.6、14.3、15.2、17.5、18.2、19.4、19.8、20.6、 220和22.5+/-0.2(2θ值)。

本发明提供了结晶形式的BCCA·甲酸溶剂化物的化合物，其特征在于由 CuKα源获得的X-射线粉末衍射图案，其包括在以下位置的 峰：a)15.4、16.9、18.2和18.6+/-0.2(2θ值)；或者b)15.4、15.7、16.9、 18.2、18.6、19.5、22.8、25.7和25.5+/-0.2(2θ值)；或者c)13.0、13.9、 15.4、15.7、16.9、16.4、18.2、18.6、19.5、20.8、22.8、25.7和25.5+/-0.2 (2θ值)。

本发明提供了结晶形式的BCCA·乙酸溶剂化物的化合物，其特征在于由 CuKα源获得的X-射线粉末衍射图案，其包括在以下位置的 峰：a)12.9、15.1、18.4、19.4和20.8+/-0.2(2θ值)；或者b)12.9、13.8、 15.1、16.4、17.8、18.4、19.4、20.1和20.8+/-0.2(2θ值)；或者c)11.00、 12.9、13.8、15.1、15.6、16.4、17.8、18.4、19.4、20.1、20.8和21.7+/-0.2 (2θ值)。

本发明提供了结晶形式的BCCA叔丁胺盐·异丙醇溶剂化物的化合物，其 特征在于由CuKα源获得的X-射线粉末衍射图案，其包括在 以下位置的峰：a)5.6、11.3、12.6和17.9+/-0.2(2θ值)；或者b)5.6、 8.0、11.3、12.6、17.9、20.4和24.1+/-0.2(2θ值)。

在另一形式中，本发明提供了作为溶剂化物的BCCA或者其药学上可接 受的盐，其中溶剂化物选自：水(还称为水合物)、甲醇、乙醇、异丙醇、甲 酸或者乙酸。BCCA与溶剂化物的摩尔比可以为约1∶0.3～约1∶1，更优选约 1∶0.5～约1∶1+/-0.2(BCCA或者盐∶溶剂化物)。优选的溶剂化物包括水、异 丙醇和乙醇。

在另一形式中，本发明提供了作为药学上可接受的盐的BCCA。优选的 药学上可接受的盐的阳离子可以选自：钠、钾、镁、钙、锌或者叔丁胺(或 者叔丁铵)。更优选的阳离子为钠、钙和叔丁胺。

本发明提供了基本上纯的BCCA，其为BCCA游离酸或者其药学上可接 受的盐、BCCA·水合物、BCCA·溶剂化物(或者BCCA·水合物)和结晶形式 的BCCA盐·溶剂化物(分别为“参考的BCCA形式”)。在此使用的术语“基 本上纯的”是指包含大于80％w/w的参考BCCA形式的组合物，优选大于 95％w/w的参考BCCA形式，并且更优选大于98％w/w的参考BCCA形式。 在特别优选的方面中，本发明提供了基本上纯的为结晶形式的BCCA·水合物。

本发明提供了包含BCCA或者其药学上可接受的盐和至少一种药学上可 接受的载体、赋形剂或者稀释剂的药物组合物。在选定的形式中，药物组合 物包含基本上纯的BCCA，其为BCCA游离酸或者其药学上可接受的盐、 BCCA·溶剂化物、BCCA盐·溶剂化物或者结晶形式的BCCA·水合物。在特 别优选的方面中，所述药物组合物包含基本上纯的结晶形式的BCCA·水合物。

本发明还提供了治疗患者心血管疾病的方法，其中所述方法包括时患者 施用有效量的BCCA。在优选的形式中，所述方法包括施用BCCA·水合物形 式的BCCA。在另外的其他形式中，所述方法包括施用结晶形式的BCCA· 溶剂化物或者结晶形式的BCCA·水合物。

本发明提供根据本发明的BCCA(为BCCA游离酸或者其药学上可接受 的盐、BCCA盐·溶剂化物、BCCA·水合物、或者结晶形式的BCCA·溶剂化 物或结晶形式的BCCA·水合物)用于制造治疗心血管疾病(包括但不限于血 脂异常和动脉粥样硬化症)的药物的用途。

本发明提供作为药物的BCCA(为根据本发明的BCCA游离酸；结晶形 式的BCCA盐·溶剂化物、BCCA·水合物或者BCCA·溶剂化物)。本发明还提 供用于治疗学的BCCA(为根据本发明的BCCA游离酸；结晶形式的BCCA 盐·溶剂化物、BCCA·水合物或者BCCA·溶剂化物)。

本发明还提供用于治疗心血管疾病(包括但不限于血脂异常和动脉粥样 硬化症)的BCCA(为根据本发明的BCCA游离酸；或者结晶形式的BCCA· 水合物、BCCA盐·溶剂化物或者BCCA·溶剂化物)。

本发明还提供具有以下所示结构的化合物：

其中R选自C_1-4烷基、C_3-6环烷基、C_1-4烷基-C_3-6环烷基、苯基和C_1-5烷 基苯基，从而提供式I化合物或者其药学上可接受的盐。优选的R基团包括 C_1-4烷基、C_1-4卤代烷基、C_3-6环烷基、C_1-4烷基-C_3-6环烷基、苯基和C_1-5烷基 苯基。特别优选的R基团包括甲基、乙基、苯基和苄基。

在本文中提及的术语C_1-4烷基或者C_1-5烷基分别包括具有1～4个碳原子 或者1～5个碳原子的直链或者支链烷基链。术语卤代烷基是指具有一个或 者多个连接在一个或者多个碳原子上的卤素的烷基。如上所述，烷基可以为 直链或者支链。优选卤素为氟、氯和溴。特别优选氟。

在另外一种形式中，本发明提供了以下化合物

或者其药学上可接受的盐。

本发明提供了一种制备BCCA的方法。该方法包括对以下式II化合物进 行去酯化：

其中R选自C_1-4烷基、C_1-4卤代烷基、C_3-6环烷基、C_1-4烷基-C_3-6环烷基、 苯基或者C_1-5烷基苯基，以提供式I化合物或者其药学上可接受的盐，从而提 供BCCA或者其药学上可接受的盐。优选的R基团包括C_1-4烷基、苯基和 C_1-5烷基苯基。特别优选的R基团包括甲基、乙基、苯基和苄基。

所述方法还可以包括对环己基基团上的受保护的羧酸取代基进行去保 护。各种酸保护官能团、制备受保护的酸的方法和对酸进行去保护的方法的 实例可以参见″Protecting Groups in Organic Synthesis″，第三版，Greene，T.W.， Wuts，P.G.M.编辑，John Wiley and Sons，New York，1999。本领域熟练技术 人员应当认可，除了羧酸和受保护的羧酸之外，还可以使用其他可以轻易转 化为羧酸的官能团来替换羧酸或者受保护的羧酸。所述官能团、制备和这些 基团至羧酸的转化可以参见″Comprehensive Organic Transformations：A Guide  to Functional Group Preparations″，Larock.R.C，Wiley VCH，1999，和″March ′s Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Structure″，Smith， M.B.和March，J.，Wiley-Interscience，第六版，2007。

在另外一种形式中，本发明提供了如上所述的方法，并且进一步包括使 以下式III化合物

与

缩合，其中R如上所述，从而提供式I化合物或者其药学上可接受的盐。如 上所述，在以上结构中表示为CO₂R的羧酸、酯或者受保护的酸可以用能够 转化为羧酸或者受保护的酸的官能团替换。

优选有效的CETP抑制剂化合物应该同时化学稳定和热稳定、表现出便 于给药和配制的充分溶解性以及保持足够的活性。此外，化合物应当表现出 足够高的生物利用度，从而在体内提供化合物的有效治疗量。BCCA显示的 这些性能在现有技术中并未及，并且根据现有技术也无法预测。

BCCA·水合物可以在环境温度下贮存而较少或者极少降解。通过差示扫 描量热法测量时，结晶形式的BCCA·水合物化合物在大于约50℃时开始去 溶剂化和/或熔化，这使得它适用于标准的工业过程(比如研磨)。此外，当在 环境温度下贮存时，结晶形式的BCCA、BCCA叔丁胺盐·异丙醇溶剂化物、 BCCA半叔丁胺盐·半乙醇溶剂化物和BCCA·水合物并不吸湿。而且，其药学 上可接受的盐，比如钙和锌盐，当在环境温度下贮存时，也基本上并不吸湿。

呈游离酸、盐、溶剂化物或者水合物结晶形式的BCCA可以根据以下方 案1、2、3和4中总体所示的下述步骤进行制备，更具体而言，根据以下制 备和实施例中所述的步骤进行制备。

本文使用以下缩略语：ACN是指乙腈；AcOH是指乙酸；(S)-BINAP是 指S-(-)-2，2′-双(二苯膦基)-1，1′-联萘；CBZ-Cl是指氯甲酸苄基酯；cpd是指化 合物；Bn是指苄基；DMF是指二甲基甲酰胺；Δ是指加热；DI水是指去离 子水；eq是指当量；erbumine是指叔丁胺(或者叔丁基铵盐)、2，2-二甲基乙 基胺或者2-甲基-2-丙胺；IPA是指异丙醇；M是指摩尔/升；mol是指摩尔； MTBE是指甲基叔丁基醚；N是指当量溶液；PPTS是指对甲苯磺酸吡啶鎓盐； TFA是指三氟乙酸；THF是指四氢呋喃；RT是指室温。除非指出情形相反， 本文中所述的化合物均利用CHEMDRAWULTRAAUTONOM版本7.0.1或者 Draw版本3.2命名和编号。

方案1

方案2

制备：

除非另作说明，所有的非水溶液反应都在干燥的氮气气氛下进行。除非 另外指出，否则商品级的试剂和无水溶剂都按照由供应商处获得的形式使用， 并不需要尝试对这些组分进行进一步纯化或者干燥。溶剂的减压除去利用 Buchi旋转蒸发器，使用Teflon-内衬的KNF真空泵在大约28mm Hg压力下 实现。快速柱色谱法利用Kieselgel硅胶60进行。质子NMR谱在Bruker AC 300 MHz核磁共振波谱仪上获得，并且使用四甲基硅烷作为内标以ppmδ值记录。 API质谱分析在Finnegan LCQ Duo Ion Trap或者PESciex API 150EX质谱仪 上，使用电喷雾电离(ESI)或者大气压化学电离(APCI)进行。HPLC分析 使用Waters Symmetry C 18，5μm，WAT046980，3.9x150mm柱进行。洗脱系统 由以下组成：95∶5(含0.1％TFA的水)/(含0.1％TFA的CH₃CN)历时10 分钟梯度洗脱至0∶100(含0.1％TFA的水)/(含0.1％TFA的CH₃CN)，随 后利用含有0.1％TFA的CH₃CN溶液无梯度洗脱15min。流速为1mL/min。 UV检测在254nm或者220nm下进行。

为了进行鉴定和纯度评价，将制备和实施例的以上所列的选定物理性质 与已知的样品进行比较。

制备1

2-(叔丁氧羰基氨基)-3，5-二甲基苯甲酸甲酯(3)

向装配有悬挂式搅拌器、冷凝器、加热套、5L加料漏斗和N₂吹洗管的 22L烧瓶中加入2-氨基3，5-二甲基苯甲酸(2)(705g，4.27摩尔，1.0当量， 基本上根据Chemische Berichte 1992，125(4)，849-855中公开的方法制备)和氢 氧化钠(8.08kg，8.46摩尔)。在搅拌下，将所得深色溶液加热至45℃。向 加料漏斗中加入溶于1，4-二噁烷(2.75L，22.7摩尔)的二碳酸二叔丁酯(1.92 kg，9.08摩尔)。将二碳酸二叔丁酯溶液加入到烧瓶中并且搅拌过夜，同时保 持反应温度为大约45℃。向加料漏斗中加入另外的溶于1，4二噁烷(500mL) 的二碳酸二叔丁酯(0.961kg，4.27摩尔)，并且缓缓地将该容置物加入到烧 瓶中，同时进行搅拌并且保持反应温度为大约45℃。反应完成之后，滴加加 入硫酸二甲酯(607.1mL，6.40摩尔)；搅拌过夜，同时使反应温度冷却至室 温。过滤所得浆液，收集固体并且用水洗涤(2x2L)。在真空中进行干燥(50 ℃)，从而得到为粗产品的标题化合物(748g)。

制备2

2-(叔丁氧羰基(4-乙氧基-4-氧代丁基)氨基)-3，5-二甲基苯甲酸甲酯(4)

向装配有悬挂式搅拌器、加热套、冷凝器和N₂吹洗管的22L烧瓶中加 入DMF(10L)、4-溴丁酸乙酯(1.07kg，787.8mL，5.32摩尔)、碳酸铯(2.92 kg，22.5摩尔)和2-(叔丁氧羰基氨基)-3，5-二甲基苯甲酸甲酯(1,000.0g，3.54 摩尔)。将所得混合物加热至大约55℃，并且将其搅拌约48小时。冷却； 滤出固体；并且用MTBE洗涤所得固体(2x4L)。将所得滤液和MTBE洗涤 液合并入50L烧瓶中，并且冷却至低于约5℃。加入水(6L)以猝灭反应。 分离各层。用MTBE(3L)洗涤水层；合并有机层；并用盐水(2x3L)洗 涤所得有机溶液。用Na₂SO₄干燥所得有机溶液；过滤；并用MTBE洗涤收 集的固体，从而得到1.582kg标题化合物。

制备3

7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1，4-二羧酸叔丁酯4-乙 酯(5A)和7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1，4-二羧酸叔丁 酯4-甲酯(5B)

向装配有悬挂式搅拌器、热电偶、5L加料漏斗、氮气吹洗管和冷却浴的 22L烧瓶中加入溶于THF(3.5L)的2-(叔丁氧羰基(4-乙氧基-4-氧代丁基)氨 基)-3，5-二甲基苯甲酸甲酯(700g，1.78摩尔)，并且将其冷却至低于约5℃。 向加料漏斗中加入在THF中的1M叔丁醇钾(KOt-Bu，3.56摩尔，1M)并 且将其滴加加入到冷却的THF溶液中，同时保持反应温度在5℃左右。如 果加入完成之后，使反应混合物升温至环境温度。在反应完成之后，将混合 物冷却至低于10℃并且缓缓地加入2.5M HCl，以提供pH小于约3的混合 物。加入MTBE(4L)并且进行搅拌；然后将有机层从水层中分离。用MTBE (2L)提取水层。合并有机层，并且用盐水(2x3L)顺序洗涤。用MgSO₄干燥有机层；过滤；并用MTBE清洗收集的固体。合并滤液溶液，并在真 空下除去溶剂，从而得到橙色油状的标题化合物的混合物(670g)。

制备4

7，9-二甲基3，4-二氢-1H-苯并[b]氮杂-5(2H-)-酮盐酸盐(6)

向装配有悬挂式搅拌器、加热套、热电偶、氮气吹洗管和聚四氟乙烯输 送管路的5L烧瓶中加入溶于IPA(2L)中的7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢 -1H-苯并[b]氮杂-1，4-二羧酸叔丁酯4-乙酯和7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢 -1H-苯并[b]氮杂-1，4-二羧酸叔丁酯4-甲酯的混合物(1286g，3.56摩尔)， 并且将所得混合物加热至50℃。在另一装配有悬挂式搅拌器、加热套、热电 偶和连接洗涤器的氮气吹洗管的12L烧瓶中加入5NNaOH(1L)和H₂O(3 L)。此后向12L烧瓶中加入HCl(浓HCl，1.87L，21.8摩尔)，并且加热 至50℃。经输送管路将5L烧瓶中的物质输送到12L烧瓶中，同时用N₂吹 洗以从反应中除去废气。在加入之后，使所得混合物升温至80℃，并且继续 用N₂吹洗。在反应完成之后，使反应混合物冷却至低于约20℃。加入MTBE (4L)，并且用NaOH水溶液将pH调节至中性。将所得反应混合物输送至 22L烧瓶中，并且分离各层。用MTBE(2x2L)洗涤水层。合并有机洗液， 用盐水(2L)洗涤、用MgSO₄干燥、进行过滤并且用MTBE冲洗。将所得 滤液浓缩成深色油。将其溶解在IPA(8体积)中并输送到装配有悬挂式搅拌 器、热电偶、1L加料漏斗和N₂吹洗管的12L烧瓶中。向加料漏斗中加入 HCl(浓HCl，765mL)，并且历时约1小时将其滴加加入到IPA溶液中。将 所得浆液搅拌约1-2小时、过滤、用冷IPA(3x500mL)清洗固体和将固体在 约50℃下干燥过夜，从而得到561g标题化合物。

制备5

7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯(7)

向具有悬挂式搅拌器、热电偶、3L加料漏斗、挡板、冷却浴和N₂吹洗 管的22L烧瓶中加入7，9-二甲基-3，4-二氢-1H-苯并[b]氮杂-5(2H-)-酮盐酸盐 (1,000g，4.43摩尔)。加入2-甲基四氢呋喃(6.44kg，7.5L，74.5摩尔)，并 且搅拌该灰白色浆液。冷却至5-15℃。向加料漏斗中加入水(2.5L，138.8 摩尔)和Na₂CO₃(1.12kg，3摩尔)，然后历时约25m以快速滴加方式缓缓 地加入到反应混合物中。向2L加料漏斗中加入氯甲酸苄基酯(91.59kg， 8.86摩尔)，滴加加入到反应中，同时保持反应混合物低于约15℃。将所得 混合物输送至装配有冷凝器的烧瓶中，加热至25-25℃并且搅拌约50h。冷 却至约15℃，加入HCl(5M，直至pH为约5)。分离各层。用甲基四氢呋 喃(4L)提取水层；合并有机层并且用水(41)洗涤。在约40℃下浓缩有 机层。加入IPA(4L)，然后浓缩至2L。输送到装配有悬挂式搅拌器、热电 偶、加热套、冷凝器、2L加料漏斗和N₂吹洗管的12L烧瓶中。将烧瓶中 的内含物加热至约70-80℃，并且加入庚烷(5L)。缓慢冷却至室温过夜； 如果需要，向混合物添加晶种，从而诱发标题化合物结晶。冷却和收集固体； 用冷庚烷清洗固体和在真空中在50℃下干燥，从而提供1,316g标题化合物。

制备6

(Z)-7，9-二甲基-5-(2-甲基-2H--四唑-5-基亚氨基)-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b] 氮杂-1-羧酸苄酯(8A)和(E)-7，9-二甲基-5-(2-甲基-2H--四唑-5-基氨基)-2，3- 二氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯(8B)的混合物

向装配有悬挂式搅拌器、加热套、热电偶、冷凝器、Dean Stark分离器 和N₂吹洗管的12L烧瓶中加入7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮 杂-1-羧酸苄酯(920g，2.84摩尔)和甲苯(400mL)。向Dean Stark分离 器中加入甲苯(500mL)并且开始搅拌。加入2-甲基-5-氨基四唑(563.8g， 5.69摩尔)和PPTS(364.8g，0.5摩尔)，并且将所得混合物加热至回流。加 入冷水5L，倾倒入NaHCO₄(850g)溶液中，同时监控pH值防止混合物变 成酸性。将各层分离，所得水层用甲苯(4L)洗涤。合并有机层并用水(2x4L) 洗涤、用NaSO₄干燥、进行过滤和用甲苯清洗所得固体。在真空中，在约55 ℃下浓缩所得滤液，从而得到1.186kg以上标题化合物的混合物。

制备7

(S)-7，9-二甲基-5-(2-甲基-2H--四唑-5-基氨基)-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮 杂-1-羧酸苄酯(9)

向高压釜中加入(Z)-7，9-二甲基-5-(2-甲基-2H--四唑-5-基亚氨基)-2，3，4，5- 四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯和(E)-7，9-二甲基-5-(2-甲基2H--四唑-5- 基氨基)-2，3-二氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯混合物(4.04g，10毫摩尔)、 S-(-)2，2′-双(二苯膦基)-1，1′-联萘((S)-BINAP，60mg，96.3微摩尔)、KI(415mg， 24毫摩尔，需要时可以删去KI)和二氯-双((1，2，5，6η)-1，5-环辛二烯)二铱 (Ir₂Cl₂(COD)₂，927mg，40.2微摩尔)。用氮气吹洗高压釜。在保持无氧环 境的同时，加入脱气甲苯(50mL，472.8mmol)并且密封高压釜。在500psi H2下，加热至100℃，保持66h。将反应混合物冷却至室温并且进行通风。 过滤固体并且收集有机混合物。用水(2x25mL)洗涤有机混合物；用Na₂SO₄干燥并且进行过滤。收集滤液并且在真空下除去溶剂，从而提供标题化合物 (3.99g，HPLC检测ee为88.7％)。

制备8

(S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基)-7，9-二甲基 -2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯(10)

向小瓶中加入(S)-7，9-二甲基-5-(2-甲基-2H--四唑-5-基氨基)-2，3，4，5-四 氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸苄酯(100mg，246微摩尔)、NaH(23mg，在 矿物油中60％，575.1微摩尔)和THF(9.2ml，24.6毫摩尔)。(或者，可以 用叔丁醇钾的DMF溶液替换NaH和THF。)在室温下将反应混合物搅拌10 m。历时30min，滴加加入3，5-双(三氟甲基)苄基溴(173.8mg，566.2微摩尔)。 在约19h之后，加入NaH(10mg，60％矿物油)并且再搅拌1h。将反应混 合物分配在EtOAc(50mL)和盐水(2x25mL)之间。收集有机层开且用 Na₂SO₄干燥。过滤，然后浓缩所得滤液，从而得到油状物。将油状物分配在 ACN(50mL)和庚烷(2x25mL)之间。收集CAN层；进行干燥，从而获 得为标题化合物的油状物(189mg)。

制备9

(S)-N-(3，5-双(三氟甲基)苄基)-7，9-二甲基-N-(2-甲基-2H--四唑-5- 基)-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-5-胺(11)

向1L烧瓶中加入甲酸铵盐(39.0g，618.0毫摩尔)和10％Pd/C(3.91g) 和溶于MeOH(391mL，966摩尔)中的(S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2- 甲基-2H--四唑-5-基)氨基)-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-羧酸 苄酯(39.1g，61.8毫摩尔)。在室温下搅拌所得浆液，并且通过HPLC进行 监控。在反应完成之后，过滤以收集固体。用MeOH(100mL)清洗所得固 体。合并滤液溶液和有机冲洗液，然后用Na₂SO₄干燥。进行过滤并且将其 浓缩至干。溶于MeOH(92mL)中，并且加入标题化合物的晶种。冷却和 贮存过夜，从而获得14.03g标题化合物(45.5％)，HPLC检测为99.92％ee。

制备10

(反式)-4-(((S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基)-7，9- 二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-基)甲基)环己烷羧酸甲酯(12)

向装配有悬挂式搅拌器、温度传感器、氮气入口管的烧瓶中加入(S) -N-(3，5-双(三氟甲基)苄基)-7，9-二甲基-N-(2-甲基-2H--四唑-5-基)-2，3，4，5-四氢 -1H-苯并[b]氮杂-5-胺(5g，10.03毫摩尔)和三乙酰氧基硼氢化钠(3.19g， 15.05毫摩尔)以及乙腈(40mL)。将该烧瓶浸入冰浴中，从而将该浆液冷却 至低于约5℃，然后经注射器加入溶于THF(10mL)中的(反式)-4-甲酰 基环己烷羧酸甲酯(2.99g，17.57毫摩尔，基本上根据Houpis，I.N.等人， Tetrahedron Let.1993，34(16)，2593-2596和JP49048639中的方法制备)， 同时保持反应混合物在或者低于约5℃。使反应升温至室温并且搅拌过夜。 加入NH₄Cl(25mL，50％饱和水溶液)，并且将水层与有机层分离。有机层 的pH值应该为约5.5。使有机层升温至约45℃，并且加入水(16mL)。加 入标题化合物的晶种并且将其冷却至约35℃。通过过滤收集所得固体，并 且用ACN冲洗。干燥，从而提供5.80g标题化合物。

方案3：制备BCCA的替代方法

制备12

7，9-二甲基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯

步骤1：将3000L玻璃内衬反应器抽空至低于-0.08MPa，然后充入N2 至正常压力，重复三次。在N₂下，在搅拌的同时向反应器中加入2，4-二甲基 苯胺(300.0kg)和三乙胺(873.0kg)。将混合物升温至70-75℃，然后通 过500L加料容器以20-25kg/小时的速度加入4-溴丁酸乙酯(604.0kg)，同 时保持温度为70-75℃。在70-75℃下将混合物搅拌2小时，然后通过GC 检测反应是否完成。当两个连续样品的2，4-二甲基苯胺含量小于3％且杂质 (4-((2，4-二甲基苯基)(3-(丙酰氧基)丙基)氨基)丁酸乙酯)的含量小于10％时， 认为反应已经完成。56小时后，杂质的含量小于10％，但是2，4-二甲基苯胺 的含量仍然大于3％，因此将额外的4-溴丁酸乙酯(6.0kg)加入到混合物中， 17.5小时之后，2，4-二甲基苯胺的含量仍然大于3％，但是此时将反应猝灭。

将反应混合物冷却至15-25℃，然后将其输送入两个5000L玻璃内衬反 应器中。向各个反应器中加入水(1200.0kg)和甲苯(1044.0kg)。将混合 物搅拌一小时和静置一小时，然后进行分离。合并两个反应器的有机相，并 且用水(1200.0kgx2)洗涤两次。对有机相进行取样以确保三乙胺小于23％。

在减压下(≤-0.08MPa)，在50-60℃下对有机相进行浓缩，直至没有馏 分产生和三乙胺的重量％小于0.1％和KF小于1％为止。将混合物冷却至20-30 ℃，在步骤2中直接使用该产物(4-[(2，4-二甲基苯基)氨基]丁酸乙酯)。

气相色谱(GC)：柱：HP-5，30m长×0.32mm IDx0.25μm膜或者柱等 同物；载气：氦气；流速：1.90mL/min；运行时间：22.5min；程序：初始温 度：50℃(开始)和初始时间：2.00min；升温：1速率：20；最终温度：260； 最终时间：10.00；升温#2：0.0(关闭)；入口温度250℃；检测温度：300℃。

保留时间：1)(13.56min)4-[(2，4-二甲基苯基)氨基]丁酸乙酯；2)(17.40) 4-((2，4-二甲基苯基)(3-(丙酰氧基)丙基)氨基)丁酸乙酯；3)(8.38min)2，4-二 甲基苯胺。

步骤2：向2000L玻璃内衬反应器中加入甲苯(742.0kg)和4-[(2，4二 甲基苯基)氨基]丁酸乙酯(171.0kg)。搅拌混合物，并且逐份加入碳酸钠(77.0 kg)。保持温度为20-25℃，并且以18kg/小时的速度加入氯甲酸甲酯(96.2 kg)。在20-25℃下搅拌混合物，并且在一小时之后通过GC进行监控。当 4-[(2，4-二甲基苯基)氨基]丁酸乙酯的含量小于1％时，认为反应已经完成。将 上述混合物输送入5000L玻璃内衬反应器中，并且用甲苯(75kg)清洗该 2000L反应器。以360-400kg/小时的速度加入NaOH(87.2kg)、甲醇(934.0 kg)和水(1482.0kg)溶液，同时保持温度为20-25℃。然后，将混合物加 热至55-65℃，并且在55-60℃下进行搅拌。一小时之后，通过HPLC测试样 品以确定4-[(2，4-二甲基苯基)氨基]丁酸乙酯的水平。将混合物冷却至20-30℃， 保持一小时，然后进行分离。在减压下(低于或等于0.09MPa)，在40-50℃ 对水相进行浓缩，直至蒸出929kg甲醇。

将混合物冷却至15-25℃，加入水(256.5kg)，搅拌0.5小时，并且用二 氯甲烷(342.0kgx2)提取。将温度降低至0-5℃并且保持此温度，以40-50kg/ 小时的速度加入浓HCl(269.0kg)，从而调节pH值至1-2。将混合物加热至 15-25℃，并且在保持该温度的同时搅拌1小时。分离，用二氯甲烷(684.0kg x2)提取水相，并且合并有机相。用0.5％HCl(342.0kgx2)洗涤有机相 两次，然后用浓HCl(3.4x2kg)洗涤两次。在减压下(小于或等于-0.08MPa； 40-50℃)浓缩有机相，直至没有馏分蒸出。向残余物(4-[(2，4-二甲基苯基)- 甲氧羰基-氨基]丁酸)(制备11)中加入二氯甲烷(250.0kg)，并且直接用于 下一步骤中。190.0kg(407.4kg溶液)；产率：98.5％；纯度：97.8％。

HPLC：柱：Waters XTerra MS C18；4.6x150mm，3.5μm；230nm检测； 流速1.0ml/min；温度25℃；等浓度流动相：A：ACN；B：H₂O+0.1％H₃PO₄(v/v)。保留时间：(13.86min)4-[(2，4-二甲基苯基)-甲氧羰基-氨基]丁酸。

步骤3：将3000L玻璃内衬反应器抽空至小于-0.08MPa，然后充入N₂至正常压力，重复三次。加入二氯甲烷(1900.0kg)、(4-[(2，4-甲基苯基)- 甲氧羰基-氨基]丁酸)(190.0kg)和DMF(11.4kg)，并且进行搅拌。将上述 混合物冷却至-5-0℃，并且在保持该温度的同时，以18kg/小时的速度加入亚 硫酰氯(85.3kg)。在-5-0℃下，搅拌该混合物。一小时之后，通过HPLC检 测反应，确定4-[(2，4-二甲基苯基)-甲氧羰基-氨基]丁酸的含量是否小于1％。 为了分析该样品，将该样品加入到甲醇中，并且通过HPLC进行测定。在正 常压力下，在40-45℃下浓缩上述混合物，直至不再有馏分蒸出，然后冷却 至15-25℃。然后，在减压下(小于或等于-0.08MPa)，在40-45℃下进行浓 缩，直至没有馏分蒸出。用二氯甲烷(1031.0kg)进行稀释。在30-35℃下， 滴加加入二氯甲烷(1030.0kg)和无水氯化铝六水合物(287.2kg)的溶液。 将混合物在35-45℃下搅拌2小时，然后通过HPLC进行监控，直至7，9-二甲 基-5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯的含量大于80％。(取 混合物，将其加入到甲醇中，并送去用HPLC进行检测)。用水(1140.0kg) 和冰(570.0kg)的混合物使其骤冷，并保持温度为0-10℃，搅拌1小时。 将混合物升温至15-25℃，搅拌0.5小时，静置0.5小时并进行分离。用水 (814.0kgx2)洗涤有机相。向有机相中加入硅胶(380.0kg)，并且将混合物 搅拌1小时。过滤混合物，用二氯甲烷(339.0kg)清洗滤饼并且合并滤液。 在减压下(小于或等于-0.08MPa)，在40-45℃下浓缩滤液，直至剩余150-200 L混合物为止。

加入庚烷(190.0kg)，通过循环水将混合物冷却至15-20℃，然后通过 盐水将其冷却至0-5℃。在该温度下搅拌混合物以进行结晶。过滤混合物， 在35-40℃下，在干燥室中干燥所得滤饼，从而获得80.9kg灰白色固体。HPLC 97.9％。在氮气保护下，将其贮存在干燥和密封的地方。

HPLC程序：与以上步骤2相同。保留时间(14.71min)7，9-二甲基-5- 氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯。

制备13

5，5-二甲氧基-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯

步骤4：在环境温度和氮气覆盖下，向装配有悬挂式搅拌器的烧瓶内的 7，9-二甲基5-氧代-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯(1000g；1.00当 量；404摩尔)的甲醇(2.50L)和三甲氧基甲烷(9.10摩尔；995.42mL； 965.55g)溶液中加入Amberlyst^TM 15(100g)。将反应混合物加热至50℃， 并且保持该温度1小时。1小时之后，反应完成。

将反应混合物冷却至环境温度，过滤Amberlyst珠粒并且用甲醇(500mL) 冲洗。装配插管，并且在悬挂式搅拌下将溶液加入到0.1M KOH溶液(1L) 中，随后加入H₂O(1500mL)。将所得浆液搅拌20分钟，然后使用带有聚 丙烯垫片的32cm陶瓷过滤器进行过滤。所得滤饼用4x1L水洗涤，并且在 过滤器上抽吸至干燥。在真空烘箱中，在60℃下干燥过夜。过夜之后，弄 碎厚块并且继续在60℃下干燥过夜。干燥之后的粗产量：1235g。将所得粗 固体溶于5体积庚烷(6L)中，加热至70℃，并且在70℃下搅拌15min。 将溶液冷却至55℃，此时向反应混合物中加入晶种。继续缓慢冷却，在～45 ℃时开始出现产物。继续缓慢冷却至室温，然后将浆液搅拌过夜。在聚丙 烯垫片上对产物浆液进行过滤。用2x500mL庚烷冲洗所得滤饼。在过滤器 上抽吸干燥，然后将其置于45℃的真空烘箱中，直至干燥(～4天)。766g。 HPLC纯度为99.9％。

HPLC：Zorbax Bonus-RP 50x4.6mm，1.8μm；2ml/min，40℃，10-30％ ACN历时12min，在14min时至95％，保持2min，再平衡洗脱液为10mM 乙酸铵。保留时间＝13.77min。

制备14

(5S)-7，9-二甲基-5-[(2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并 氮杂-1-羧酸甲酯

步骤5：通过用N₂干燥1-2小时，确保氢气反应器是干燥的。向反应器 中加入2-甲基-2H--四唑-5-胺(52.0g)、5，5-二甲氧基-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢 -1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯(140.0g)、Ir₂Cl₂(COD)₂(0.080g)、TBAI(1.76 g)、(1S)-(+)-10-樟脑磺酸(2.2g)和(S)-difluorphos(0.163g)。将反 应器置于5psi氮气下。经插管/氮气加入600mL甲苯(用N₂鼓泡75min)。 用20psi氮气吹洗反应器2次，并且不允许压力降低到5psi以下。在反应器 上施加500psi的氢气，并且使其缓慢升温至115℃。保持该温度过夜。将 其冷却至50℃和取样进行HPLC分析。对于手性HPLC，用甲苯稀释样品， 用碳酸氢钠洗涤，在Na₂SO₄上进行干燥，并且用庚烷/乙醇进行稀释。

将甲苯溶液倾倒入分液漏斗中并且加入140mL乙酸乙酯，以使得所有 物质都进入到分液漏斗中和使得所有物质在操作期间都处于溶液中。用420 mL 1M NaOH溶液洗涤上述溶液(有机层外观混浊；水层澄清)。分离各层， 并且用420mL H₂O洗涤有机层。在大气压力下将有机层蒸馏至1.5体积甲苯 (全部溶液剩余2.5体积)。将溶液冷却至60℃，在60℃下历时3分钟加入 700mL庚烷(～5V)，并且在悬挂式搅拌(150rpm)下将所得透明溶液在60 ℃下加热过夜。15min之后，产生更多固体。在第二天早上，冷却所得浆液、 过滤、收集固体物质，并且在真空烘箱中在60℃下将其干燥3小时。126.97 g，HPLC：99.4％纯度，手性HPLC：94.6％ee。

HPLC：Zorbax Bonus-RP 50x4.6mm，1.8μm；2ml/min，40℃，10-30％ ACN历时12min，在14min时至95％，保持2min，再平衡洗脱液为10mM 乙酸铵。保留时间＝11.36min。

手性HPLC：Chiralpak IA250x4.6mm，2ml/min，40℃，5％IPA 11min， 在12min时至50％IPA，保持15min，在15.1min时恢复至5％IPA，保持 20min。保留时间＝11.48min。

制备15

(5S)-7，9-二甲基-N-(2-甲基四唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-5- 胺

步骤6：在悬挂式搅拌下，将(5S)-7，9-二甲基-5-[(2-甲基-2H--四唑-5- 基)氨基]-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-羧酸甲酯(20.1g)、NaOH(12.10g) 和乙醇(80mL)合并在250mL聚四氟乙烯烧瓶中。用氮气鼓泡10分钟， 加热至回流(85℃)并且保持～5.5小时。用冷水浴冷却至室温。在室温下 缓缓地加入乙酸/水(17.5mL/53mL)，并且中途通过加料器输送至500mL烧 瓶中(总加料时间～30min)。加入～5mg(5S)-7，9-二甲基-N-(2-甲基四唑 -5-基)-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-5-胺作为晶种。加热至50℃(约15分 钟之后达到该温度)。历时约30分钟，加入54mL水。第二天，在冰浴中进 行冷却，过滤并用甲醇∶水(1∶1；2x30mL)冲洗。在真空中在60℃下干 燥湿滤饼，从而得到13.99g(5S)-7，9-二甲基-N-(2-甲基四唑-5-基)-2，3，4，5-四 氢-1H-1-苯并氮杂-5-胺。HPLC分析：99.4％，保留时间为4.84min。手性 HPLC：98.5％手性纯度。

HPLC方法：Zorbax SB-C875x4.6mm，3.5μm，2mL/min，40℃，225nm 波长，5％乙腈(ACN)保持2分钟，10分钟后至95％ACN，并且保持1min。

手性HPLC：Chiralpak AD-H 150x4.6mm，5μm，1ml/min，30℃，等 浓度的50％乙醇/庚烷。

制备16

(5S)-N-[3，5-双(三氟甲基)苄基]-7，9-二甲基-N-(2-甲基-2H--四唑-5- 基)-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-5-胺

步骤7：在加入到反应中之前，通过液面下通入N₂使各溶液饱和而使所 有的液体脱气。向带有氮气入口的250mL烧瓶中加入(5S)-7，9-二甲基-N-(2- 甲基四唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-5-胺(18.36毫摩尔；5.00g)和 甲苯(15.00mL)。历时30分钟滴加加入在甲苯中为0.5M溶液的六甲基二硅 基叠氮化钾(19.28毫摩尔；38.55mL)。观察到放热升温至21.5℃。将上 述反应混合物搅拌30分钟。历时30分钟，加入在甲苯中为1M溶液的1-(氯 甲基)-3，5-双(三氟甲基)苯(25.71毫摩尔；25.7mL)。观察到放热升温至25.5 ℃。在室温下将反应混合物搅拌16小时。用水(2x20mL)洗涤反应混合 物。合并水层并且用甲苯(1x25mL)反提取。合并甲苯层，浓缩至干燥， 并且所得残余物利用92mL 60％的1-丙醇水溶液重结晶。在0℃下将结晶产 品搅拌2小时、过滤并且用10mL50％的1-丙醇水溶液冲洗。在真空中，在 45℃下对分离的产品进行干燥。7.735克。HPLC显示98.3％纯度，保留时间 ＝10.62min。

梯度HPLC：柱为Zorbax Bonus RP 5μm，4.6x150cm，流速＝2mL/min； 波长＝225nm；柱温＝40℃；溶剂A＝水；溶剂B＝ACN；时间0min 85％A 15％B； 12min 10％A90％B；13min 10％A90％B；13.5min 85％A 15％B。

制备17

反式-4-{[(5S)-5-{[3，5-双(三氟甲基)苄基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基}-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基}环己烷羧酸甲酯

步骤12：在冰/丙酮浴中将(5S)-N-[3，5-双(三氟甲基)苄基]-7，9-二甲基 -N-(2-甲基-2H--四唑-5-基)-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-5-胺(3.40g，6.82 mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(3.01g，13.64mmol)和ACN(28mL)的悬 浮液冷却至-12℃～-10℃，并且经注射泵(0.66mL/min)历时30分钟加入 (反式)-4-甲酰基环己烷羧酸酯(2.03g，11.93mmol)的甲苯(18.5mL)溶 液。在冰/丙酮浴中继续搅拌反应2小时。向反应中加入44mL 10％(按重量 计)的NH₄Cl水溶液，并且在室温下搅拌30分钟。停止搅拌，存在两层。分 离上述两层，将有机层浓缩至1体积溶剂。加入24mL乙醇，浓缩成固体(或 者至1体积)。加入24mL乙醇、2mL水，并且加热至60℃(仍然为悬浮 液)。滴加加入2mL水。使悬浮液冷却至室温并且在室温下搅拌过夜。在室 温下搅拌过夜之后，将悬浮液冷却至-10℃，保持0.5h，然后进行过滤。用3 mL-10℃的EtOH∶水(4∶1)洗涤过滤的固体。在真空烘箱中，在50℃干燥 固体过夜，从而给出4.24g为无色固体的反式-4-{[(5S)-5-{[3，5-双(三氟甲基) 苄基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基}-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂 -1-基]甲基}环己烷羧酸甲酯。HPLC显示99.75％纯度。

HPLC分析：Zorbax Bonus RP 150mmx4.6mm，3.5μm，30℃，260nm UV 检测，流速：2.0mL/min，梯度：A＝0.05％的TFA/H₂O，B＝0.05％的TFA/ACN； 0min 95％A至30min 0％A至30.5min 95％A至35min 95％A。反式 -4-{[(5S)-5-{[3，5-双(三氟甲基)苄基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基}-7，9-二甲基 -2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基}环己烷羧酸甲酯在23.33min洗脱， 且顺式异构体在23.05min洗脱。

制备18

(反式)-4-甲酰基环己烷羧酸甲酯的硫酸氢钠加合物

步骤8：将12L三颈圆底烧瓶置入装配有机械搅拌器、带显示的热电偶、 氮气入口和干燥管的冷却槽中。向烧瓶中加入(反式)-4-甲氧羰基环己烷羧 酸(450g)。向烧瓶中加入二氯甲烷(2.25L)，并且在氮气下进行搅拌。在 环境温度下，经加料漏斗将草酰氯(364g，溶于CH₂Cl₂(100mL)中)加入 到烧瓶中。在室温下将上述反应混合物搅拌10分钟。在环境温度下，经加 料漏斗将催化量的DMF(1.82g溶于CH₂Cl₂(10mL)中)加入到烧瓶中。在 低于20℃的温度下，搅拌反应混合物2小时。通过GC监控反应进展：[DBI 30mx0.25mm，0.5μ]，在低于20℃的温度下取出搅拌溶液的样品。(反式) -4-氯羰基环己烷羧酸酯的保留时间(Rt)＝7.3分钟；(反式)-4-甲氧羰基环 己烷羧酸的Rt＝7.75分钟。当剩余的原料(反式)-4-甲氧羰基环己烷羧酸＜ 3.0％时，认为反应已经完成。

步骤9：在低于35℃的温度下，减压浓缩反应混合物。收集过量的草酰 氯和馏出物；使用碱性捕集器以防止酸性蒸气进入到真空系统中。残余物与 THF(2x900mL)一起共蒸发。用THF(4.5L)和2，6-二甲基吡啶(321g) 稀释残余物。转入到氢化热压釜反应器中。向反应混合物中加入5％Pd/活 性碳(45g，在THF(500mL)中成浆)。用氮气(20～30psi)吹洗反应器2～ 3次。用氢气(20～30psi)吹洗反应器2～3次。在30～35℃下，在氢气 气氛(50～60psi)中搅拌反应15小时。15小时之后，向局部排气装置中排 出氢气，并且用氮气(20～30psi)吹洗反应器2～3次。通过GC监控反应。 (反式)-4-甲酰基环己烷羧酸甲酯的Rt＝6.46分钟；(反式)-4-氯羰基环己烷 羧酸酯的Rt＝7.3分钟。当剩余的(反式)-4-氯羰基环己烷羧酸酯少于1.0％ 时，认为反应已经完成。

在氮气下，将反应混合物滤过硅藻土垫片。在低于35℃的温度下，减 压浓缩除去大部分THF溶剂。用MTBE(1.8L)稀释所得残余物，并且将 其转入分液漏斗中。用水(2.25L)洗涤有机溶液，并且分离各层。所得水 相用MTBE(2x1.8L)反提取，合并所有的有机层。用0.5N盐酸水溶液(1 x2.25L)洗涤。用饱和碳酸氢钠水溶液(1x2.5L)洗涤有机相。用盐水溶 液(1x2.5L)洗涤有机相。用硫酸镁干燥有机相，并且将混合物滤过玻璃- 纤维过滤器垫片。在低于35℃的浴温下，在减压下浓缩滤液。分离为无色 油的粗产物，不需任何进一步纯化即可使用。

步骤10：向含有0.49g亚硫酸氢钠的小瓶中加入1mL水。将小瓶置于 超声波发生器以溶解亚硫酸氢钠。向小瓶中加入5mL THF(形成双相溶液， 无固体)。将该THF和含水亚硫酸氢钠的双相溶液加入到含有(反式)-4-甲 酰基环己烷羧酸酯(1g，5.88mmol)的装配有磁力搅拌器的50mL烧瓶中。 (注意：(反式)-4-甲酰基环己烷羧酸酯的纯度仅约80％，所以使用0.8当量 的NaHSO₃。)用另外5mL THF稀释溶液，并且在1分钟内形成非常稠厚的 晶体团。将晶体团加热至回流。用3x5mL THF稀释混合物。该晶体絮凝严 重。在室温下搅拌数小时，然后过滤、用20mL THF冲洗并且在过滤器上干 燥一小时(1.27g)。在真空烘箱中，在40℃下干燥过夜，从而给出1.19g为 无色固体的(反式)-4-甲酰基环己烷羧酸甲酯的硫酸氢钠加合物。

制备19

(反式)-4-甲酰基环己烷羧酸酯

步骤11：将(反式)-4-甲酰基环己烷羧酸甲酯(3.92g，11.93mmol)的 硫酸氢钠加合物加入到碳酸钠(5.06g，47.72mmol)、甲苯(17mL)和水(33 mL)的混合物中，并且在室温下进行搅拌。在室温下搅拌1小时之后，分 离各层，并且用15mL水洗涤甲苯层。在步骤12中使用该含有(反式)-4- 甲酰基环己烷羧酸酯的甲苯溶液。

实施例1

反式-4-[[(5S)-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸无定形 固体

向烧瓶中加入(反式)-4-(((S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四唑 -5-基)氨基)-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-基)甲基)环己烷羧酸 甲酯(149mg)。加入MeOH(6mL)和1.0N NaOH(3.0mL)。将所得混 合物加热至约60℃。经TLC对反应进行监控。约7小时之后或者当原料酯 已经反应时，将混合物冷却至约0℃并且用1N HCl猝灭。用EtOAc(60mL) 稀释所得混合物。所得混合物用水(20mL)、盐水(20mL)顺序洗涤并且 用Na₂SO₄干燥。过滤并且浓缩所得滤液。经使用CH₂Cl₂的快速色谱法进行 纯化。除去溶剂，从而提供为白色固体的标题化合物(125mg)。

实施例2

反式-4-[[(5S)-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸无定形 固体

向装配有机械搅拌器、加料漏斗和热电偶的500mL 3-颈烧瓶中加入水 (265mL)，并且在冰浴中进行冷却。在第二烧瓶中将BCCA(22.0g)溶解在 40mL丙酮中，并且经加料漏斗将混合物加入到三颈烧瓶中。用另外的4mL 丙酮清洗烧瓶，并且将其加入到漏斗中。将加料漏斗中的内含物滴加加入到 烧瓶中并对所得混合物进行搅拌，同时保持温度为约0-1℃。收集所得固体， 用水洗涤两次，然后在40℃下干燥过夜，从而提供22.3g白色粉末。

实施例3

反式-4-[[(5S)-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸·水合物

用氮气对装配有悬挂式搅拌器、温度传感器和氮气入口的烧瓶进行吹洗， 然后在保持烧瓶处于正压氮气气氛的同时，加入(反式)-4-(((S)-5-((3，5-双(三 氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基)-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b] 氮杂-1-基)甲基)环己烷羧酸甲酯(1.0kg，1.53mol)、MeOH(10L)和NaOH 2M溶液(1.53L，3.06mol)。将所得混合物加热至回流(约68℃)。约4 小时之后，使反应混合物冷却至室温并且搅拌过夜。过滤混合物并且收集滤 液。加入MeOH∶水混合物(500ml，1∶1v/v)，然后缓缓加入乙酸(260mL) 以诱发沉淀。收集所得固体，为BCCA、BCCA水合物和BCCA·甲醇溶剂 化物的混合物。在烘箱中，在40℃下干燥固体。

向装配有冷凝器、热电偶、加热套和机械搅拌器的2L烧瓶中加入BCCA 固体物料(109g)、MeOH(900mL)和水(10mL)。在氮气气氛下，将所 得浆液加热至回流。在所有固体都溶解之后，除去加热并且使混合物冷却至 环境温度。如果需要，可以加入结晶形式的BCCA水合物的晶种。收集固体 物料。用甲醇∶水(9∶1v/v，100mL)和水(1L)顺序洗涤固体。在真空中， 在约40℃下干燥固体，从而提供100g白色固体。此后，使固体再在异丙醇∶ 水(1∶1v/v 1L)中成浆。收集所得固体，用水(500mL)冲洗并且在真空 中在约40℃下干燥过夜，从而提供60g标题化合物。Karl Fisher分析：2.53％ 水，元素分析：C₃₁H₃₆F₆N₆O₂·H₂O理论值(％)C 56.70，H 5.83，N 12.80； 实测值(％)：C 56.59，H 5.28，N 12.55。

固态NMR

结晶形式的晶体BCCA·水合物的¹³C交叉极化/魔角旋转(CP/MAS)NMR (固态NMR或者SSNMR)谱，使用在100.622MHz碳频率下操作并且装配 有Bruker 4mm双共振探针(K299552)的Bruker Avance II 400MHz NMR谱 仪获得。TOSS边带抑制与使用SPINAL64去耦(95.4瓦特)和RAMP100 型H-核CP脉冲的交叉极化一起应用。

采集参数如下：90°质子r.f.脉冲宽度2.50μs，接触时间为1.5ms，脉冲重 复周期20s，MAS频率5kHz，谱宽30kHz，采集时间为34ms和扫描数目 为3,844。¹³C SSNMR BCCA·水合物的代表性共振包括：175.6、168.0、145.6、 144.8、143.5、139.9、136.3、132.8、132.1、129.2、127.3、126.2、122.7、121.0、 61.1、53.0、49.8、45.0、40.2、38.7、31.4、30.4、29.0、27.8、27.0、21.2、 18.3+/-0.2ppm。

在另一试验中，化学位移参照金刚烷(δ＝29.5ppm)。

实施例4

结晶形式的反式-4-[[(5S)-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑 -5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸 水合物和乙醇溶剂化物

向烧瓶中加入(反式)-4-(((S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四 唑-5-基)氨基)-7，9-二甲基-2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-基)甲基)环己烷羧 酸甲酯(12.95kg)、EtOH(129.5L)和2MNaOH(9.9L，2当量)，将所得 混合物搅拌约10min，此后将反应混合物加热至约40-45℃，保持6小时。 用HPLC对反应进行监控。此后加入乙酸(3.75kg)，随后加入水(15.5L)， 并且用结晶形式的BCCA·水合物作为种晶。搅拌约2小时之后，将反应混合 物冷却至室温并且再搅拌2小时。收集所得固体；用EtOH∶水(1∶1，2x26 L)洗涤固体并且干燥过夜，从而得到作为乙醇溶剂化物和水合物混合物的标 题化合物15.87kg(湿重)。

实施例5

结晶形式的反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四 唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧 酸水合物

向烧瓶中加入反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H-- 四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷 羧酸(15.87kg)和水(158.8L)。在室温下将所得混合物搅拌2小时。此后， 对所得混合物进行过滤以收集固体。干燥固体过夜。将所得固体溶于加热至 约65-70℃的MeOH中2小时，得到澄清溶液。过滤该澄清溶液，然后将滤 液冷却至约0～5℃以诱发结晶。收集所得晶体，并且干燥过夜。将所得结 晶物质悬浮在水(158.8L)中，并且在室温下搅拌约2小时。收集结晶固体； 在高真空下，在40-45℃下干燥以提供固体，通过Karl Fischer法确定含水量 为2.7～3.1。

实施例6

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸水合物的 结晶

向装配有悬挂式搅拌器的250mL烧瓶中加入乙醇(100mL)、(反式) -4-(((S)-5-((3，5-双(三氟甲基)苄基)(2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基)-7，9-二甲基 -2，3，4，5-四氢-1H-苯并[b]氮杂-1-基)甲基)环己烷羧酸甲酯(10.0g，15.32毫 摩尔)和NaOH(2M，15.0mL，30.0毫摩尔)。将所得混合物温热至约40℃， 并且在该温度下搅拌约4小时。使反应混合物冷却至室温。加入乙酸(2.7mL， 45.4毫摩尔)并且升温至40℃。历时2.5h缓缓地加入水(40mL)，从而 形成浓稠的白色浆液。再继续加热1.5h，然后使浆液冷却至室温。通过过滤 收集固体，并且顺序地用乙醇∶水(20mL，1∶1)、水(20mL)洗涤固体。 将固体悬浮在水(70mL)中；经过滤收集固体；然后用水(2x20mL)洗涤 固体。再重复形成水浆液两次。收集所得固体并且在60℃下干燥，从而提 供为白色固体的标题化合物(6.1g)。

实施例7

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸水合物 的结晶

向闪烁管中加入BCCA(60mg)，并且加入1.5ml MeOH。将该澄清溶 液加热至约45℃。在100μL水中加入1.5摩尔当量的甲酸以形成白色悬浮 液。向白色悬浮液中加入0.5mL MeOH，并且缓缓加热至约55℃。数小时 之后，将悬浮液冷却至室温；通过真空过滤收集白色结晶固体；并且使将该 固体风干。通过溶液NMR对该结晶固体进行分析，发现不存在任何甲酸溶 剂。所述结晶形式可以通过差热/热重分析进行进一步表征，显示该结晶形式 在38～133℃具有2.6％的挥发物含量损失(通过TGA-MS确定为水)，并且 在81℃时开始产生损失。

差热/热重分析

差热/热重分析在Mettler Toledo DTA和TGA装置(型号TGA/SDTA 851) 上进行。在密封的具有针孔的铝盘中，伴随着50mL/min的氮气清洗，以10 ℃/min的速度将样品从25℃加热至300-350℃。TGA温度利用铟/铝标准物 校准，MP＝156.6和660.3℃。利用制造商提供的标准样品进行重量校准， 并且利用柠檬酸钠二水合物的去溶剂化进行核实。

XRD谱分析

XRD谱利用使用CuK源(λ＝1.54056，功率：40kV，50mA)的Bruker-AXS D4 Endeavor X-射线衍射仪和Vantec检测器进行收集。以0.009度2θ的步长 和每步0.5秒的时间收集4-40度2θ范围内的数据。方法：USP 29<941>， 利用内标的8.853度或者17.759度2θ峰进行位移误差校正。

主要的2θ峰列表提供于以下表1中：

表1

在结晶学领域熟知，对于任何给定的晶型，衍射峰的相对强度可能由于 由比如晶体形态学的因素所导致的择优取向而产生变化。当择优取向的影响 存在时，峰强度会发生变化，但是多晶型物的特征峰位置并不发生变化。参 见，例如，The United States Pharmacopeia #_23，National Formulary #_18， 1843-1844页，1995。此外，在结晶学领域还已知，对于任何给定的晶型， 角度峰的位置可能轻微变化。例如，峰位置可以由于分析样品的温度的变化、 样品偏移或者存在或不存在内标而发生位移。在本发明情形中，由于这些可 能的变化，为了不阻碍本发明结晶盐的明确识别，将考虑±0.2°(2θ)的峰位 置可变性。

在文献中搜索晶体形式的众所周知和公认的方法为“Fink”方法。Fink方 法使用四条最强的线进行初始搜索，然后使用其次的四条最强的线进行搜索。

实施例8

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸甲醇溶 剂化物

将BCCA(4克)悬浮在4mL甲醇中，并且将其加热至回流。再加入大 约50mL甲醇以形成轻微的悬浮液。将混合物冷却至室温并且保持一天。通 过真空过滤分离固体产物，并且将其贮存入甲醇箱中以防止该亚稳定的晶体 形式受潮。

实施例9

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸乙醇溶 剂化物

将BCCA(3克)悬浮在10mL乙醇中数小时。通过真空过滤分离固体 产物，并且将其贮存入乙醇箱中以防止该亚稳定的晶体形式受潮。

实施例10

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸甲酸溶 剂化物

将BCCA溶解在7mL异丙醇中。向溶液中加入甲酸(3mL)。在室温 下，添加水至浊点(4mL)。将悬浮液加热至70℃，保持6小时，随后冷却 至室温。通过真空过滤分离固体产品，并且将其风干。XRD谱如实施例7 中所述进行收集。以下表2列出了由XRD谱获得的峰。

表2

实施例11

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸乙酸溶 剂化物

将反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基) 氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸(1.5 克)悬浮在10mL庚烷中。将悬浮液加热至50℃。加入1mL乙酸，悬浮 液变得澄清。再加入10ml庚烷并且冷却至室温。通过真空过滤分离固体产 品，并且将其风干。XRD谱如实施例7中所述进行收集。以下表3列出了由 XRD谱获得的峰。

表3

实施例12

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸钠盐

向500mL烧瓶中加入反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲 基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]- 环己烷羧酸水合物(20.16g)、乙醇SDA 3A(200.94mL)。使用磁力搅拌棒 进行搅拌，并且缓缓地加入1N氢氧化钠(31.95g)。这是一种澄清溶液。

喷雾干燥：使用喷雾干燥器(Niro SD Micro Spray Dryer)，使用干气流 速达32.5kg/hr，2.8bar，雾化气体流速达2.0kg/hr，0.3bar，且入口温度(自 动控制)115℃。一旦入口温度为115℃和出口温度稳定(109℃)，则开始 使83∶17(w/w)的乙醇∶水流动至喷雾器。在3.0的泵设置下，没有液滴撞 击室壁/出口。使系统达到热平衡-出口＝104℃。自乙醇∶水(室温下)切换 至在乙醇/水溶液中干燥样品。喷雾干燥之后，得到13.51g产品。

实施例13

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸镁盐

将反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基) 氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸钠盐 (2克)溶解在5mL甲醇中。将乙酸镁(335mg)溶解在20mL水中。在剧 烈搅拌的同时，在室温下滴加加入乙酸镁溶液，随后加热至65℃。产生沉淀。 升高温度，再加入10mL水。将悬浮液冷却至室温，通过真空过滤分离固体 产品并且用水冲洗。在真空烘箱中，在室温下干燥产物。

BCCA的钙和锌盐可以以类似于制备BCCA镁盐的方法制备。钾盐可以 以类似于制备BCCA钠盐的方法制备。

实施例14

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸叔丁胺 异丙醇(1∶1∶1)溶剂化物

组装装配机械搅拌器、温度控制器、加料漏斗和加热套的1L三颈圆底 烧瓶。将反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基) 氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸水合 物(50g)悬浮在庚烷(500mL)中。将浆液加热至69.1℃，加入在异丙 醇(70mL)中的叔丁胺(5.57g)溶液，并且另外用5mL异丙醇清洗。加入 之后立即形成溶液。在加入期间，温度降低至63℃，但是一旦加入完成之 后，立即将其加热回69℃。用一刮铲尖的反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基) 苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮 杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸叔丁胺进行种晶。悬浮液开始形成，继续在69℃ 下搅拌。开始将反应冷却至55℃。约一小时之后，形成浓稠的浆液。继续 冷却至45℃。约一小时之内，使浆液温度下降至35℃。约2小时之内， 除去热源并且使其冷却至环境温度。约3小时之内，过滤浆液(现在温度为 21℃)并且用100mL庚烷冲洗。真空干燥约1.5小时。在真空中，在33℃ 下干燥整个周末。由此得到55.9g产品。XRD谱如实施例7中所述进行收 集。以下表4列出了由XRD光谱获得的峰。

表4

实施例15

结晶形式的反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四 唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧 酸半叔丁胺盐半乙醇(2∶1∶1)溶剂化物

在机械悬挂式搅拌下，将反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2- 甲基-2H--四唑-5-基)氨基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲 基]-环己烷羧酸水合物(50.5g)悬浮在庚烷(404.00mL)中。加入乙醇(25.25 mL)并且加热至55℃，形成了溶液。在55℃下加入叔丁胺(2.81g)。加 入反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸半叔丁 胺半乙醇(2∶1∶1)溶剂化物晶种，并且持续引晶。保持温度在50℃。在 几分钟内形成相当稠的浆液并且放热升温至高达60℃。继续搅拌并且将其冷 却回50℃。约5.5小时之后，关掉加热并且使其冷却至环境温度。约3小 时之后，过滤并且用部分母液清洗烧瓶，然后用100mL庚烷冲洗滤饼。在真 空中，在45℃下干燥过夜。50.9g。XRD谱如实施例7中所述进行收集。 以下表5列出了由XRD谱获得的峰。

表5

实施例16

反式-4-[[(5S)-5-[[[3，5-双(三氟甲基)苯基]甲基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨 基]-2，3，4，5-四氢-7，9-二甲基-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基]-环己烷羧酸·水合物

方案3的步骤13：在室温下，将2M NaOH溶液(9.9L)加入到反式 -4-{[(5S)-5-{[3，5-双(三氟甲基)苄基](2-甲基-2H--四唑-5-基)氨基}-7，9-二甲基 -2，3，4，5-四氢-1H-1-苯并氮杂-1-基]甲基}环己烷羧酸甲酯(12.95kg)中，并 且将反应混合物搅拌10分钟。在40℃～45℃下，搅拌反应混合物6小时。 通过HPLC监控反应。向混合物中加入乙酸(3.75kg)，随后加入水(1.2体 积)，加入BCCA·水合物晶种，并且在40℃～45℃下搅拌2小时。向反应 混合物中加入水(2.8体积)，并且在40℃～45℃下搅拌2小时。将反应混 合物冷却至室温，搅拌2小时并且进行过滤。收集固体，用乙醇∶H₂O(1∶1； 2x2体积)洗涤并且在压滤器上干燥过夜。由此得到15.87kg用于步骤2中 的固体物质。

向步骤1的固体物质中加入甲醇并且在65℃～70℃下搅拌2小时，由 此获得澄清溶液。通过板式压滤器精细过滤至另一反应器中，在0℃～5℃ 下搅拌滤液2小时、过滤并且在压滤器上干燥过夜。将重结晶的固体在室温 下在水中(10体积)搅拌2小时、过滤并且在压滤器上进行干燥。在40℃～ 45℃于高真空下，在烘箱中干燥至通过Karl Fisher分析存在大约2.7～3.1％ 的水。由此获得11.80kg物质。

Karl Fisher分析＝3.16％

质谱通过ES-API进行，正模式下＝639.30；在负模式下637.20。

化学稳定性

以下表6列出了BCCA游离酸以及公开在WO 06/002342中的选定实施 例31、89、153和175(下面分别重新命名为化合物13、14、15和16)的化 学稳定性。以下数据表明，由于在酸性含水介质中表现出的增强稳定性显著 高于化合物13、14和16所显示的稳定性，BCCA游离酸提供了有利的性能。 BCCA游离酸的这种增强酸稳定性在WO 06/002342中没有提到，并且也无法 根据WO 06/002342预测。

表6

酸稳定性

÷残留％：各个化合物根据以下步骤在分离的试验中运行

*16小时之后的剩余％

样品制备：1)化合物原液：在ACN中0.9mg/mL；2)100μL原液+700μ L ACN+1mL介质(0.1N HCI，50mM PO₄，pH8，和0.3％ H₂O₂)；3)将 小瓶置于加热(40℃)的自动取样器中，以4小时间隔注入共16或者24小 时。

色谱法自动取样器条件

柱：Alltech Alltima Phenyl，3μm，4.6x150mm或者Waters XTerra MS C18， 3.5μm，4.6x150mm，柱温：50℃，注射体积：10μL。检测：UV 226、 254或者266nm(取决于化合物)，流速：1.5mL/min。流动相：在50％水/50％ ACN中0.1％ TFA(可能需要调节％ ACN以保持化合物峰的保留时间为～5 min)，最终的样品浓度0.05mg/mL；ACN含量44％。

对比测定CETP抑制剂化合物在雄性Sprague Dawley大鼠中的IV和PO 药物动力学

以下在交叉研究设计中，在单次1mg/kg静脉内推注或者3mg/kg口服给 药化合物至雄性Sprague Dawley大鼠(n＝4)确定药物动力学参数(包括口 服生物利用度)。静脉内载体为20％ solutol微乳剂/80％去离子水。口服载体 为聚乙烯吡咯烷酮USP 10％/SLS 0.5％/QS去离子水。在静脉注射组中，在给 药0.08、0.25、0.5、1、2、5、8、12和24小时后收集血样。在口服组中， 在给药0、0.25、0.5、1、2、5、8、12和24小时后收集血样。通过离心获得 血浆，置于冰上并且进行冷冻，直至在干冰上将样品运输到Bioanalytical  Systems，Inc.(BASi；West Lafayette，IN)上进行生物分析。BCCA的浓度 通过LC/MS/MS确定，药物动力学参数利用已验证的软件程序(Watson，7.1 版本)进行计算。可使用其他载体评价BCCA的生物利用度，包括：在纯化 水中1％w/v的羧甲基纤维素钠、0.25％w/v的聚山梨酸酯80(Tween 80)和 0.05％的Dow Corning Antifoam 1510-US；在纯化水中1％w/v的羧甲基纤维 素钠、0.5％w/v的月桂酸硫酸钠和0.05％的Dow Corning Antifoam 1510-US， 在纯化水中使用的各物质经或者未经超声处理以促进化合物的溶解。

以下表7中的数据表明，BCCA游离酸提供了比化合物15(WO 06/002342 中的实施例153)所显示的生物利用度高4倍的优点。该增强的生物利用度在 WO 06/002342中没有提到并且也无法根据WO 06/002342预测。

表7：药物动力学(PK)数据

÷3mg/kg PO(2ml/kg剂量体积)，1mg/kg IV(1mL/kg剂量体积)

评价

表明本发明化合物和/或方法的效用和效力的以下测定方案及其结果是 以例证的目的给出，并不意欲以任何方式进行限制。

体外CETP抑制剂测定：SPA 测定

体外闪烁亲近测定法(SPA)已经用于评价本发明化合物抑制放射性标 记的胆甾醇酯在HDL和LDL之间转移的能力。该测定监控对于CETP源造 成的[3H]胆甾醇酯自HDL(Amersham)向生物素化的LDL(Amersham)转 移的抑制作用。用于该测定的CETP源可以由已经形成以表达人类CETP的 AV-12细胞产生。放射性标记的胆甾醇酯在HEPES-NaCl基缓冲液中进行转 移，培养三十分钟之后停止反应，并且生物素化的LDL结合到链霉亲和素/ 闪烁体涂覆的SPA珠粒(Amersham)上。放射性信号在窗口设置完全打开 的Packard 96-孔闪烁计数器中测定。LDL的放射性信号相对于标准值的降低 表示化合物具有抑制CETP活性的能力。

或者是，在该测定中还可以使用其它CETP源介导放射性标记的胆甾醇 酯的转移。例如，来自人血浆的内源性CETP、表达人类CETP的小鼠CETP 和来自仓鼠的内源性CETP都可以在该测定中用作CETP源。

在HEPES-NaCl基缓冲液以外的缓冲液同样可以用于该测定中，例如， 可以使用人血浆、鼠血浆或者富含白蛋白的Tris-缓冲液。

本领域熟练技术人员应当理解，其他放射性源在该测定中同样可以用于 追踪CETP活性。

另外，在该测定中可以使用放射性标记的-LDL。

根据该测定的BCCA抑制放射性标记的胆甾醇酯在HDL和LDL之间转 移的能力列于以下表8中。

CETP活性的体内测定

表达内源性CETP的叙利亚金色仓鼠可以用于评价化合物的体内活性。 将在79.5％玉米油、20％油酸、0.5％Lubrafil载体中的测试化合物口服30mpk (mg/kg)剂量给药至表达人类CETP的转基因小鼠品种(雌性或者雄性CETP 和Apo Al杂合体小鼠Taconic，Germantown，NY)。在给药之后的不同时间， 从4h到48h，可以获得血液/血浆。CETP活性可以通过与如上所述的体外 CETP活性测定相似的方法进行确定，变化是在该测定中将受处置动物的血浆 用作CETP源。

根据该测定的BCCA体内活性列于以下表8中。

血浆脂质的体内测定

本发明化合物的体内活性可以通过以下方法进行评价：在含有CETP的 动物物种中，比较相对于对照样给定量的化合物导致的HDL胆固醇的升高水 平。测试化合物如以上CETP活性的体内测定所述进行给药。在给药之后的 不同时间，从4h到24h，获得血液。使血液凝块，并且通过离心从凝块血液 中获得血清。血清中HDL胆固醇水平可以利用临床化学分析仪 (Roche/Hitachi，Indianapolis，IN)使用HDL-C plus试剂(Roche/Hitachi， Indianapolis，IN)按已知方法确定。另外的血清脂质可以通过酶催化方法进 行分析。

VLDL、LDL和HDL级分中的脂质在沉淀或者筛析色谱法之后通过酶催 化方法进行分析。在给药无定形BCCA之后8小时，HDL胆固醇水平升高的 实例总结在以下表8中。

表8

÷79.5％玉米油，20％油酸，0.5％ Lubrafil，30mpk剂量，雌性或者雄性 CETP和Apo Al杂合体小鼠(Taconic)。

治疗方法

在本文中使用的术语“有效量”是指能够减轻多种归因于心血管疾病的 病理学状况的症状的本发明化合物的量，即无定形BCCA、BCCA·溶剂化物、 BCCA盐·溶剂化物和/或晶体形式的BCCA·水合物或者其组合。心血管疾病 的实例包括但不限于：冠心病、中风、关节硬化、血脂异常、低高密度脂蛋 白(HDL)、高胆固醇血症和末梢血管病。

根据本发明给药的化合物的具体剂量可以根据围绕该情形的具体情况来 确定，包括，例如但不限于：给药的化合物、给药途径、患者的健康状况和 由主治医师确定的待治疗的病理学状况。一般的日剂量将包含约10mg～约 750mg/天的本发明化合物。优选的日剂量一般为约30mg～约600mg/天， 更优选约50～约300mg/天。

本发明化合物可以通过多种途径给药。优选将本发明化合物配制成片剂、 固体或者凝胶填充的胶囊、粉剂、液剂或者混悬剂。

本发明的药物制剂可以通过本领域已知的工艺利用众所周知和可轻易获 得的成分制备。在本文中使用的术语“药学上可接受的”是指一种或者多种 与制剂的其他成分相容并且对其受者无害的载体、稀释剂、赋形剂和盐。药 物组合物和它们的制备方法在本领域是已知的，并且其实例可以参见 Remington，″The Science and Practice of Pharmacy″(A.Gennaro等人编辑， 第19版，Mack Publishing Co.)。适于所述制剂的药学上可接受的载体、赋 形剂和稀释剂的非限制性实例包括以下：淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生 物；粘合剂，比如羧甲基纤维素和其他纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙 烯-吡咯烷酮；增湿剂，比如甘油；崩解剂，比如碳酸钙和碳酸氢钠；延迟溶 解的试剂，比如石蜡；再吸收促进剂，比如季铵化合物；表面活性剂，比如 十六烷醇、单硬脂酸甘油酯；吸附载体，比如高岭土和皂土；和润滑剂，比 如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁，以及固体聚乙二醇。在一种形式中，药物制 剂包括甘露醇、月桂基硫酸钠、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、微晶 纤维素和硬脂酸镁，并且可以包括约2～约21％w/w的药物物质、BCCA、 BCCA游离酸、BCCA水合物或者结晶形式的BCCA水合物。

由此，本发明的另一方面为由本发明提供的化合物的药学上可接受的盐。 药用盐的实例可以参见S.M.Berge等人，″Pharmaceutical Salts″J.Phar.ScL. 66：1-19(1977)和″A Handbook of Pharmaceutical Salts Properties，Selection，and  Use″，Wermuth，C.G.和Stahl，P.H.(eds.)Verlag Helvtica Chimica Acta，2002， 其在此引入本文中。