一株灵芝多糖产量高的枯草芽孢杆菌菌株及用其制备的饲用微生物制剂及方法

摘要

本发明公开了一种灵芝多糖产量高的枯草芽孢杆菌菌株XD08B(Bacillussubtilis.XD08B；CCTCC M2011480)，该菌株的灵芝多糖产量高，可以大幅度提高发酵饲料产物中灵芝多糖的含量。本发明还公开了所述的枯草芽孢杆菌菌株XD08B(CCTCC M2011480)制备的饲用微生物制剂及其制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种枯草芽孢杆菌新菌株，尤其涉及一种灵芝多糖产量高的枯草芽孢杆菌菌株。本发明同时还涉及了使用该枯草芽孢杆菌新菌株制备的饲用微生物制剂及方法。 

背景技术

饲用微生物制剂，也可称为发酵饲料、微生物饲料添加剂、微生态活菌制剂、益生素，它是天然、无毒、无副作用、无耐药性、无环境污染的制剂，可以促进动物生长和增重、增强机体免疫机能、降低动物死亡率、提高饲料转化率和动物饲养效益。目前，微生物饲料添加剂已经应用在饲料和畜禽饲养中，在取代抗生素、减少化学合成药物在畜禽养殖中的用量方面正在发挥着越来越重要的作用，国家批准使用的微生物饲料添加剂的微生物种类有17种，包括枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌等益生菌。 

灵芝多糖具有能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA和蛋白质能力，延长寿命，灵芝多糖还具有刺激宿主非特异性抗性、免疫特异反应以及抑制移植肿瘤生理活性的特性。 

枯草芽孢杆菌属于好氧型微生物，进入消化道后能迅速发育、生长，产生很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等活性物质，对蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质的消化、吸收和利用发挥着重要的调控作用，还能产生维生素B和维生素K，通过降低消化道内氧化还原电位，以及产生少量抗菌物质，来对有害微生物起到抑制和杀灭作用，同时其孢子对热、压、酸、碱、酶及某些药物、X射线等不良环境具有很强的耐受性，在饲料加工、贮存及消化道中稳定性好，无需特殊保护性处理，就能存活很长时间，因而，广泛适用于畜禽及水产品的养殖中。但是，微生物的每个种下面还有很多变种、亚种、株系等，不同的变种、不同的株系，其功能作用存在着显著的差异，而正是这个原因，不同厂家生产的同一菌种的饲用微生物制剂，在畜禽动物的养殖实践中的使用效果差异十分明显。 

  

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B，其保藏号为CCTCC M 2011480，该菌株的灵芝多糖产量高，可以大幅度提高发酵饲料产物中灵芝多糖的含量。 

本发明的第二个目的涉及上述枯草芽孢杆菌菌株的应用。 

本发明的第三个目的提供一种用上述枯草芽孢杆菌菌株制备的饲用微生物制剂，该饲用微生物制剂中的灵芝多糖含量为10.00~30.00g/100g，可以提高养殖动物的风味指标及免疫功能。 

本发明的第四个目的提供一种用上述枯草芽孢杆菌菌株制备的饲用微生物制剂的方法。 

本发明的第一个目的提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B，它具有高产灵芝多糖的能力。该枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B已经于2011年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，并收到保藏登记号CCTCC M 2011480。 

本发明第二个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌菌株XD08B (CCTCC M 2011480)在制备的饲用微生物制剂中的应用。 

本发明第三个目的通过以下技术措施来实现：一种用上述枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)制备的饲用微生物制剂，其由以下方法制备而成： 

(1) 配制培养基：由以下重量百分比的原料配制培养基：

玉米10~50%、豆粕10~30%、麦麸0~30%、棉粕0~10%、菜粕0~10%、水30~60%；

(2) 发酵：取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液接种至所述的培养基中，然后在固体发酵罐中进行好氧发酵2~15天，即得该枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂。

所述的步骤(2)的好氧发酵应在控制发酵温度在60℃以内。 

本发明所述步骤(2)的发酵还可以采用厌氧发酵，具体操作为：枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液接种至所述步骤(1)的培养基中，然后直接装入呼吸膜发酵袋（以下简称发酵袋）中进行厌氧发酵3~90天，即得该枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂。 

本发明步骤(2)中的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按照常规的接种量接种至培养基中，就可以实现本发明的目的。但是作为本发明优选的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液的接种量在培养基总体积的1~5%范围内。 

本发明所述步骤(2)中枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液的制备方法：接种枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)至葡萄糖蛋白胨培养基中，培养18~36h，经染色镜检为革兰氏阳性杆菌即可。 

本发明第四个目的通过以下技术措施来实现：一种用上述枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)制备的饲用微生物制剂的方法，其包括以下步骤： 

(1) 配制培养基：由以下重量百分比的原料配制培养基：

玉米10~50%、豆粕10~30%、麦麸0~30%、棉粕0~10%、菜粕0~10%、水30~60%；

(2) 发酵：取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液接种至所述的培养基中，然后在固体发酵罐中在60℃以内的温度下进行好氧发酵2~15天，即得该枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂。

所述的步骤(2)的好氧发酵应在控制发酵温度在60℃以内。 

本发明所述步骤(2)的发酵还可以采用厌氧发酵，具体操作为：枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis strainXD08B (CCTCC M 2011480)菌液接种至所述步骤(1)的培养基中，然后直接装入呼吸膜发酵袋（以下简称发酵袋）中进行厌氧发酵3-90天，即得该枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂。 

本发明步骤(2)中的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按照常规的接种量接种至培养基中，就可以实现本发明的目的。但是作为本发明优选的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液的接种量在培养基总体积的1~5%范围内。 

本发明所述步骤(2)中枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液的制备方法：接种枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)至葡萄糖蛋白胨培养基中，培养18~36h，经染色镜检为革兰氏阳性杆菌即可。 

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1. 本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)是非致病性细菌，而且是一种益生菌，该菌株的灵芝多糖产量高，可以大幅度提高发酵饲料产物中灵芝多糖的含量，比普通的枯草芽孢杆菌菌株发酵制备的发酵饲料中的灵芝多糖含量提高25~200%。

2. 本发明采用枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)制备饲用微生物制剂，灵芝多糖含量在10.00~30.00g/100g范围内。将其应用于畜禽养殖中，可以大幅度提高养殖动物的风味指标及其免疫功能。 

本发明的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B已经于于2011年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，并收到保藏登记号CCTCC M 2011480。 

具体实施方式

实施例一：

从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买了4株芽孢杆菌（分别编号XD05B-XD08B），3株乳酸菌（分别编号XD05R-XD07R），1株酵母（编号XD05J），从广州百佳超市购买了2株酵母（分别编号XD06J-XD07J），再从自然界分离筛选了8株菌斑形态、菌体形态均有别于上述菌株的芽孢杆菌（分别编号XD09B-XD16B），合计共收集了12株芽孢杆菌（分别编号XD05B-XD16B），3株乳酸菌（分别编号XD05R-XD07R），3株酵母（分别编号XD05J-XD07J），然后采用各菌种的常规培养方法对它们分别经10代高灵芝多糖环境的诱变培养，挑选出菌斑大、活力强、适应高灵芝多糖环境的菌株，按常规的方法分别制成菌液，进行饲料发酵实验。

芽孢杆菌菌液的制备方法：接种上述芽孢杆菌菌种的新鲜培养物至葡萄糖蛋白胨培养基中，28℃培养18~36h。 

酵母菌液的制备方法：接种上述酵母菌种的新鲜培养物至马铃薯葡萄糖培养基中，28℃培养18~24h。 

乳酸菌菌液的制备方法：接种上述乳酸菌菌种的新鲜培养物至MSR培养基中，28℃培养24~48h。 

培养基配比为：玉米40%、豆粕15%、麦麸5%，水40%，菌液接种量为培养基体积的2%，起始pH值为7.2，充分混匀后装入发酵袋，每袋1kg，在28℃条件下密封进行厌氧发酵。从第2天开始到第18天，每天进行发酵产物的多糖含量测定，最终筛选出产多糖性能最强的菌株XD15B和XD08B，在进行多糖含量测定的同时对发酵产物所中多糖成分进行分析，最后确定了XD08B所产生的多糖中，灵芝多糖的含量，特别是三萜的含量最高，再将XD08B进行系统生理生化鉴定及序列分析，经Blast序列比对构建其系统进化树，确定其分类定位，结果：XD08B与已报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis  strain QD517）亲缘关系最近，二者的16S rDNA序列相似性为99%，生理生化反应谱与菌株QD517基本一致，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 

对枯草芽孢杆菌菌株XD08B和枯草芽孢杆菌菌株QD517分别进行发酵试验，并检测发酵产物中的灵芝多糖，结果如下： 

样品名称检测项目检测结果计量单位XD08B发酵组（样品1号）灵芝多糖17.6g/100gQD517发酵组（样品2号）灵芝多糖13.9g/100g

以下实施例二至十中，步骤(2)中枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液的制备方法：接种枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)至葡萄糖蛋白胨培养基中，培养18~36h，经染色镜检为革兰氏阳性杆菌即可。

实施例二：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸和水为原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米40%、豆粕15%、麦麸5%、水40%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的2%接种至培养基中，在固体发酵罐中好氧发酵7天，发酵温度在60℃以内，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为17.6g/100g。

实施例三：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米40%、豆粕15%、麦麸5%、水40%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌种株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的2%接种至培养基中，在固体发酵罐中好氧发酵5天，发酵温度在60℃以内，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为17.6g/100g。

实施例四：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米40%、豆粕15%、麦麸5%、水40%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的2%接种至培养基中，在发酵袋中厌氧发酵5天，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为17.6g/100g。

实施例五：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米33%、豆粕10%、麦麸5%、棉粕6%、菜粕6%、水40%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的5%接种至培养基中，在固体发酵罐中好氧发酵10天，发酵温度在60℃以内，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为25g/100g。

实施例六：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米34%、豆粕10%、麦麸6%、棉粕5%、菜粕5%、水40%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的5%接种至培养基中，在发酵袋中厌氧发酵10天，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为25g/100g。

实施例七：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米15%、豆粕20%、麦麸15%、棉粕8%、水42%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的3%接种至培养基中，在固体发酵罐中好氧发酵3天，发酵温度在60℃以内，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为15g/100g。

实施例八：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米15%、豆粕20%、麦麸15%、棉粕8%、水42%；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的3%接种至培养基中，在发酵袋中厌氧发酵3天，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为15g/100g。

实施例九：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米10%、豆粕20%、麦麸20%、棉粕10%、菜粕10%、水30% ；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的4%接种至培养基中，在固体发酵罐中好氧发酵15天，发酵温度在60℃以内，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为30g/100g。

实施例十：

(1) 配制培养基：以玉米、豆粕、麦麸、棉粕、菜粕和水为原料配制培养基，它们的重量百分比为：

玉米50%、豆粕20%、水30% ；

(2) 取枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌液按培养基总体积的4%接种至培养基中，在发酵袋中厌氧发酵90天，即得枯草芽孢杆菌制备的饲用微生物制剂，灵芝多糖含量为30g/100g。

试验例一：

将所筛选出来的Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌株制成的饲用微生物制剂进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验的方法是选择30公斤左右的普通瘦肉型中猪，将上述实施例四所制成的饲用微生物制剂直接投喂（即喂养100%的发酵饲料），经60~90天的喂养试验结果表明，所有生猪都很喜欢吃这种饲料，吃了这种饲料的生猪极少发病，粪尿臭味比喂养普通饲料的生猪减少九成以上，结果表明，这种生猪的肉质优美、甘甜。

试验例二：

将所筛选出来的Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌株制成的饲用微生物制剂进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右左右的普通瘦肉型中猪，将述实施例四所制成的饲用微生物制剂与普通中猪饲料按重量比3∶6混合，经60~90天的喂养试验结果，与上述100%用发酵饲料的差异不显著。

试验例三：

将所筛选出来的Bacillus subtilis XD08B (CCTCC M 2011480)菌株制成的饲用微生物制剂进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将述实施例二所制成的饲用微生物制剂直接投喂（即喂养100%的发酵饲料），经60-90天的喂养试验结果，与上述采用瘦肉猪养殖的差异不显著。

试验例四：

将所筛选出来的Bacillus subtilisXD08B菌株制成的饲用微生物制剂进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将述实施例二所制成的饲用微生物制剂与普通中猪饲料按重量比3∶6混合，经60-90天的喂养试验结果，与上述采用瘦肉猪养殖的差异不显著。

试验例五：

用实施例二的微生物制剂对试验猪进行直接喂养两个月，(从30公斤开始喂养至90公斤屠宰），与一号土猪和普通瘦肉型猪的肉质指标如下表所示（由华南农业大学分析测试中心测试并提供的数据，一号土猪和普通瘦肉猪的猪肉是屠宰当天从广州市五山市场购买的同一部位的，均是猪后背肌肉）：

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制，因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。