一种基体辅助激光解吸离子源质谱的在线样品制备装置

摘要

一种基体辅助激光解吸离子源质谱的在线样品制备装置，涉及一种面向质谱的样品制备装置。提供一种不仅简便、可靠，而且可充分发挥液相色谱-质谱联用分析效能的基体辅助激光解吸离子源质谱的在线样品制备装置。设有2级T型正交结构微流控芯片、基质试剂注射泵和靶板；第1级T型正交结构的微流控芯片竖臂的进口接液相色谱的水相淋洗液出口，左横臂接油相出口，右横臂为样品液滴出口；第2级T型正交结构的微流控芯片的竖臂进口接基质试剂注射泵出口；左横臂通过连接管与第1级T型正交结构的微流控芯片的样品液滴出口连接，右横臂为收集的液滴样品即目标液滴出口；所述靶板设于目标液滴出口下方。

说明书

技术领域

本发明涉及一种面向质谱的样品制备装置，尤其是涉及一种与液相色谱分离技术联用的 面向基体辅助激光解吸离子源质谱的在线样品制备装置。

背景技术

随着人类基因组测序计划的完成，蛋白质组学研究逐渐成为生命科学研究的重心。蛋白 质组学研究的难点在于其样品的高度复杂性，这也决定了蛋白质组学的研究强烈地依赖高分 辨的分离技术和以质谱为核心的鉴定技术。

基体辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术的出现使得质谱分析生物大分子成为 可能。电喷雾质谱采用直接引入液体样品的进样技术，可以与液相色谱等分离技术在线联用， 而基体辅助激光解吸离子源质谱由于其特殊的离子化技术多采用离线的方式对样品进行检 测。目前液相色谱与基体辅助激光解吸离子源质谱的联用主要有样品分段收集和在线点样等 方法。分段收集法是直接将液相分离后的样品分段收集，操作简便。然而，样品在分区段收 集的同时也造成了已分离样品的返混，损失了液相分离的分辨率。当使用流量较低的液相分 离技术如纳流液相色谱时，这种影响尤为显著。在线点样法是将分离后的样品和基质溶液同 轴引入点样针，然后由点样针在线自动点样。然而对于连续流体系，柱后样品区带的展宽以 及点样之间的交叉污染等问题普遍存在。如何将前端液相分离的样品进行可靠的转移和处理， 一直是液相分离与基体辅助激光解吸离子源质谱联用中的一项技术瓶颈。

中国专利CN101382527公开一种用于液相色谱与质谱联用的毛细管喷雾接口的制作装 置，包括“U”型支架，“U”型支架的两个顶端分别设置有同轴的横向滑槽，在滑槽内分别 放置有中空的调节螺杆，调节螺杆可于滑槽内沿水平方向横向滑动；调节螺杆里侧的内外表 面分别设置有内螺纹和外螺纹，并于其前端通过内螺纹螺合有PEEK头，PEEK头内穿设有 聚四氟管或PEEK管，于其外螺纹上设置有调距螺母；“U”型支架的内部设置有高温火焰灯； 其中聚四氟管或PEEK管内腔用于穿套石英毛细管。该装置制作工艺简单，使用材料低廉， 可以较方便的制作出理想的质谱喷雾接口，且成功率高，均匀性好。

发明内容

本发明旨在针对液相色谱分离与基体辅助激光解吸离子源质谱联用过程中，存在的样品 返混、区带展宽以及交叉污染等问题，提供一种不仅简便、可靠，而且可充分发挥液相色谱 -质谱联用分析效能的基体辅助激光解吸离子源质谱的在线样品制备装置。

本发明设有第1级T型正交结构微流控芯片、第2级T型正交结构微流控芯片、基质试 剂注射泵和靶板；

所述第1级T型正交结构微流控芯片用于将液相色谱分离后的样品制备成液滴，并将液 相色谱的水相淋洗液和另外一种不相溶的油相同时引入第1级T型正交结构的微流控芯片， 第1级T型正交结构的微流控芯片的竖臂的进口接液相色谱的水相淋洗液出口；第1级T型 正交结构的微流控芯片的左横臂接油相出口，第1级T型正交结构的微流控芯片的右横臂为 样品液滴出口；

所述第2级T型正交结构的微流控芯片用于将基质试剂引入单个液滴，第2级T型正交 结构的微流控芯片的竖臂进口接基质试剂注射泵出口；第2级T型正交结构的微流控芯片的 左横臂通过连接管与第1级T型正交结构的微流控芯片的样品液滴出口连接，第2级T型正 交结构的微流控芯片的右横臂为收集的液滴样品即目标液滴出口；所述靶板设于目标液滴出 口下方。

本发明采用两级“T”型正交结构微流控芯片在质谱前端在线地完成样品的制备。第1级 T型正交结构微流控芯片用于将液相色谱分离后的样品制备成液滴，并将液相色谱的水相淋 洗液和另外一种不相溶的油相同时引入“T”型正交结构的微流控芯片，在两相的界面处水相 淋洗液被油相“切割”形成液滴，从而使得液相色谱的连续流在柱后被转换成非连续流。经 液相色谱分离后样品以液滴的形式进行存储，在微纳尺度上对分析物进行分装和收集，最大 限度地保留了液相色谱的分辨率。与此同时，液滴与液滴之间被不相溶的油相所间隔，样品 的区带展宽现象可以得到有效的抑制，样品与样品之间的交叉污染问题也得以避免。

第2级T型正交结构微流控芯片用于将基质试剂顺次引入单个液滴。使用精密注射泵将 基质溶液引入第2级T型正交结构微流控芯片，基质试剂顺次与单个液滴混合，通过流量的 调节控制混入液滴的基质的用量，完成对第1级T型正交结构微流控芯片所制备的液滴的批 量处理。混入基质的液滴样品单元在点靶板后干燥，基质与样品形成共结晶，最后使用基体 辅助激光解吸离子源质谱对经过处理的样品进行分析检测。

本发明可通过以下步骤实现：

1)微流控芯片的制备

首先使用模塑法来制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片。使用AutoCAD绘图软件 绘制出芯片的结构并制成相应的掩模，通过光刻技术将掩模上的微结构转移到SU-8光刻胶上 制备成SU-8阳模作为芯片母版。将PDMS前聚体和固化试剂充分混合并浇注于SU-8阳模上， 在一定温度下固化即得到带有微孔道结构的芯片基片，最后与基底封接完成芯片的制备。

2)液滴的制备

所需分离分析的样品首先经液相色谱分离，将液相色谱的淋洗液直接引入正交结构的微 流控芯片，与此同时通过精密注射泵将另外一种不相溶的油相引入芯片，两相在界面处形成 水油相互间隔的液滴，经液相色谱分离的样品以液滴的形式进行存储。

3)基质试剂的引入

将第一级正交结构芯片制备的液滴通过连接管引入第二级正交结构芯片，与此同时通过 精密注射泵将基质溶液引入该芯片，液滴顺次与基质溶液混合，将混合后的液滴样品单元进 行收集。

4)样品的结晶

将收集的液滴样品点在MALDI靶板上，提高温度使试剂挥发，基质与样品形成共结晶， 处理完的样品即可直接进行质谱检测。

本发明基于液滴微体积、低扩散、无返混等独特的优势，经液相色谱分离后的样品以液 滴的形式进行存储，最大限度地保留了液相色谱的分辨率，与此同时样品的区带展宽以及样 品与样品之间的交叉污染等问题也得以有效地解决。此外，在样品单元中在线地加入基质溶 液可以大大简化样品制备过程。这种在线的样品处理装置在液相色谱与基体辅助激光解吸离 子源质谱联用，以及复杂体系分离分析，如蛋白质组学研究中，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的结构组成示意图。

图2为色谱分离谱图。在图2中，横坐标为时间Time(sec)，纵坐标为强度Abs(AU)。

图3为质谱检测结果图。在图3中，横坐标为质/荷比m/z，纵坐标为质谱响应值；从上 至下分别为样品编号25th，22nd，18th，12th，7th。

图4为经过液相色谱分离收集的所有液滴的质谱图。在图4中，横坐标为质/荷比m/z， 纵坐标为液滴数量droplet number。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

参见图1，本发明实施例设有第1级T型正交结构微流控芯片、第2级T型正交结构微 流控芯片、基质试剂注射泵和靶板3。

所述第1级T型正交结构微流控芯片用于将液相色谱分离后的样品制备成液滴，并将液 相色谱的水相淋洗液A和另外一种不相溶的油相B同时引入第1级T型正交结构的微流控芯 片，第1级T型正交结构的微流控芯片的竖臂11的进口接液相色谱的水相淋洗液出口；第1 级T型正交结构的微流控芯片的左横臂121接油相出口，第1级T型正交结构的微流控芯片 的右横臂122为样品液滴C出口。

所述第2级T型正交结构的微流控芯片用于将基质试剂D引入单个液滴，第2级T型正 交结构的微流控芯片的竖臂21进口接基质试剂注射泵出口；第2级T型正交结构的微流控芯 片的左横臂221通过连接管与第1级T型正交结构的微流控芯片的样品液滴出口连接，第2 级T型正交结构的微流控芯片的右横臂222为收集的液滴样品即目标液滴出口；所述靶板3 设于目标液滴出口下方。

以下给出具体实施例。

1、微流控芯片的制备

使用AutoCAD绘图软件绘制出芯片的结构，其中“T”型正交结构芯片水平孔道宽度为 300μm，竖直孔道宽度为200μm。然后将绘制好的芯片图形制成相应的掩模，通过光刻技术 将掩模上的微结构转移到SU-8光刻胶上制备成SU-8阳模作为芯片母版。将质量比为10∶1 的PDMS前聚体和固化试剂充分混合并浇注于SU-8阳模上，然后置于真空干燥器内抽负压 排尽混合液中的气泡，在65℃下固化一小时即得到带有微孔道结构的芯片基片，将固化后的 聚合物材料从阳模上剥离，在适宜位置打孔用于与外管路连接，最后与基底封接完成芯片的 制备。

2、样品的分离与液滴的制备

以浓度为1000ppm的核糖核酸酶A(Ribonuclease A)、细胞色素C(Cytochrome C)、牛 血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(Lysozyme)、肌红蛋白(Myoglobin)五种蛋白的混合物为样品 对系统进行评价。使用纳流液相色谱对混合物进行分离，色谱分离条件：进样量为10nL，流 速为500nL/min，流动相A为H₂O+0.1％TFA，流动相B为ACN+0.1％TFA，梯度洗脱程序 为流动相B 20％～60％10min，所用色谱柱为内径100μm，外径为375μm的毛细管柱，色谱 固定相为PLRP-S 10μm，填充长度为12cm，检测波长为紫外214nm。色谱分离谱图如图2 所示。将液相色谱的淋洗液直接引入正交的微流控芯片，与此同时使用精密注射泵将油相 (FC-40)引入芯片，油相的流速为1.5μL/min，两相在交界处形成水油相互间隔的液滴，每 一个液滴的大小约为50nL，经液相色谱分离后的样品以液滴的形式进行存储。

3、基质试剂的引入

将第一级正交结构芯片制备的液滴通过连接管引入第二级正交结构芯片，与此同时通过 精密注射泵将基质溶液引入芯片，基质溶液的流速为1.0μL/min，约有100nL的基质溶液与 液滴混合最终形成体积约为150nL的样品单元，使用连接管将与基质溶液混合后的液滴样品 单元进行收集。

4、样品的结晶

将收集的液滴样品单元依次点在MALDI靶板上，提高一定的温度使试剂挥发，基质与 样品形成共结晶。

5、质谱检测

将处理好的MALDI靶板放入质谱进样室，使用基体辅助激光解吸离子源质谱对样品进 行检测。质谱检测结果如图3和图4所示。

由质谱检测结果图(图3)可见，5种蛋白质均被检出。图4为经过液相色谱分离收集的 所有液滴的质谱图，从图4中可以看出，每一个色谱峰都被切分成多个液滴单元最终进入质 谱检测，这充分保留了液相色谱的分辨率，利于充分发挥液相色谱质谱的分离分析效能。质 谱检测结果与色谱图也有较好的对应性，交叉污染等问题也得到有效抑制。