一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法

摘要

一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法，涉及转基因大米。试剂盒包括环介导等温扩增反应液A、环介导等温扩增反应液B、Bst DNA聚合酶C和显色剂D。提取模板DNA；环介导等温扩增；显色检测。利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速扩增DNA，在1h内能达到10

说明书

技术领域

本发明涉及转基因大米，尤其是涉及一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

Bt63转基因大米是含有抗虫基因的大米，能够抵抗病害，增加稻产量，但用这种大米制 成的儿童食品可能影响婴儿健康。2008年4月15日起，欧盟要求所有从中国进口的米制品接受 欧盟认可实验室的检验，并附上确定未含“Bt63”的卫生证书(http://eur-lex.europa.eu/Lex  UriServ/LexUriServ.do？uri＝OJ：L：2008：096：0029：0034：EN：PDF)。以往检测Bt63转基因大米主要 有普通PCR法和荧光定量PCR法(徐颖.转基因大米的安全性与核酸检测技术的进展.安徽农业 科学，2009，37(33)：16240-16242；吴孝槐，路勇.利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米 [J]现代食品科技，2009(25)：211-216.)，普通PCR法需要相对昂贵的PCR仪及凝胶成像系 统，荧光定量PCR法则需要昂贵的荧光定量PCR仪，基层检测机构以及广大食品加工企业很 难普及该检测方法。目前尚未见到用环介导等温扩增扩增技术检测Bt63转基因大米的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种转基因大米Bt63检测试剂盒。

本发明的第二目的在于提供一种转基因大米Bt63的检测方法。

所述转基因大米Bt63检测试剂盒包括：

1)环介导等温扩增反应液A

所述环介导等温扩增反应液A含有10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液、300μM dNTP、2mM 硫酸镁和转基因大米引物1；所述转基因大米引物1包括0.8μM上游内引物FIP-1、0.8μM 下游内引物BIP-1、0.2μM上游外引物F3-1和0.2μM下游外引物B3-1；

其中，

上游外引物F3-1：GTTACTTTGAAAGTGCCAATG

下游外引物B3-1：GAAACTTTATTGCCAAATGTTTG

上游内引物FIP-1：ACTCCAGCAGTCCCACTAAAGCTTTTACATCTTCACTCGGTAA

下游内引物BIP-1：ATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGAACGATCGGGGAAATTCG

2)环介导等温扩增反应液B

所述环介导等温扩增反应液B含有10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液、300μM dNTP、2mM 硫酸镁和大米内源基因引物2；所述大米内源基因引物2包括0.8μM上游内引物FIP-2、0.8μM 下游内引物BIP-2、0.2μM上游外引物F3-2和0.2μM下游外引物B3-2；

其中，

上游外引物F3-2：GGAAAGCCGATGGCATCAG

下游外引物B3-2：TCTCCATTGTCCTCCTCTGC

上游内引物FIP-2：GCAAAACGCTCACCAGCTTCAAGACATTGAGGCGTTGCATCT

下游内引物BIP-2：ATGTTGTGCTGCCAATGTGGCCCAGTATTGCCTGCACTGAT

其中10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、20mM硫酸镁(MgSO₄) 和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；

3)Bst DNA聚合酶C：含8个活性单位/μL；

4)显色剂D：10％SYBR GREEN I荧光染料(SYBR GREEN I荧光染料是一种DNA荧光 染料，国内商品名为SYBR GREEN I，该称谓也可见中国专利200710026390.X)；

在装有环介导等温扩增反应液A的反应管加入转基因大米引物1的上游外引物F3-1和下 游外引物B3-1各0.2μmol/L，加入转基因大米引物1的上游内引物FIP-1和下游内引物BIP-1 各至0.8μmol/L；在装有环介导等温扩增反应液B的反应管加入大米内源基因引物2的上游外 引物F3-2和下游外引物B3-2至0.2μmol/L，加入大米内源基因引物2的上游内引物FIP-2和 下游内引物BIP-2至0.8μmol/L。

所述转基因大米Bt63的检测方法包括以下步骤：

1)提取模板DNA；

在步骤1)中，所述提取模板DNA的方法可按常规方法或商品化的大米DNA提取试剂 盒提取大米DNA；

2)环介导等温扩增：

a.在装有23μL LAMP反应液A的反应管A中加入1μL待检模板DNA，同时在装有23μL LAMP反应液B的反应管B中加入1μL待检模板DNA，95℃恒温水浴5min，立即置于冰上 1min；

b.分别在反应管A和反应管B中各加入1μL Bst DNA聚合酶；

c.60～65℃恒温水浴1h；

d.80℃恒温3min，中止反应；

3)显色检测：

在反应管B中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样 品DNA提取失败，整个实验必需重做；如颜色为绿色，说明样品DNA提取成功，进行下一 步实验。

在验证了样品DNA提取成功的前提下，在反应管A中加入1μL显色剂C，直接用肉眼 观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品为非转基因大米；如颜色为绿色，则可判定样品 为转基因大米。

本发明的优点：

本发明依据欧盟联合研究中心(JRC)确认的CRL方法的检测原理，采用环介导等温扩增 技术建立了Bt63转基因大米的环介导等温扩增检测试剂盒和检测方法，此技术特异性强，与 PCR方法有相同的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只需普通的水浴锅 即可，且结果不必用凝胶电泳方法来检验，加入荧光染料目测观察即可，简单快速，特别适 合于基层食品检测机构和食品加工企业自检。

本发明利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特 异、高效、快速扩增DNA，在1h内能达到10⁹靶序列拷贝。可通过荧光染料来观察扩增效果。

本发明提供了一种快速、特异性强、成本低的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal  amplification，LAMP)方法用于检测Bt63转基因大米，可以替代欧盟联合研究中心(JRC)确 认的CRL方法，为食品安全监控提供新的科学依据。

具体实施方式

下列实施例是进一步对本发明的说明，不应当作对本发明的限制。

1、按下列配方制作Bt63转基因大米的环介导等温扩增检测试剂盒：

(1)环介导等温扩增反应液A：

含有10×Thermopol反应缓冲液、10mM dNTP、100mM硫酸镁、0.8μM转基因大米上游 内引物、0.8μM转基因大米下游内引物、0.2μM转基因大米上游外引物、0.2μM转基因大米 下游外引物；

(2)环介导等温扩增反应液B：

含有10×Thermopol反应缓冲液、10mM dNTP、100mM硫酸镁、0.8μM大米内源基因上 游内引物、0.8μM大米内源基因下游内引物、0.2μM大米内源基因上游外引物、0.2μM大米 内源基因下游外引物；

(3)BstDNA聚合酶C：浓度8U/ML；

(4)显色剂D：10％SYBR GREEN I荧光染料。

2、按以下程序检测：

使用上述环介导等温扩增试剂盒检测Bt63转基因大米，包含下列步骤：

(1)模板DNA的提取：按常规方法(SN/T 2584-2010)提取大米DNA：

每个样品提取2个平行管。称取200mg粉碎的样品，加入1mL预冷至4℃的抽提液，剧 烈摇动混匀后，在冰上静置5min，4℃条件下10000g离心15min，弃上清液；加入600μL预 热到65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在65℃恒温保持40min，期间颠倒混匀5次；室温条 件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中，加入5μL RNase A，37℃ 恒温保持30min。分别用1)苯酚、2)异戊醇溶液和三氯甲炕、3)异戊醇溶液各抽提 一次，所述1)苯酚、2)异戊醇溶液和三氯甲炕、3)异戊醇溶液等体积，在室温条件 下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中；加入三分之二体积异丙醇，十分 之一体积3mol/L乙酸钠溶液(pH5.6)，-20℃放置2～3h；在4℃条件下，10000g离心15min， 弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；加入50μL TE(pH8.0)溶解 沉淀，所得溶液即为样品DNA溶液。

注：也可使用等效的其他商品化DNA提取试剂盒。

(2)环介导等温扩增：

a.在装有23μL LAMP反应液A的反应管A中加入1μL待检模板DNA，同时在装有23μL LAMP反应液B的反应管B中加入1μL待检模板DNA，95℃恒温水浴5min，立即置于冰上 1min；

b.分别在反应管A和反应管B中各加入1μL Bst DNA聚合酶；

c.60～65℃恒温水浴1h；

d.80℃恒温3min，中止反应。

(3)显色检测：

在反应管B中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样 品DNA提取失败，整个实验必需重做；如颜色为绿色，说明样品DNA提取成功，进行下一 步实验。

在验证了样品DNA提取成功的前提下，在反应管A中加入1μL显色剂C，直接用肉眼 观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明样品为非转基因大米；如颜色为绿色，则可判定样品 为转基因大米。