一种用脂质体技术筛选乳杆菌冻干用保护剂的方法

摘要

本发明公开了一种简单快速筛选乳杆菌冷冻干燥保护剂的方法。首先制备β-半乳糖苷酶脂质体，以大豆卵磷脂、十八胺为制备材料，摩尔比为10∶1，共144μmol，溶于15ml乙醚中，包封5mlβ-半乳糖苷酶酶液，其蛋白质浓度为1.286mg/ml，酶的比活力为1970U/mg蛋白质。酶脂质体特征为：脂质体平均粒径：110nm～150nm，分散性指数(PdI)：0.265～0.390，Zeta电位：-37.1～-42.0mV。然后添加不同冷冻干燥保护剂，对制备的脂质体悬液进行冷冻干燥，液面高度0.5-1cm，在-25℃以下预冻12小时；在温度-50～-40℃，真空度40-80Pa下真空冷冻干燥12小时。最后将冻干脂质体复水，测定其酶蛋白包封率的变化。使包封率降低最小的保护剂效果最佳。采用本发明的方法筛选出的保护剂，能有效提高乳杆菌在冻干过程中的存活率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂质体制备和微生物领域。

背景技术

冷冻干燥是将欲保藏的微生物细胞在真空条件和冻结状态使冰升华，最后达到干燥。其 步骤分3步进行，首先是预冻过程，预冻的速度与温度根据微生物的种类而定。其次是升华 过程，将预冻好的微生物置于高真空度的环境中，冰晶吸热而直接变成水蒸气从微生物体内 溢出。升华过程是由内向外逐渐推移的，冰晶升华后在微生物体内留下许多微孔隙。再次是 解析过程，这一过程使残留在微生物体内的结合态水解析出来，进一步降低微生物体内水分 的含量。

乳酸菌是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。大量 研究表明乳酸菌是一类对人体健康有利的益生菌。乳酸菌产品逐渐受到人们的重视，于二十 世纪七十年代初期开始研制真空冷冻干燥发酵剂。冷冻干燥过程会造成乳酸菌的细胞膜通透 性改变、蛋白质变性失活、pH值的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等。 会使部分细胞损伤，甚至死亡。

β-半乳糖苷酶是乳酸菌发挥其益生菌功能的重要酶类，它能消化乳糖，使患有乳糖不耐 症的人群能够充分吸收它。有关研究乳酸菌的冷冻损伤发现：正常菌体上清液、菌体悬浮液 中相对β-半乳糖苷酶活力分别为0、32.9％，冻藏菌体为0.28％、48.9％，而冻干菌体则为 0.95％、60.8％，这表明细胞膜的通透性增加，使β-半乳糖苷酶从细胞内泄漏出来。此为冻 干带来的细胞膜损伤。通常细胞膜中磷脂的极性端在一定程度上是以水合形式存在的，而且 每个磷脂的极性端与其它磷脂分子的极性端被水分子隔开。当磷脂干燥脱水时，极性端的密 度增加，糖链间的范德华引力增强，平时处于液晶态的脂膜变成凝胶态，相的变化使复水时 细胞膜的通透性增加，胞内一些可溶性物质发生渗漏，从而导致细胞死亡。微生物细胞的干 燥损伤很大程度是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，从而导致膜的功 能失调，影响微生物的生命活动。

脂质体具有类似生物膜的双分子层结构囊泡。天然磷脂化合物依靠疏水相互作用构成生 物膜的基质。当前常用的模拟膜体系有Langmuir膜，平面双层脂膜和脂质体。脂质体可以分 为单层小泡囊(SUV).单层大泡囊(LU.V)和多层大泡囊(MUV)，都是包结着水室的封闭双层结 构，是最接近于细胞的模型。脂质体适合用于膜渗透的测量。

脂质体可长时间吸附于靶细胞周围，使药物充分被靶细胞、靶组织吸收。将药物做成脂 质体后，具有靶向性、缓释性、组织相容性与细胞亲和性、降低药物毒性、提高药物稳定性 等特点。脂质体作为新型的药物剂型可以达到提高药品安全性、有效性、稳定性和患者顺应 性，降低药品不良反应的目的，所以日益受到国内外医药界的广泛重视。

本发明结合脂质体技术筛选乳酸菌冻干保护剂。目前为止发现的乳酸菌的冻干保护剂有 数十种。如甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、透明质酸等。筛选保护剂的方法主要是采用传统 的菌体培养法，比较冻干前后活菌数、酶活力等指标的变化，耗时长，操作要求高。本发明 以脂质体模拟瑞士乳杆菌9的细胞膜，并在脂质体中包封β-半乳糖苷酶，观察冷冻干燥对脂 质体包封酶量及瑞士乳杆菌9胞内酶变化之间的关系，证实脂质体技术可以用于快速筛选冻 干保护剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种简单快速筛选乳杆菌冷冻干燥保护剂的方法。

利用脂质体技术筛选保护剂的主要实验步骤

(1)β-半乳糖苷酶脂质体的制备

①称取大豆卵磷脂和十八胺按摩尔比10∶1，共144μmol，溶于15ml乙醚中。

②吸取5ml β-半乳糖苷酶酶液，其蛋白质浓度为1.286mg/ml，酶的比活力为1970U/mg蛋白 质。加入①中混匀。水浴超声3min，每处理30s，间歇30s，使之成为油包水型，即W/O型 乳液。

③旋转蒸发，除去有机溶剂

④加入外水相。加入磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.0)30ml，继续旋转直至白色悬液形成

⑤超声破碎仪匀化粒径。超声功率为80％，超声时间为5min×2，至形成透亮的溶液。 所制备的脂质体平均粒径：脂质体平均粒径：110nm～150nm，分散性指数(PdI)：0.265～0.390， Zeta电位：-37.1～-42.0mV。

(2)脂质体与游离β-半乳糖苷酶的分离以及测定脂质体包封率

采用葡聚糖凝胶柱色谱法分离混悬液中的脂质体和乳糖酶。取原酶液1ml，空白脂质体1ml， 在柱长为1m的G-200凝胶柱上样，以磷酸钠缓冲液为洗脱液，调节洗脱液流速为0.4ml/min， 流出液每2ml为1份。在紫外-可见分光光度计420nm处测量溶液的吸收度。

然后，考马斯亮蓝法测定脂质体悬液中酶蛋白含量。

(3)添加不同冷冻干燥保护剂后对脂质体进行冷冻干燥

制备的脂质体悬液，液面高度0.5-1cm，在-25℃以下预冻12小时；在温度-50-40℃，真空度 40-80Pa下真空冷冻干燥12小时

(4)冻干脂质体复水与游离β-半乳糖苷酶分离以及测定脂质体包封率

(5)拟冻干目标乳杆菌菌株培养及测定胞内乳糖酶酶活力保存率

(6)添加利用脂质体技术筛选出的冷冻干燥保护剂后对目标乳杆菌菌株进行冷冻干燥

(7)冻干乳杆菌菌株菌粉复水及测定胞内乳糖酶酶活力保存率

具体实施方式

实施例1

(1)参照步骤1制备β-半乳糖苷酶脂质体。

(2)加入不同保护剂

将60ml酶脂质体分成五份，分装至试管中，每管10ml，标号为①②③④⑤。

①号试管，放于冰箱冷藏；

②号试管，加入海藻糖。配制100mg/100ml。即0.1000g，溶于100ml水中。然后取2.5ml至 10ml脂质体溶液中。(最后得到海藻糖浓度约为20mg/100ml)

③号试管，加入透明质酸。可以先配制2mg/100ml透明质酸溶液(称0.0020g透明质酸溶于 100ml水中)，然后取2.5ml至10ml脂质体溶液中。(最后得到透明质酸浓度为0.4mg/100ml)

④号试管，加入海藻糖和透明质酸互配保护剂，10mg/100ml和0.2mg/100ml。取100mg/100ml 海藻糖溶液1.286ml，取2mg/100ml透明质酸溶液1.429ml。

⑤号试管，不加保护剂。

(3)②③④⑤样品冷冻干燥

从②③④⑤号试管中各取1.3ml至于西林瓶中，三个平行。于真空冷冻干燥机中冻干。

(4)复溶

取1.3ml磷酸钠缓冲液于西林瓶中，溶解冻干脂质体。

(5)脂质体纯化，未包封的蛋白质浓度测定

脂质体悬浮液1ml过Sephadex-G200凝胶柱，收集未包封的酶液。

(6)测量悬液中蛋白质浓度

采用考马斯亮蓝法，取1ml样品于比色管中，加入5mlG-250染色液，充分混匀，静置然后在595nm处测定其吸光度。

包封率的计算：

(7)MRS培养基培养瑞士乳杆菌9

(8)离心收集菌体。取120ml菌悬液至4个离心管中，标号①②③④，5000r/min，离心10min。 上清液备用待测，并收集菌体

(9)湿菌体中加入缓冲液4ml，然后加入保护剂：

①号试管：不加保护剂进行冻干。

②号试管：加入海藻糖。配制100mg/100ml。即0.1000g，溶于100ml水中。然后取1.0ml至 4ml脂质体溶液中。(最后得到海藻糖浓度约为20mg/100ml)

③号试管：加入透明质酸。可以先配制2mg/100ml透明质酸溶液(称0.0020g透明质酸溶于 100ml水中)，然后取1.0ml至4ml脂质体溶液中。(最后得到透明质酸浓度为0.4mg/100ml)

④号试管：加入海藻糖和透明质酸互配保护剂，10mg/100ml和0.2mg/100ml。取100mg/100ml 海藻糖溶液0.515ml，取2mg/100ml透明质酸溶液0.570ml。

(10)冷冻干燥

(11)复溶：冻干菌体用30ml缓冲液复溶

(12)离心收集菌体，用二甲苯丙酮处理菌体。离心所得菌体加入30ml缓冲液，加入二甲苯 丙酮处理，加入二甲苯丙酮1.5ml，按比例V二甲苯∶V丙酮＝1∶9，(甲苯0.15ml，丙酮1.35ml)， 25℃水浴5min，剧烈搅拌7min。

(13)吸光光度法测定悬浮液中β-半乳糖苷酶酶活力。

酶活力保存率＝冻干前菌体处理液中酶活力/冻干后菌体处理液中酶活力。