NCSTN突变型基因、其鉴定方法和工具

摘要

本发明涉及突变的NCSTN基因，其突变位点为NCSTN基因第11个内含子IVS11+1位置上的核苷酸，由鸟苷酸突变为腺苷酸；和/或其在NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸A和G的缺失等。本发明对探索AI及新的治疗途径有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及单基因的突变基因，以及该基因的鉴定方法和试剂盒。

背景技术

逆向性痤疮(Inversa acne，AI)又名化脓性汗腺炎，是一种少见的 常染色体显性遗传病，该病属于单基因遗传疾病。以反复发生皮肤脓肿、 窦道及瘢痕形成为特征性表现。本病多发生于女性，是大汗腺导管闭塞 继发细菌感染所致，通常好发于腋窝、腹股沟及臀部等大汗腺分布部位， 初起为坚实的疼痛性炎性结节，以后可出现波动感、脓肿破裂、流脓和 形成窦道。实验室检查往往发现贫血、血沉加快，血清类风湿因子阴性。 AI常伴发聚合性痤疮和脓肿性穿凿性头部毛囊周围炎，统称为毛囊闭锁 三联征；除皮损外，AI还可伴发关节炎或者继发鳞状上皮细胞癌(Thein  M，Hogarth MB，Acland K.Seronegative arthritis associated with  the follicular occlusion triad.Clin Exp Dermatol.2004  Sep；29(5)：550-2；Dufresne RG Jr，Ratz JL，Bergfeld WF，et al. Squamous cell carcinoma arising from the follicular occlusion  triad.J Am Acad Dermatol.1996 Sep；35(3 Pt 1)：475-7.)，不仅 对患者的健康和美观均有极大影响，而且可造成患者严重的身心负担。 本病可表现为常染色体显性遗传，亦可为散发。有家族遗传史者通常发 病较早，一般在11-12岁开始发病，而散发者多数在20岁后发病。

目前该病的研究主要限于病例报道，其分子学发病机制仍然不明。 2006年，高敏等(Gao M，Wang PG，Cui Y，et al，Inversa acne (hidradenitis suppurativa)：a case report and identification of  the locus at chromosome 1p21.1-1q25.3.J Invest Dermatol 2006， 126(6)：1302-1306.)研究者在一个中国汉族人四代家系中将该病的致 病基因定位于1p21.1-1q25.3区域，该连锁区域范围较大，包含大约900 余个基因，包括已知基因、未知基因和预测基因，而继续寻找大的家系 进行精细定位将是一个耗时费力的过程。由于寻找该病致病基因不仅对 发现易感人群和基因诊断有重要价值，而且对探索其发病机制和开辟新 的治疗途径也有意义，因此亟待寻找一种新的方法以发现该病的致病基 因。

最近，外显子组测序(exome sequencing)被成功地应用于发现稀 有单基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon综合症的MYH3基因， Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62 突变等(Ng SB，Turner EH，Robertson PD，et al，Targeted capture and  massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature 2009， 461(7261)：272-276；A H，BW vB，C G，et al，De novo mutations of SETBP1  cause Schinzel-Giedion syndrome.D-9216904(-1546-1718 (Electronic))；Bilguvar K，Ozturk AK，Louvi A，et al，Whole-exome  sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain  malformations.Nature 2010，467(7312)：207-210.)。该方法已被证明为 降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段。

发明内容

为了寻找逆向性痤疮的相关基因，发明人将外显子组测序与生物 信息学方法相结合，最终找到了逆向性痤疮的相关基因，由此完成了 本发明。

本发明的一个方面涉及分离的逆向性痤疮相关基因NCSTN的突变 型序列，其在NCSTN基因第11个内含子的第1位核苷酸，由鸟苷酸突 变为腺苷酸(IVS11+1G＞A)；和/或其在NCSTN基因第3号外显子第19 位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸A和G的缺失。

在本发明的一个实施方案中，发明人检测了两个AI家系，发现 AI患者中NCSTN基因的第11个内含子序列如下所示： taagaatcacttggccctgcaccctcttcattcttgaagagagtctattctgcagtctgggaggaaggtcactgc cctccgctttcccacactaccccctccagaacttcaggtccatctgtattctttgctcagtggcgttttcacatct gaactgaaacccttatttgtttgactggatattcatcttagaaactcatcctcacccttagccctttactgtcaac aatccttggttatggttccactgctccctagctctccagggtcctgagttcctcagggttgccagcagagggcatc atctcaaacacaagcatgggaaggatggtgggggccctttggctagaagacagaaagcagtccttctctggaactc acccagaggtgccagaaacagtattcatactctgtgaaatgtaccatgttcttgccatgtggtagatggccatggt tcagtgcgagggtaaaagtgcctcctatagctgatggggctccagagatacaaagggtaactctgggttacccttt aactgctcctaacttgaggccttggataacaggggacttcttactcaggctggattgccaagcttcccgagggcca aatgagtttcgtagtgaaaatgcttgagctctatttctgaccccagccaagtagcaccttctcattcatttagggg agtgaccgtcctagcacttagggtcagctgtcttctctaaagctatccttgtaccactttggggcaagtgaagatt catcatttgaacacattttggatttgattatgtagctgacttgactttgtgtgggacagggatttactgatggtaa agactgtggagctcagcctctcttttaagatctatctccttggggctccataaggatcatcatggtgattttatca gtgtattcttatatatcagtgagcagacctgatcctaagacctgctaatcacctcctgctcccagctaccctaaat ataaatgttcattggaacagttatacaactgatctcatgatacatggcagagttctctgaaaatcatcttagccat cccccatatctccagcccaaatgatgtagaagagtctctcctttgtttaaagatctgagctcattcagcttttcta ccttgtctgtcaggaaagtctttaattttcactaaccacctcaccctcactcctacctccctgttctccacacctt ctgcaatatgggatcctgattgtctctcacccctttcttctgatgctgaaaatgagatactgagtccctgcataag gagcatttgagggaggaaaggggcagagccctggctaaatgtagccaaggctcatgccggctttcctggcag (SEQ ID NO：1)所示，在NCSTN基因第11个内含子的第1位核苷酸， 由鸟苷酸突变为腺苷酸，即IVS11+1G＞A；

和/或NCSTN基因的第3号外显子序列如：

CTTCAATTAGTGGAGACAGGTTATCCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCC CCAACCCCCCTTACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAG(SEQ ID NO：2)所示，在 NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸 A和G的缺失，即c.210_211delAG。而家系中对照或正常人群则没有 此突变。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明所述的突变 型序列。

本发明的另一方面涉及一种重组细胞，其含有本发明所述的重组 载体。

本发明的另一方面涉及一种样品中逆向性痤疮相关基因的鉴定方 法，其包括以下步骤：

1)测定待测样品中NCSTN基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核 苷酸序列，和/或NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的 G之间的核苷酸序列；

2)NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列为G，则为野生型， 核苷酸序列为A，则为突变型；NCSTN基因第3号外显子第19位核苷 酸C及其后的G之间的核苷酸序列有AG，则为野生型，没有AG，则为 突变型。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的核苷酸序列的测定采用 先PCR扩增再测序的方法，所述PCR引物对为F1： tttgctcccttcaattctgc(SEQ ID NO：3)和R1：aacgccactgagcaaagaat (SEQ ID NO：4)所示序列；和/或F2：gggcaacagcttttcagttc(SEQ  ID NO：5)和R2：cctgcaggatggaaacaaat(SEQ ID NO：6)。

本发明的另一方面涉及一种逆向性痤疮相关基因的检测剂，其至 少包括根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序 列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN 基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和/或NCSTN基因第 3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列；所述PCR 引物对分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列；和/或SEQ ID  NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒至少包括：

1)根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序 列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN 基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和/或NCSTN基因第 3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列；所述PCR 引物对分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列；和/或SEQ ID  NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。

2)任选地，包含用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。

本发明的另一方面涉及本发明所述的试剂盒用于鉴定逆向性痤疮 相关基因的用途。

以下为正常人的NCSTN序列：

CGCCTGGAAACACGAACTTCCGGTCTCTTAGGCTCCGGGCCACAGAGACGGTGTCAGTGGTAGCCTAGAGAG GCCGCTAACAGACAGGAGCCGAACGGGGGCTTCCGCTCAGCAGAGAGGCAAGATGGCTACGGCAGGGGGTGGCTCT GGGGCTGACCCGGGAAGTCGGGGTCTCCTTCGCCTTCTGTCTTTCTGCGTCCTACTAGCAGgtgaggcctccccgc ccgtgagctccgttctctaaggggaactctcggatcggccccgccgcgaccgccactgtctcccttctggttcctg ctgcccctctgtccccccaccctgtaaatcctctttctttttcgttcccacgacagaagttccccctttgcctgga cctgaaggtcccttctcccccgcagcacgtcgtgtcgcttcactcccttctctaggcctcttcctggacttcgagc ctgaccctctcccactttgtccagatgtctcgtttttcccacaaccccagccacccaccccacagtcgaaaggaac aggtgtgaaagttagctttcttcctcgcgtttagactttttgagacgaaagcaatcttgttctgtgggtgctgtgc ggcgcttaaaaggtggatttcttatttcttcctctgttgattacatcctaagtctgtgtccccctgccttgcctca ggttttttttttttttttttttttaatcagtaaagcaagaataaggtaggatatgggtactcttaactgtgaagac cctgaagtaacaattcaaggaacttttggcatttataatgtacttaagtgtttgctgatacgcgttcatttactga tacatggctttttagttggtcaagccctaaaatgcaaatgcctgtatataactatgactgtgccttcccccaattc acattgtttttaaggatcctcaaaggagaaactacagctgccccacactgtgggcacacaaatgacctgctgatgt 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CGGTGTGTGCGTTCTACTGCACGATTAGCCAGGGCCTTGTCTCCTGCCTTTGAACTGAGTCAGTGGAGCTCTACTG AATACTCTACATGGACTGAGAGCCGCTGGAAAGATATCCGTGCCCGGATATTTCTCATCGCCAGCAAAGAGCTTGA Ggtgagatggggcaggggcataggtggcagggatctgtttgacttctttctctgctttcttgtgtcatatagccct ttccatctcccatttgccccacatttgtagcaaaagcctactgcaaatctgtccctggtcagccagcatgttccct taggaggccttttttttgagatggagtttcattcttgttgctcaagctggagtgcaatggcacaatctcagcttac tgcaacctccgtcccttgggtttaagcagttctcctgcctcagcctttcgagtagctgggattacaggcatgtgtc accacacccagctaatttttttttatttttagtagagatgggtttcaccatgttggtcaggctagtcttaaactcc tgacctcaggtgatccacctttcttggcctcccaaagtgctgggattataggcgtgagccactgcacccggccagg aggcctttcttcacagatagtttgagtaggtgttcattctggagagcccctgtggatcccagaactctttcacagc ttcaactcccggctggcattccccatctggcacagctgggatgagtcagtctaatgtaccgagctcctgtcacaag tcagtaatgtaagtgccgcaagggaaccaaagccatgggccctcctttcaaaatgcctaaaatctaagtaatacaa gatggaagcaagaacagagatgctttacttctcttttcaaatggggagacaaagtctgtaggctggagagatgttg cccatgattattccatagttggtgcttagagccagcatccgaattcccatggctccaaaccccaaacagttatcca 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发明的有益效果

本发明利用外显子组测序发现一种逆向性痤疮相关基因NCSTN。 NCSTN编码的蛋白是γ分泌酶复合体的四个亚单位之一，而γ分泌酶与 AI及阿尔采默氏病(Alzhe imer′s Disease，AD)的发病密切相关 (Kelleher RJ r，JS，Genetics.Gamma-secretase and human disease. D-0404511(-1095-9203(Electronic))：T-ppublish.)。因此该 基因的鉴定对发现AI及其相关疾病的易感人群和基因诊断有重要价值， 对探索AI及其相关疾病的发病机制和开辟新的治疗途径有重要意义。

附图说明

图1：外显子组测序的实验流程图

图2：外显子组测序信息分析流程图

图3：表示AI家系中NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突 变位点的检测和验证的结果，其中各个泳道分别表示家系2中13个样 本(5名病例，8名家系内正常人)NCSTN基因外显子3及其外显子-内 含子交界区域目的片段PCR扩增产物电泳图，大小：641bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1：利用外显子组测序捕获逆向性痤疮相关基因

发明人在前述的高敏等(Gao M，Wang PG，Cui Y，et al，Inversa acne (hidradenitis suppurativa)：a case report and identification of the  locus at chromosome 1p21.1-1q25.3.J Invest Dermatol 2006， 126(6)：1302-1306.)研究的基础上，采用外显子组测序对原定位家系中 的成员进行研究，以发现该病的致病基因。

首先，发明人用Agilent SureSelect Human All Exon Kit结合 Solexa高通量测序技术对该家系中的两名病例(II 4 and III 8)和一名家 系内正常人(II 7)的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段 两端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

2)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩 增与SureSelect Biotiny lated RNA Libra ry(BAITS)进行杂交富集， 再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序(图1)。测序平台为 Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少 为50。

3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7 进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R，Li Y， Kristiansen K，et al，SOAP：short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008，24(5)：713-714；Li R，Yu C，Li Y，ea al，SOAP2： an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics  2009，25(15)：1966-1967.)比对参考基因组，获得比对到基因组上的 Unique mapped reads。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R，Li Y，Fang X， Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome  resequencing.Genome Res 2009，19(6)：1124-1132.)确定。然后对数 据进行标准的信息分析流程，包括对SNP、InDel等进行检测、注释和 统计分析。同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性等 分析的检测报告(图2)。

每个个体的平均测序长度为10.36GB，去除了有重复起始位点的 reads后，发明人得到了由RefSeq genes(Pruitt KD，Tatusova T， Maglott DR：NCBI reference sequences(RefSeq)：a curated  non-redundant sequence database of genomes，transcripts and  proteins.Nucleic Acids Res 2007，35(Database issue)：D61-65.) 定义测序深度为50，长度为2.2Gb目的外显子组。平均起来，87.4％的 外显子组被覆盖，测序深度至少为10，平均每个个体发现的遗传变异有 42,678个，包括34,570个非同义突变。

为了从所用突变中找到可能的致病突变，发明人重点关注了非同义 突变和剪接位点突变，认为同义突变致病的可能性较小。与此同时，导 致A I的突变应该是稀有突变，因此它应该在一般人群中缺失。因此， 一个新的突变是这样定义的：它同时不存在于下列数据库中，包括： dbSNP129，8个HapMap个体的外显子组数据(Ng SB，Turner EH， Robertson PD，et al：Targeted capture and massively parallel  sequencing of 12 human exomes.Nature 2009，461(7261)：272-276.)， 1000人基因组计划(Siva N：1000Genomes project.Nat Biotechnol  2008，26(3)：256.)，该家系中正常对照的外显子组数据。

经过上述数据库的筛除后，这两个病例共有的突变还剩8个位于发 明人(高敏等)之前定位的区域1p21.1-1q25.3，他们分别位于以下8 个基因内：MYBPHL，KCNC4，FLAD1，NES，NCSTN，ITLN2，SLC9A11和 Clorf220。接下来，发明人使用ANNOVAR软件(Wang K，Li M，Hakonarson  H：ANNOVAR：functional annotation of genetic variants from  high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Res 2010， 38(16)：e164)预测可能有害的基因，将候选基因的范围缩小到5个： MYBPHL，KCNC4，FLAD1，NCSTN，ITLN2。

之后，发明人进一步使用GERP评分(Cooper GM，Goode DL，Ng SB， et al：Single-nucleotide evolutionary constraint scores highlight  disease-causing mutations.Nat Methods 2010，7(4)：250-251.)对这5 个突变基因的有害性进行了排序，NCSTN排序第一，提示其有害性最大。 发明人进一步观察到在个8个候选基因中只有位于NCSTN中的突变是剪 接位点突变，其可能阻止了转录产物的适当剪接，所以发明人推测NCSTN 和AI的发病可能相关。

该突变为位于NCSTN IVS11+1位置上的鸟苷酸由腺苷酸替换(以 下，简称为：c.1352+1G＞A)(图3)。

gcatttcaggcctaaaagagacctcctgcttcccatcccccagcctcccatcagtta atctccctcgtaccccccagGTGGAGGATCTCCTGGCCACATTGGAGAAGAGTGGTGCTGG TGTCCCTGCTGTCATCCTCAGGAGGCCAAATCAGTCCCAGCCTCTCCCACCATCTTCCCTG CAGCGATTTCTTCGAGCTCGAAACATCTCTGGCGTTGTTCTGGCTGACCACTCTGGTGCCT TCCATAACAAtaagaatcacttggccctgca(SEQ ID NO：28)，其中大写字 母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列，深色底色稍大的斜体代 表突变的核苷酸。

实施例2：NCSTN基因第11个内含子c.1352+1G＞A突变的验证

为了验证该突变，发明人对实施例1所述家系的所有9名病例和12 名家系内正常人进行了Sanger测序。

(1)利用PCR扩增了该突变。

提取家系中各样本的基因组DNA，提取方法为：

取AI家系成员外周血4ml，EDTA抗凝，取400μl抽提基因组DNA， 使用Flexi基因DNA抽提试剂盒(Qiagen，Germany)严格按照说明书 进行。将浓度校正至25ng/μl后进行PCR反应。

PCR引物由Primer 3.0 program在线设计，设计的引物序列为：

F1：tttgctcccttcaattctgc(SEQ ID NO：3)和

R1：aacgccactgagcaaagaat(SEQ ID NO：4)。

PCR反应体系10μl，包含1xPCR反应缓冲液1μl，MgCl₂(25mmol/l) 1.2μl，dNTPs 0.2μl，上下游引物各0.08μl；AmpliTaq Gold^TM(5μ l/l)0.08μl；基因组DNA(25ng/μl)1.5μl，dd H₂O 5.86μl。

PCR反应在Perkin Elmer 9700热循环仪上完成。PCR反应条件如 下：预变性94℃10分钟；94℃、57℃、72℃各1分钟，共40个循环， 最后延伸72℃10分钟。

PCR反应产物由QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化后由 ABI PRISM 3730自动测序仪(Applied Biosystems)进行测序。

结果，1352+1G＞A突变在9名病例被验证出来，而12名家系内正常 人均未发现此突变。

实施例3：NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突变位点的鉴 定

进一步地，发明人选择了第二个AI家系(5名病例，8名对照)对 NCSTN基因的所有17条外显子及外显子-内含子交界区进行了PCR扩增。 扩增引物见表1。PCR反应体系和反应条件同实施例1。

表1NCSTN基因各外显子及外显子-内含子交界区扩增引物

注：其中exon-11引物序列即为鉴定NCSTN IVS11+1位置上的鸟苷 酸由腺苷酸替换(c.1352+1G＞A)的引物序列。

结果显示，在该基因的第3号外显子发现了一个两个核苷酸(AG) 的缺失c.210_211delAG(p.Thr70fsX18)，该缺失被认为从密码子70 开始改变了读码框，它在新读码框的18号密码子提前终止。

catctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaactatgggag ctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACAGGTTATCCACGTAGTA GAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCCTTACATGGTTCTGCT GGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctgggaaaacatccatag(SEQ ID  NO：29)(其中大写字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)。 其中深色底色的斜体字母C和G之间缺失AG。

在以上序列中，以斜体显示的C和G之间缺失了AG。

与此同时，发明人在这两个家系的所有正常对照(第一个家系12 人，第二个家系8人)和90名AI家系外正常人中，针对每例个体采用 表1中所有引物进行扩增，用sanger测序检测了这两个突变，均为阴 性结果。结果表明突变的存在与疾病的有无存在正相关性，另外也证明 表1中的引物能够有效扩增目标序列，同时进行目标序列的突变检测。

实施例4：AI家系中NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突 变位点的检测和验证

收集实施例3的AI家系成员(5名病例，8名家系内正常人)外周血 4ml，EDTA抗凝，取400μl抽提基因组DNA，使用Flexi基因DNA抽提 试剂盒(Qiagen，Germany)严格按照说明书进行。将浓度校正至25ng/ μl后进行PCR反应。引物为：

上游引物：gggcaacagcttttcagttc(SEQ ID NO：5)

下游引物：cctgcaggatggaaacaaat(SEQ ID NO：6)

PCR反应如下：反应为体系10μl，包含1xPCR反应缓冲液1μl， MgCl₂(25mmol/l)1.2μl，dNTPs 0.2μl，上下游引物各0.08μl； AmpliTaq Gold^TM(5μl/l)0.08μl；基因组DNA(25ng/μl)1.5μl， dd H₂O 5.86μl。PCR反应在Perkin Elmer 9700热循环仪上完成。PCR 反应条件如下：预变性94℃10分钟；94℃、57℃、72℃各1分钟，共40 个循环，最后延伸72℃10分钟。扩增产物641bp，用2％琼脂糖凝胶电 泳检测，结果参见图3。

扩增产物纯化后由ABI PRISM 3730自动测序仪(Applied  Biosystems)直接进行Sanger测序，得到NCSTN基因序列。在PubMed BLAST 数据库中进行核酸同源性检测，发现只有与人NCSTN基因同源性最高。

ggcaacagcttttcagttcaaatctagaggtgcctgtattcacccaaatatgttgtg acatctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaactat gggagctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACACGGGTTA TCCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCC TTACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctggg aaaacatccatagagggaaagtttcagtgaacagtcctcacacttattagtgaaaacttcc cttggctgccctggtctggtcaggggagagggcagggtggtcctcagaaggaaaggtgtac catcaaaagaaatgatcttgagcttagggctaaatttcacctacctgtccctgagtaaccc tgggcatccctcccctccctccctggggtccttactcactaaagctctactttttagagca gatcattgtccagactcagaatttagagactgaaagggaagaaataagtcaacagtttgat tcccctagttccccatttgtttccatcctgcagg (SEQ ID NO：30)(其中大写 字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)

以上序列为UCSC Genome Bioinformatics中NCSTN基因序列 (hg18)(3号外显子及其侧翼序列)

gggcaacagcttttcagttcaaatctagaggtgcctgtattcacccaaatatgttgt gacatctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaacta tgggagctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACAGGTTAT CCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCCT TACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctggga aaacatccatagagggaaagtttcagtgaacagtcctcacacttattagtgaaaacttccc ttggctgccctggtctggtcaggggagagggcagggtggtcctcagaaggaaaggtgtacc atcaaaagaaatgatcttgagcttagggctaaatttcacctacctgtccctgagtaaccct gggcatccctcccctccctccctggggtccttactcactaaagctctactttttagagcag atcattgtccagactcagaatttagagactgaaagggaagaaataagtcaacagtttgatt cccctagttccccatttgtttccatcctgcaggca(SEQ ID NO：31)(其中大写 字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)

以上序列为测序后得到的NCSTN突变基因(c.210_211delAG)(3号 外显子及其侧翼序列)，在深色底色的斜体C和G之间缺失AG。

测序结果表明存在c.210_211delAG突变位点的检测样本都是患病 样本，换言之，二者存在正相关性。

实施例5：检测NCSTN基因3号外显子突变(c.210_211delAG)的 试剂盒的组成及使用方法

A：试剂盒组成

引物：表1中列出的可扩增出NCSTN所有17条外显子的12对引物；

其它成分，包括：PCR反应缓冲液，MgCl₂(25mmol/l)，dNTPs， AmpliTaq Gold^TM(5μl/l)，dd H₂O。

B：使用方法

1)在试剂盒的组成成分中加入待测DNA样品后进行PCR反应；

2)PCR反应产物经纯化后测序，将所得到的序列与NCSTN正常基因 序列比对，确定3号外显子序列第19位碱基的C和G之间是否缺失AG。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。