一种ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH

摘要

本发明涉及一种ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明获得的来自于嗜热菌Alicyclobacillus hesperidium中ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH，具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子伴侣活性，可应用于农作物的基因改造。本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH可应用于基因工程农作物的改造，能够更好地提高作物抵御环境压力，大大提高农作物的产量。

说明书

技术领域

本发明属于酶蛋白技术领域，具体涉及一种ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH。

背景技术

生物体内的蛋白质经常因为各种形式的损伤从而丧失功能，修复/清除受损 蛋白是蛋白质质量控制的一种形式。分子伴侣能够辅助受损蛋白重新折叠，一 些酶促修复过程也能逆转某些蛋白的损伤，不能修复的蛋白则被蛋白水解系统 降解从而彻底清除。AAA蛋白酶(ATPases Associated with a variety of cellular  Activities)同时具有蛋白酶和分子伴侣活性，能介导细菌、线粒体中膜蛋白的降 解和修复，形成一个膜结合蛋白的质量控制系统。

FtsH(Filamentation temperature-sensitive H)属于AAA蛋白酶家族，是重要 的膜结合蛋白酶。在生物体内，FtsH通过寡聚化形成一个六聚环形结构，将蛋 白水解活性位点埋在六聚复合体空穴中央。FtsH蛋白的保守模块包括N-端跨膜 域、AAA结构、锌离子结合模块等。FtsH具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子 伴侣活性，参与蛋白质质量平衡控制，还与热激、高渗、光胁迫、低温、病害 等响应有联系。由于FtsH功能的多样性，所以与细胞内诸多代谢活动和发育进 程相关，具有重要的意义。近年来，对其蛋白酶活性有了一定研究，但是仍然 存在许多问题有待进一步解决。而且，在不同的物种中，FtsH的序列变异很大， 因此，分离并确定FtsH的序列一直是一个难以解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自于嗜热菌Alicyclobacillus hesperidium中 ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH，提供了极端生存条件下的研究对象，以补充现有 技术的不足。

本发明提供一种ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH，其特征在于：所述酶的氨基 酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供一种核苷酸，用于编码上述的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH。

所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供重组质粒，用于表达本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH， 该重组质粒携带的基因序列为SEQ ID NO：2。

上述的蛋白酶用于研究细胞的应激反应，可应用于农作物的基因改造。

本发明获得的来自于嗜热菌Alicyclobacillus hesperidium中ATP-依赖的金 属蛋白酶FtsH，具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子伴侣活性，可应用于农 作物的基因改造。本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH可应用于基因工程农作 物的改造，能够更好地提高作物抵御环境压力，大大提高农作物的产量。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限 于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆 布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件运行。

实施例1：本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因全长cDNA获取

本发明首先利用二代测序技术进行全基因组测序、拼接与注释。将具有FtsH 保守区的基因自起始密码子AUG至终止密码子UGG进行捕获。具体步骤为：

1、Alicyclobacillus hesperidium的全基因组测序：

总DNA的提取和文库的构建：离心获取Alicyclobacillus hesperidium菌体， 参照Fermentas公司GeneJET Genomic DNA Purification Kit进行总DNA提取。 参照KAPA NGS Library Preparation Kit构建测序文库。用Illumina HiSeq2000最 先进的Solexa paired-end进行全基因组测序，产生160倍覆盖率的数据。应用 Velvet(Sequence assembler for very short reads)拼接方法，得到130个contigs。 并初步进行基因组注释，找到了约1800个编码蛋白基因。

2、ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因全长cDNA预测：

生物信息学分析，在1800个编码蛋白基因中，找到具有N-端跨膜域、AAA 结构、锌离子结合模块等ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH保守区域的蛋白序列。自 起始密码子AUG至终止密码子UAA即为预测的cDNA序列，全长cDNA阅读 框长1809bp，预测其编码一个含有602个氨基酸残基，核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO：1所述，其对应基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

3、ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因全长cDNA获取：

总RNA的提取和cDNA合成：离心获取Alicyclobacillus hesperidium菌体， 参照Qiagen公司RNeasy Mini Kit试剂盒说明书进行总RNA提取。cDNA全长基因 片段的扩增采用Invitrogen公司M-MLV Reverse transcriptase进行第一链的合成， 得到10μl cDNA第一链产物。

cDNA全长PCR反应：根据预测ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因片段的 序列设计特异性引物P1，P2(P1：5′-ATGAACCGTTTTTACCGGAGC-3′SEQ ID NO：3；P2：5′-TCAGCCACAGCTTTCCATGATC-3′SEQ ID NO：4)。取cDNA 2μl 用于PCR反应，体系50μl。反应条件为94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72 ℃2min共30个循环；72℃10min。扩增得到ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因 阅读框的片段1809bp，用Omega切胶回收试剂盒进行片段纯化。按照TransGen 公司的pEASY-Blunt Cloning Kit进行连接反应并转化E.coli感受态细胞DH5α。 取200μl转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送 至Invitrogen公司测序鉴定。

实施例2：Alicyclobacillus hesperidium ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH全长 cDNA的异源表达。

以原核表达系统诱导表达Alicyclobacillus hesperidium ATP-依赖的金属蛋 白酶FtsH重组蛋白，具体步骤如下：

1、重组质粒FtsH-pET32a的构建与鉴定：根据Alicyclobacillus hesperidium  ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因的全长cDNA序列，在其两端分别引入限制性 内切酶位点Sac I和Sal I位点，扩增本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因， 亚克隆进原核表达质粒pET32a，测序确定为正确的插入基因载体。

2、重组质粒FtsH-pET32a转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态，在LA (含有100μg/m1)平板中37℃培养过夜，通过蓝白筛选筛选转化子。挑白色转 化子单菌落接种于LA平板，37℃培养过夜。用牙签沾少许菌落做PCR。PCR 条件：94℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，共30个循环；72℃10min 后完成扩增。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

3、ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH诱导表达与纯化：将已经验证的带有重组 质粒FtsH-pET32a的E.coli BL21在LA平板上划线，37℃培养。挑取单菌落接 入液体LA试管，37℃摇床培养过夜。按1％接种量接入100ml LA培养基，37℃ 摇床210r/min培养至菌浓OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入IPTG至终浓度1mM，37℃ 摇床培养4小时，诱导FtsH蛋白表达，离心收集上清液。上清液经过镍离子螯 合亲和层析柱纯化，收集蛋白洗脱峰，SDS-PAGE检测蛋白纯化情况。将含有 目的蛋白的洗脱液进行脱盐浓缩，获得Alicyclobacillus hesperidium来源的ATP- 依赖的金属蛋白酶FtsH。

4、ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH活性及热稳定性分析：将本发明纯化后的 ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH溶于50mM Tris-acetate(pH8.0)，70℃温浴2小时； 2μg本发明ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH或温浴后的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH 分别与1μg β-酪蛋白(Sigma)，终浓度50mM Tris-醋酸(pH8.0)，5mM醋酸镁， 12.5μM醋酸锌，80mM氯化钠，100μg/mL BSA，1.4mMβ-巯基乙醇溶液混合， 20μl反应体系，反应前加入5mMATP，38℃反应2小时。加入上样缓冲液(0.25M Tris，1.92M甘氨酸，1％SDS，pH8.4-8.9)终止反应，冰浴。样品用12％SDS-PAGE 进行电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色。以不加入本发明的ATP-依赖的金属蛋 白酶FtsH为空白组。结果发现加入本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH的反 应体系，β-酪蛋白条带亮度明显弱于空白组，且70℃温浴后的蛋白活性不变。

以真核表达系统诱导表达Alicyclobacillus hesperidium ATP-依赖的金属蛋 白酶FtsH重组蛋白，具体步骤如下：

1、重组质粒pROK2-FtsH的构建与鉴定：根据Alicyclobacillus hesperidium  ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基因的全长cDNA序列，在其两端分别引入限制性 内切酶位点Kpn I和Sac I位点，扩增本发明的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH基 因，亚克隆进真核表达质粒pROK2，测序确定为正确的插入基因载体。

2、冻融法将重组质粒pROK2-FtsH转化至根癌农杆菌LBA4404，在YEB (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)平板中28℃培养2-3d，筛选转化子。 挑取转化的农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和125 mg/L利福平)中，28℃220rpm摇培16小时，用菌液做PCR。PCR条件：94 ℃5min；94℃30sec，60℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃10min后完 成扩增。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

3、水稻的遗传转化：取阳性农杆菌接种在YEB固体培养基上，28℃培养2 天。单菌落接入5ml YEB液体培养基，220rpm摇培24小时，5000rpm离心10 分钟，弃上清。20ml含有100μM乙酰丁香酮的AAM培养基重悬，剧烈摇动， 调整菌液浓度OD₆₀₀为0.1-1.0左右，静止1小时。取水稻授粉后15-20天的未 成熟穗，种子剥壳后清洗消毒。挑出幼胚并接种于诱导培养基，27℃暗培养10-14 天。等待愈伤长大后继代，选择第三代后的胚性愈伤组织，加入上述处理的农 杆菌菌液，略微摇动后静止30分钟，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基， 25℃暗培养3天。挑取共培养的愈伤于广口培养瓶，无菌水清洗。最后用250 mg/L氨苄青霉素的无菌水静置一小时，晾干。第二天转至选择培养基(250mg/L 氨苄青霉素，1mg/L ZT，500mg/L哌拉)筛选抗性愈伤。

4、转基因水稻的培养与观察：每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，约 需三周即可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出。将颜色鲜黄的 抗性愈伤组织转移到分化培养基上3-5天。挑选一部分转至分化培养基上，3周 后长出幼芽和根。将幼苗移至生根培养基上，幼苗用于耐热性等分析。

5、转基因水稻和空白组耐热性分析：转基因水稻组和未转基因空白组植株 同时于42℃预处理2小时，进一步50℃光照培养箱热激处理8小时，随后将热 胁迫的幼苗移至正常生长条件下进行恢复生长；恢复2周后观察植株表型。结 果表明2周后，含有本发明Alicyclobacillus hesperidium来源的ATP-依赖的金 属蛋白酶FtsH转基因水稻组空白组基本恢复正常生长，而空白组损伤较重，说 明空白组植株比含有本发明Alicyclobacillus hesperidium来源的ATP-依赖的金 属蛋白酶FtsH转基因水稻组植株更容易受到伤害。

6、含有本发明Alicyclobacillus hesperidium来源的ATP-依赖的金属蛋白酶 FtsH转基因水稻与空白组高温胁迫下的叶绿素荧光特性分析：抗性苗生长6周 后，于恒温光照培养箱进行48℃、50℃高温胁迫处理，随后于正常生长条件下 进行恢复培养。分别于热激处理前、热激处理后、恢复1天、恢复2天用便携 式荧光测定仪检测1片最大展开叶的叶绿素荧光参数，包括初始荧光(F₀)、最 大荧光(F_m)、可变荧光(F_v)、叶绿体的光化学效率(F_v/F_m)。测定前暗适应20 分钟，测定时先照射检测光(＜0.05μmol/m²/s)，再照射饱和脉冲光(12000μ mol/m²/s)。每种转基因株系分别选择抗性植株5株，选择同等数量的空白株， 进行各种热激处理。实验结果表明，经过2天恢复期，转基因水稻植株的F_v/_m基本恢复正常，而在空白组植株中，F_v/F_m仍处于较低水平，表明高温胁迫下， 空白组植株遭受了比含有本发明Alicyclobacillus hesperidium来源的ATP-依赖 的金属蛋白酶FtsH转基因植株更严重的伤害。