猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因、表达载体的构建及其蛋白高效表达的方法

摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因、表达载体的构建及其蛋白高效表达的方法。本发明的一种经改造后的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因其序列如SEQ ID NO.1所示，本发明同时公开了其蛋白的制备方法，具体涉及猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的改造、基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达、蛋白收获时间及方法、蛋白含量及抗原性检测、扩大培养条件等操作方法的改进等步骤。本发明简单易行，成本较低，实现了猪圆环病毒II型衣壳蛋白在毕赤酵母中稳定高效表达，在试管或摇瓶中表达量大于218mg/L，为猪圆环病毒II型的抗体检测及亚单位疫苗的研制提供了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的改造、表达载体的构建、在毕赤酵母中的高效表达及其蛋白的制备方法。属于动物基因工程与动物病毒学技术领域。 

背景技术

德国学者Tischer等于1974年从PK-15细胞的污染病毒中检出一种形态学上与细小核糖核酸病毒相似的小球形病毒和乳多泡病毒样病毒粒子(Tischer等.Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines.Zbl Bakt Hyg I Abt Orig A.1974，226：153-167)，并于1982年将其命名为猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)(Tischer等.A very small porcine virus with circular single stranded DNA.Nature，1982，295：64-66.)。1991年在加拿大的猪群中发现一种称为断乳仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)的疾病，猪2型圆环病毒(porcine circo virus 2，PCV2)是该病的主要病原(Harding等.Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS).Swine Health Prod.1997，5：201-203)。在我国，郎洪武等采集了7省(市)22个猪群的559份血清，用ELISA方法检测20日龄未断奶仔猪、1～2月龄断奶仔猪、后备母猪及经产母猪，结果总阳性率为42.9％(郎洪武等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，30：3-5)。由PCV2感染引起的PMWS于2001年开始在我国各地呈暴发流行，是危害我国养猪业的重要疫病之一(郎洪武等.猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰竭综合征的诊断.中国兽医科技，2001，31(3)：3-5；王忠田等.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查.中国兽医杂志，2002，38(10)：3-6.)。 

PCV2含有2个主要的开放阅读框(ORF)，其中ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白，也是主要免疫原性蛋白，是发展新型疫苗的良好靶基因(Nawagitgul等.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2encodes a major  capsid protein.J Gen Virol，2000，81(9)：2281-2287)。 

PCV2在细胞上增值滴度很低，不引起细胞病变，使用D-氨基葡萄糖处理后病毒滴度可以升高，但D-氨基葡萄糖对细胞有毒性会使细胞很快死亡(Tischer等.Replication of Porcine Circovirus：Induction by Glucosamine and Cell Cycle Dependence.Arch Virol，1987，96：39-57)。国内虽已经有PCV2灭活疫苗上市，但由于依然受到病毒含量等因素的限制而导致生产成本过高，其结果是国产圆环病毒灭活疫苗是最贵的猪病疫苗之一，国产圆环病毒灭活疫苗昂贵的价格会限制其应用范围。 

杆状病毒表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白亚单位疫苗已被勃林格殷格翰动物保健公司证实有效，具体专利申请公开说明书：CN200580047741.4，公开号：CN101180406A。目前有两个酵母表达猪圆环病毒II型衣壳蛋白的专利申请公示(申请号分别为：CN201010505547.9和CN201010618223.6)。经过基因序列比对发现，本发明的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因序列与申请号CN201010505547.9权利要求的衣壳蛋白基因序列同源性为73.1％，本发明的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因序列与申请号CN201010618223.6权利要求的衣壳蛋白基因序列同源性为88.1％，基因序列比对结果表明本发明之设计方案与以上两个专利申请(申请号分别为：CN201010505547.9和CN201010618223.6)基因优化方案明显不同。本发明的猪圆环病毒II型衣壳蛋白表达量(218mg/L)是原始表达量，未经过超滤浓缩，远高于专利申请号CN201010505547.9报道的衣壳蛋白表达量(其报道的表达量为115mg/L经过超滤浓缩，详见其专利中说明书第6页第13行)，为本领域技术人员所熟知的是，蛋白如果高效表达的话是不需要经过超滤浓缩的；专利申请号CN201010618223.6未报道其衣壳蛋白具体表达量，为本领域技术人员所熟知的是，蛋白的高效表达应该标注具体表达量。因此可以得出结论，本发明的衣壳蛋白表达量大大高于以上两个专利申请，换言之，本发明整体方案要优于以上两个专利申请。基于国产圆环病毒灭活疫苗的成功研制是在将病毒滴度从10^2.5TCID₅₀/mL提高到10^6.6TCID₅₀/mL的基础上(见专利申请公开说明书CN200610086918.8)，因此我们有理由相信，本发明的高效表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白(表达量大于218mg/L)会为猪圆环病毒II型的抗体检测及亚单位疫苗的研制打下良好的基础。 

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因； 

本发明的另一目的是提供含上述人工合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的DNA重组载体和宿主细胞； 

本发明的再一目的是提供一种制备猪圆环病毒II型衣壳蛋白的方法。 

本发明的技术方案如下： 

本发明的一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因，其特征在于所述的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 

本发明的一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因是在不改变天然氨基酸序列的前提下，对猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造后得到的，其能够使猪圆环病毒II型衣壳蛋白在毕赤酵母中得到稳定高效的表达。 

本发明还提供了一种包含所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的重组表达载体。 

优选的，所述的重组表达载体为甲醇调节型重组酵母表达载体，更优选的，所述的重组表达载体为pPIC9K，所述表达载体pPIC9K含有EcoRI和NotI酶切位点，一个强启动子AOX1启动子，一个G418抗性选择位点。 

进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为包含所述的重组载体的包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸全部或大于150个核苷酸的部分序列的宿主细胞。 

所述的宿主细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。所述的宿主细胞优选为甲醇营养型酵母细胞GS115，次优选为非甲醇营养型酵母细胞。 

更进一步的，本发明还提供了所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因在制备猪圆环病毒II型衣壳蛋白中的应用。 

本发明提供的一种制备猪圆环病毒II型衣壳蛋白的方法，其特征在于将所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因克隆至表达载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行蛋白的诱导表达，收集纯化即得。 

在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤： 

(1)人工合成猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因，所述的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 

(2)将合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中， 电转化GS 115感受态后，用MD板及G418+YPD平板筛选，激活培养后经甲醇诱导表达并进行无菌检验； 

(3)无菌收集菌体，加入适量磷酸缓冲液裂解破壁后制备衣壳蛋白，整个过程中进行蛋白无菌检验； 

(5)测定衣壳蛋白的含量及用阳性血清对其进行免疫检测。 

在本发明中，优选的，在步骤(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点。 

在本发明中，优选的，所述的甲醇诱导表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5-1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加5-10微升甲醇，进行诱导培养，26-30℃250-300转/min震荡培养96～120h，收获菌体，液氮反复冻融3次后超声波破碎制备蛋白。 

具体的，所述方法包括以下步骤：： 

(1)在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因PCV2-rCap，该人工合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。然后在其5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点；将该人工合成的基因克隆至pUC57中获得pUC-rCap。 

(2)将包含猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的质粒pUC-rCap和pPIC9K用EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖电泳后胶回收Cap和pPIC9K片段，连接Cap和pPIC9K得到表达载体pPIC9K-rCap。 

(3)毕赤酵母的电转化 

以SalI或SacI线性化pPIC9K-rCap，与GS115感受态混合后，用BioRad Gene Pulser电转化，电转化产物涂布MD平板，待长出单菌落后分别转接至不同浓度G418+YPD抗性平板上，28～30℃孵育2～3d。 

(4)蛋白的诱导表达 

从抗性板中挑选单菌落进行活化后进行甲醇诱导培养，所述的甲醇诱导表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5-1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加5-10微升甲醇，进行诱导培养，26-30℃250-300转/min震荡培养96～120h，分别检测上清和菌体中目的蛋白的表达情况，上清直接以SDS-PAGE和WB检测，菌体经液氮反复冻融后3次后超声波破壁，以8000g离心3min取上清进行SDS-PAGE。 

(5)蛋白含量的测定及免疫学检测 

收获的菌体中加入适量磷酸缓冲液进行混合破壁，破壁方法是液氮反复冻融3次后超声波破碎，然后以8000g离心3min取上清进行总蛋白含量的测定，同时取上清进行SDS-PAGE，薄层扫描确定目的蛋白的百分含量，进而计算出目的蛋白的含量。以PCV2猪阳性血清经过WB检测目的蛋白的反应原性。 

本发明的方法可用于圆环病毒II型衣壳蛋白的小量制备，包括以下步骤： 

(a)用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的具有本发明所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因PCV2-rCap的G418抗性的单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28～30℃，250转/min振荡过夜，至OD₆₀₀＝2～6，细胞处于对数生长期； 

(b)将步骤(a)得到的细胞培养液在1500g/min和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在30mL的试管中继续振荡培养； 

(c)每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5％(v/v)，加入量为每毫升培养液中加5微升甲醇，进行诱导培养，28～30℃250转/min震荡培养96h收获上清和菌体，液氮反复冻融3次后超声波破碎制备蛋白。 

在用于圆环病毒II型衣壳蛋白的大量制备时，本发明对扩大培养条件进行改进，挑选合适的培养容器，摸索合适的培养温度，按照1∶50～1∶100的比例稀释，相应扩大甲醇的添加量，提高震荡培养的速度。具体的改进如下：在扩大培养表达的过程中按照1∶50～1∶100的比例进行诱导表达，即挑取数个菌落在50～100mLBMGY中激活，26℃260-300转/min震荡培养18-24h，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，少量的甘油不会影响蛋白的表达，为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至甲醇终浓度为0.5％～1％(v/v)，即每毫升培养液加5～10μL甲醇；诱导过程中容器的选择，可以使用容量大的三角瓶，能够提高产量，扩大培养使用的三角瓶，培养瓶体积为5L左右，26℃260-300转/min震荡培养96～120h收获上清和菌体，液氮反复冻融3次后超声波破碎制备蛋白。 

本发明的有益效果是： 

(1)本发明解决了如何提高猪圆环病毒II型衣壳蛋白在酵母中高效表达的多个关键技术，从而使猪圆环病毒II型衣壳蛋白在毕赤酵母中得到稳定高效的表达，在 摇瓶中达到表达量大于218mg/L，大大高于其他专利及文献报道的表达量。 

(2)本发明方法简单易行，成本较低。 

附图说明

图1为本发明猪圆环病毒II型衣壳蛋白毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果； 

M为预染Marker，1为pPIC9K-rCap转化的重组酵母破壁上清，2为pPIC9K转化菌株GS115对照破壁上清 

图2为本发明猪圆环病毒II型衣壳蛋白毕赤酵母表达的Western-Blot结果； 

M为预染Marker，1为pPIC9K-rCap转化的重组酵母破壁上清，2为pPIC9K转化菌株GS115对照破壁上清 

图3为本发明猪圆环病毒II型衣壳蛋白毕赤酵母表达的破壁上清SDS-PAGE薄层扫描结果。 

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。 

实施例1经过改造的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的合成 

对猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造，在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因PCV2-rCap，该人工合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。 

实施例2猪圆环病毒II型衣壳蛋白的小量制备 

1、猪圆环病毒II型衣壳蛋白工程酵母菌种的构建 

1)材料和方法 

毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115，pPIC9K表达质粒，均购自美国Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI、NotI、SacI购自TaKaRa公司，T4DNA 连接酶购自NEB公司。BMGY、BMMY、YPD培养基的具体配制方法见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒购自Axgen公司。一抗为猪圆环病毒阳性血清，为自制，二抗为兔抗猪IgG-HRP抗体，购自Sigma公司； 

2)人工合成猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因 

A)将实施例1合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因PCV2-rCap的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了NotI限制性内切酶位点后克隆至pUC57中获得pUC-rCap。 

B)表达载体pPIC9K-rCap的构建 

将包含猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的质粒pUC-rCap和pPIC9K用EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖电泳后胶回收衣壳蛋白片段Cap和pPIC9K，连接Cap和pPIC9K得到表达载体pPIC9K-rCap； 

C)重组毕赤酵母的电转化 

以来源于TaKaRa公司限制性内切酶SacI将重组质粒pPIC9K-rCap线性化后，与毕赤酵母GS115感受态混合，用BioRad Gene Pulser电转仪电击转化，转化参数为1.5kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入1mL冰浴山梨醇，经温育，将转化菌液涂布于MD平板上，28℃孵育2d，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素G418250、500、1000、2000、3000mg/L的G418+YPD平板上，28℃孵育2d，然后将G418 2000mg/L G418+YPD平板上的单菌落再分别依次点种在G4182500、3000mg/L的G418+YPD平板上，28℃孵育2d；该重组酵母菌株抵抗G418的能力与其整合质粒拷贝数成正比。 

D)蛋白的诱导表达 

用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的具有本发明所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因PCV2-rCap的G418抗性的单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28℃，250转/min振荡过夜，至OD₆₀₀＝6，细胞处于对数生长期，得到的细胞培养液在1500g/min和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，控制溶氧量30％，防止污染，在30mL的试管中继续振荡培养；每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5％(v/v)，加入量为每毫升培养基中加5微升甲醇，进行诱导培养4d，28℃250转/min震荡培养96h收获上清和菌体，进行混合破壁，破壁方法是液氮反复冻融3次后超声波破 碎，然后以8000g离心3min取上清进行总蛋白含量的测定(BCA法)，测定结果为pPIC9K-rCap转化的重组酵母破壁上清总蛋白含量为2mg/ml；用SDS-PAGE电泳法检测上清液中的猪圆环病毒II型衣壳蛋白：电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行Western-Blot鉴定：一抗为猪圆环病毒阳性血清，二抗为兔抗猪lgG-HRP抗体； 

采用本发明方法表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示，其中M为预染Marker，1为pPIC9K-rCap转化的重组酵母破壁上清，2为pPIC9K转化菌株GS115对照破壁上清。 

采用本发明方法表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白的Western-Blot结果如图2所示，其中M为预染Marker，1为pPIC9K-rCap转化的重组酵母破壁上清，2为pPIC9K转化菌株GS115对照破壁上清。 

采用本发明方法表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白毕的破壁上清SDS-PAGE薄层扫描结果，如图3所示，其中目的蛋白所占比例为10.9％。 

实施例3猪圆环病毒II型衣壳蛋白的大量制备 

1、材料： 

猪圆环病毒II型衣壳蛋白菌种：pPIC9K-rCap-GS115(实施例2制备)； 

仪器：摇床、电泳仪； 

培养基：YPD、BMGY、BMMY培养基的具体配制方法见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册； 

2、方法 

按照1∶100的比例进行诱导表达，即用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的G418抗性的数个单菌落pPIC9K-rCap-GS115于100mL BMGY中激活，26℃260转/min震荡培养24h，至OD₆₀₀＝4，细胞处于对数生长期，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100％甲醇至甲醇终浓度为1％(v/v)，即每毫升培养液中加10μL甲醇；诱导过程中容器的选择，使用容量大的三角瓶，能够提高产量，扩大培养使用的三角瓶，体积为5L左右，其中BMMY培养基的体积为1L，26℃，260转/min震荡培养120h收获菌体，菌体经过液氮反复冻融3次后超声波破碎大量制备蛋白，然后加入与收获前相同体 积的磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)，8000g/min离心3min后收集上清，目的蛋白存在于上清中。 

3、表达的蛋白含量的测定实验： 

对方法2中收集的包含目的蛋白的上清进行总蛋白定量，采用BCA法，使用的微量BCA蛋白定量分析试剂盒(Micro BCA^TM Protein Assay Kit)购自Thermo公司，产品货号为23235，具体操作步骤按照说明书进行。检测上清总蛋白含量为2mg/ml。将表达上清进行SDS-PAGE，对SDS-PAGE胶进行薄层扫描，扫描结果显示目的条带在总蛋白中的比例为10.9％(见图3)。经过计算得知目的蛋白表达量为0.218mg/ml，即218mg/L。