适合于高分辨质谱的程序升温大体积进样分析方法及装置

摘要

本发明提供了一种基于程序升温大体积进样分析方法，适合于气相色谱-高分辨质谱联用分析持久性有机污染物的新型进样分析。该技术对PTV进样口的衬管和外部降温设备进行了改造，对溶剂放空时间、放空速度、注射针推速等一系列参数进行了优化组合。该发明可广泛应用于环境样品(底泥、土壤、空气、可吸入颗粒物、污水等)，食品，生物组织中多氯联苯、二恶英、多溴联苯醚等持久性有机污染物的分析；尤其适用于超痕量污染水平基质的分析(pg/g级)，如水源水、动物(包括人体)血液等低脂基质中该类污染物的分析。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种适合于分析超痕量水平持久性有机污染物的高分辨质谱的程序升温大体积进样分析方法，及其专用装置。

(二)背景技术

二恶英(Polychlorinated dibenzodioxins/furans，俗称dioxin)，多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls，PCBs)和多溴联苯醚(Polybrominateddiphenylethers，PBDEs)均属于斯德哥尔摩公约首批规定的12种持久性有机污染物(POPs)，它们具有疏水亲脂性，化学性质极为稳定，难于被生物体降解，能通过食物链产生生物富集和放大效应。人类处于食物链的顶端，研究人体组织样本，如脂肪、母乳、血液等中的二恶英和多氯联苯，对于了解这些持久性有机污染物对人群健康的影响有着重要的意义，已成为近年来的研究热点之一。

由于二恶英和DL-PCBs在环境介质中一般浓度很低，因此国际公认的仲裁检测方法为同位素稀释-高分辨质谱法。即便如此，对那些脂肪含量较低的人体样本，如血液(脂肪含量约0.1～0.5％)，仍需要较大的样品量(一般＞10mL)以保障毒性当量因子大的、通常也是超痕量的化合物(2378-TCDD，PCB126，169等)能被检出。但对于特殊人群如儿童，一次采集10mL以上的血液在调查现场有一定难度。过去，研究者们常将血液或其它低脂人体样本混合起来，分析混样(pooled samples)以提高灵敏度，但这样难以保证样品的代表性。如能从检测技术上提高方法的灵敏度，降低分析对样品量的需求，则对人体中此类痕量污染物的监测有着实际的推动作用。

本发明的基本原理是通过增加样品进样量达到提高分析灵敏度的目的。过程可简单描述为：样品注入进样口，先缓慢升温到溶剂沸点附近放空溶剂(Solvent Vent)，而高沸点的目标分析物(低沸点组分至少比溶剂沸点高100℃以上)则基本无损失地保留在衬管中并被浓缩。在到达预先设定的时间后，关闭分流出口，迅速升高进样口温度，将目标分析物和残留的溶剂转移到色谱柱进行分离。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新型的适合于分析超痕量水平的持久性有机污染物气相色谱-高分辨磁质谱联用的程序升温大体积进样分析方法及装置，具有灵敏度极高、实用、易推广的特点。

本发明采用的技术方案是：

一种适合于高分辨质谱的程序升温大体积进样分析方法，采用Agilent 6890N气相色谱仪(带有程序升温PTV进样口)(美国Agilent公司)、自动进样器(GC PAL，CTC Anlytics，瑞士)和高分辨磁质谱仪(Micromass Autospec Ultima，美国Waters公司，PTV进样口可由Masslynx4.1软件或其它同类软件控制)，所述方法是将样品注入PTV程序升温进样口，先升温至溶剂沸点(115℃)放空溶剂，使目标分析物保留在衬管中并被浓缩，之后关闭分流出口，迅速进行程序升温升高进样口温度，将目标分析物和残留的溶剂转移到色谱柱进行分离并用高分辨磁质谱仪进行质谱分析，所述PTV程序升温进样口初始压力为1.0kPa、进样口初始温度为50℃、初始温度平衡时间为1.0min；进样后吹扫压力为25.0kPa、吹扫时间为2.50min；溶剂放空时流速为50.0ml/min、放空压力为0.0kPa、放空时间为1.10min；进样口程序升温过程为：先以65℃/min速率升温至115℃，放空溶剂后，关闭分流出口，然后以720℃/min速率升温至305℃，将目标分析物和残留的溶剂转移到色谱柱进行常规分离并用高分辨质谱仪进行常规质谱分析。

本发明关键在于PTV进样参数的设定，具体的，本发明涉及的PTV进样口及进样针参数优化组合如表1所示：

表1：PTV进样口及进样针参数优化组合

采用本发明进行持久性有机污染物分析具有灵敏度极高的优点，尤其适合分析较洁净水样、动物(含人体)血样等样品中超痕量的持久性有机污染物。

采用本发明方法，分析普通人群血样中二恶英等持久性有机污染物的样品量约为1～2mL。

所述方法用于分析人体血样中的多氯联苯时，程序升温进样口初始压力为1.0kPa、进样口初始温度为50℃、初始温度平衡时间为1.0min；进样后吹扫压力为25.0kPa、吹扫时间为2.50min；溶剂放空时流速为50.0ml/min、放空压力为0.0kPa、放空时间为1.10min；进样口程序升温过程为：先以65℃/min速率升温至115℃，然后以720℃/min速率升温至310℃。色谱柱升温程序如下：初始温度50℃平衡1min，以34℃/min升温至110℃，以15℃/min升温至150℃，以3℃/min升温至270℃，保持3min，以15℃/min升温至310℃。

所述方法用于分析人体血样中的二恶英和呋喃时，程序升温进样口初始压力为1.0kPa、进样口初始温度为50℃、初始温度平衡时间为1.0min；进样后吹扫压力为25.0kPa、吹扫时间为2.50min；溶剂放空时流速为50.0ml/min、放空压力为0.0kPa、放空时间为1.10min；进样口程序升温过程为：先以65℃/min速率升温至115℃，然后以720℃/min速率升温至310℃。色谱柱升温程序如下：初始温度50℃平衡1min，以65℃/min升温至115℃，以78℃/min升温至220℃，保持15min，以2.3℃/min升温至250℃，以0.9℃/min升温至260℃，以20℃/min升温至310℃，保持1程序2.85min。

本发明还涉及一种用于高分辨质谱的升温大体积进样分析的装置，由Agilent 6890N气相色谱仪、自动进样器GC PAL和高分辨磁质谱仪Micromass Autospec Ultima组成，其特征在于：所述Agilent 6890N气相色谱仪冷却装置为165L液氮低压罐，所述液氮低压罐的液体排出阀和PTV进样口的冷却气进口之间用包裹有保温材料的铜管连接；所述PTV进样口衬管为开口多折流型石英玻璃管，其入口端填充有去活玻璃棉。

PTV的原配冷却系统采用空气冷却，冷却速度较慢，接口为英制的Swagelok螺母。为提高进样口的冷却速度，本发明装置采用165L液氮低压罐(国产)进行降温。通过2米长的铜管(外径8.3mm)连接液氮罐的液体排出阀和PTV进样口的冷却气进口，实现由液氮降温。连接低压液氮罐和PTV进样口的螺母接口均改造为标准接口，大小以适合外径8.3mm外径铜管通过为宜。工作时铜管内将通过低温液氮，为保温起见，同时也为了保证操作人员的安全，防止冻伤，在铜管外包裹一层泡沫保温材料。使用时液氮低压罐的气体工作压力范围3～8Bar(图1B)，压力过高将导致PTV进样口压力传感器报警锁死；压力过低液氮无法进入PTV进样口内实施冷却。液氮的控制由masslynx软件控制，在一个样品完成分析后自动开始工作(温度由290～320℃降到40～50℃)。

本发明涉及的衬管为开口多折流型石英玻璃管(Multi-baffle Liner，安捷伦)，在其入口端填充约1.5cm长的去活玻璃棉来得到(图1C)，衬管的内径为1.8mm，容积为150μL，使用温度为室温到350℃之间。

本发明的有益效果主要体现在：本发明开创了PTV和高分辨质谱HRMS实际联用的先河，建立了适合高分辨的PTV参数，具有灵敏度极高、实用、易推广的特点。

(四)附图说明

图1为PTV程序升温大体积进样口及本发明改造的液氮冷却装置和衬管；其中A为程序升温PTV进样口，B为装置全景图，C为开口多折流型石英玻璃管；1为PTV程序升温大体积进样口，2为165L液氮罐，3为外径为8.3mm，长2m的铜管，用以传输液氮，外面包裹有保温材料；图2为PTV进样与不分流进样分析实际血样中PCB的对比图；普通不分流进样1ul，PCB123处基本为噪音(a箭头所指)，PCB126处看不到峰(b箭头所指)；PTV进样20μL，PCB126处峰信噪比＞9(c箭头所指)；图3为PTV进样与不分流进样分析实际血样中2378-TCDD的对比；A为普通不分流进样1μL；B为PTV进样20μL，33.28min处2378-TCDD的峰清晰可见，信噪比＞8。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：PTV-HRMS法分析人体血样中的多氯联苯

均匀称取人体血样1～2mL，加入¹³C₁₂标记的12种PCBs同位素内标各2000pg(商品名WP-LCS，购自加拿大wellington公司)，以适量无水硫酸钠搅拌均匀后转入玻璃索式提取器内，用150ml的正己烷-二氯甲烷混合溶液(体积比为1∶1)萃取8h，萃取周期约8min/循环。萃取液经旋转蒸发浓缩至3～5ml。浓缩液依次过酸碱硅胶柱，氧化铝柱净化(每步均浓缩至3～5ml)。浓缩液转移到700μL微量进样瓶后加入约50μL壬烷，以微弱氮气流吹至约50μL，加入进样内标¹³C₁₂标记的PCB101和¹³C₁₂标记的PCB194各2000pg(商品名EC-9605RS，购自加拿大wellington公司)，上机分析。

色谱条件：分离柱：DB-5MS，60m×0.25mm×0.25μm，恒流1.4mL/min。

PTV进样口升温程序：进样口初始压力为1.0kPa、初始温度为50℃、初始温度平衡时间为1.0min；进样后吹扫压力为25.0kPa、吹扫时间为2.50min；溶剂放空时流速为50.0ml/min、放空压力为0.0kPa、放空时间为1.10min；进样口程序升温过程为：先以65℃/min速率升温至115℃，然后以720℃/min速率升温至310℃。

色谱柱升温程序：初始温度50℃平衡1min，以34℃/min升温至110℃，以15℃/min升温至150℃，以3℃/min升温至270℃，保持3min，以15℃/min升温至310℃。

结果见图2。

如图可见，当进样口不分流进样1μL时，native PCB105处峰的信噪比S/N为32.19，以PTV方式进样20μL，native PCB105处峰的信噪比S/N为659.87，意味着PCB105的灵敏度线性地提高到了20倍，这对准确有效地辨别峰并积分提供了保障。

在1μL不分流进样时，选择离子m/z 327.8775对应位置色谱图上看不到峰，无法进行积分；采用PTV方式进样20μL后，对应位置色谱图上得到native PCB126信噪比为S/N＝9.52的峰，这样的灵敏度已经可以满足质控的要求进行积分确认样品中存在native PCB126。

实施例2：PTV-HRMS法分析人体血样中的二恶英和呋喃

均匀称取人体血样1～2mL，加入¹³C₁₂标记的17种PCDD/Fs同位素内标各2000pg(商品名EDF-8999，购自美国剑桥同位素实验室)，以适量无水硫酸钠搅拌均匀后转入玻璃索式提取器内，用150ml的正己烷-二氯甲烷混合溶液(体积比为1∶1)萃取8h，萃取周期约8min/循环。萃取液经旋转蒸发浓缩至3～5ml。浓缩液依次过酸碱硅胶柱，氧化铝柱净化(每步均浓缩至3～5ml)。浓缩液转移到700μL微量进样瓶后加入约50μL壬烷，以微弱氮气流吹至约50μL，加入进样内标¹³C₁₂标记的1，2，3，4-TCDD和¹³C₁₂标记的1，2，3，7，8，9-H_xCDD各2000pg(商品名EDF-5999，购自美国剑桥同位素实验室)，上机分析。

色谱条件：分离柱：DB-5MS，60m×0.25mm×0.25μm，恒流0.8ml/min。

PTV进样口升温程序：初始压力为1.0kPa、初始温度为50℃、初始温度平衡时间为1.0min；进样后吹扫压力为25.0kPa、吹扫时间为2.50min；溶剂放空时流速为50.0ml/min、放空压力为0.0kPa、放空时间为1.10min；进样口程序升温过程为：先以65℃/min速率升温至115℃，然后以720℃/min速率升温至310℃。

色谱柱升温程序：初始温度50℃平衡1min，以65℃/min升温至115℃，以78℃/min升温至220℃，保持15min，以2.3℃/min升温至250℃，以0.9℃/min升温至260℃，以20℃/min升温至310℃，保持12.85min。

结果见图3。

结论：图3为PTV进样与不分流进样分析实际血样中2378-TCDD的对比；A为普通不分流进样1μL，29.58min处积分后峰的信噪比小于3，无法进行定性和定量计算；B为PTV进样20μL，33.28min处2378-TCDD的峰清晰可见，信噪比＞8，可以进行定性和定量计算。