用于由长心卡帕藻集成生产乙醇和海藻液的方法

摘要

本发明涉及由新鲜红色海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)集成生产乙醇和海藻生物肥料的方法。具体地，本发明描述了由长心卡帕藻生产作为副产物的乙醇的方法。该方法包括压榨新鲜藻类以释放汁液(其为一种证明的生物肥料)，并且回收残留的富含角叉藻聚糖的生物质，将所述生物质在升高的温度下用稀酸水解，使用廉价的氢氧化钙中和水解物，并且通过过滤或离心去除不溶的盐，通过电渗析除去水解物的可溶盐，用氮源加富，接种酵母菌并且将其发酵形成包含乙醇的发酵液，并且通过蒸馏由所述发酵液分离乙醇，并且将残余的水解物、所产生的CaSO4和由电渗析得到的淘汰物用作肥料。

说明书

发明领域

本发明涉及由长心卡帕藻(Kapphycus alvarezii)生产乙醇和海藻 液的集成方法。更具体地，本发明涉及用于由富含藻胶的红色海藻长心卡 帕藻生产乙醇的方法。

发明背景

由于乙醇在燃料市场中的高需求，现在乙醇是一种重要的产品。其市 场由1975年的不到十亿升到2006年的超过390亿升，并且预计在2015 年达到1000亿升(Licht 2006)。全球乙醇生产在2000-2005年间超过翻番， 而起始于小得多的基础的生物柴油的生产仅扩张了四倍。相反，在同一时 期，世界油生产仅增加7％。少于4％的乙醇由石油合成生产，而其余的 通过由生物资源发酵生产。现在，乙醇由两大组生物资源生产：糖物质和 淀粉材料。在这两种用于燃料乙醇生产的原料之间存在竞争。在21世纪 前十年开始时，糖物质是多于60％的燃料乙醇生产的原料，到2006年， 其份额减少至47％，此时，谷物占产量的53％(Licht 2006，“World ethanol  markets：The outlook to 2015(世界乙醇市场：2015年展望)，”Tunbridge  Wells，Agra Europe special report(Agra欧洲专题报告)，UK)。

生物燃料的生产和使用已经进入全球增长的新时代。现在使用的两种 主要的生物燃料是乙醇和生物柴油。乙醇易于掺加汽油，生物柴油掺加基 于石油的柴油用于常规以柴油供燃料的机器。目前，乙醇占生物燃料总产 量超过90％，生物柴油占剩余部分。乙醇具有如油市场一样大的潜在的 市场。其可以潜在地代替整个汽油燃料市场。在转酯过程中，甲醇或乙醇 还用于制备生物柴油。

几乎所有的燃料乙醇通过玉米糖和甘蔗废物的发酵产生。世界上糖物 质和谷物的量是有限的，并且对于乙醇生产，它们是相对昂贵的原料。使 用这些物质的生物乙醇生产导致与人类食品的竞争，其可能在将来导致谷 物和糖的价格上涨至较高的水平。基于乙醇的生物燃料通常来源于对玉米 和大豆中存在的碳水化合物进行发酵，这对于生产是廉价的。然而，培育 这些作物需要大面积的田地，这可能替代食物所需要的面积。

由于农业用地的有限可用性，所以重要的是，我们不能忽视海洋环境 作为用于乙醇生产的生物质来源的潜力。已知大型藻类可以容易地培育， 多产性生长，并且汇集碳。另外，海藻的水产养殖减少对海洋的富营养化 (eutrophication)的贡献，因此可以用来减轻污水排出物和工业来源的氮 废物(如来源于鱼类水产养殖的那些)的影响，这有助于生物多样性的维 持或提高。

大型藻类，更常见地称为“海藻”，是多样组快速生长的海洋植物， 并且在潮间带以及浅潮线下水域中以附着到岩石上的形式存在。这些植物 是自养型的，利用来自太阳的能量结合水与二氧化碳(CO₂)来产生碳水化 合物和最终的生物质。在世界范围内，收获这种生物质作为食品来源以及 用于藻胶生产的输出材料。由于对海藻和基于海藻的产品的需求超过野生 原料的供应，在一些亚洲国家中，如中国、日本、菲律宾和韩国，商业性 培育海藻。此外，需求的增长开始刺激对培育方法以及用于海藻资源的可 持续性生产和利用的提取方法的研究和开发。这些海藻可以在面积无限的 海洋中以商业规模生长，并且可以产生巨大的生物质，而无需精确的农业 实践。

这些海藻可以用于生物燃料生产，特别是用于生物乙醇生产，原因在 于，由于下述原因，与生物柴油生产相比，它们更适于生物乙醇生产：

1.一些海藻的碳水化合物含量非常高。

2.与碳水化合物含量相比，海藻中的脂质(油)含量较少，这使得 它们较不适于生物柴油生产。

3.对于乙醇生产，可以使用干/半干的或新鲜的海藻。它们不需要任 何预先处理，如干燥。

4.生物柴油生产需要提取油，对此，材料需要干燥，这是要增加能 量的。

5.通过乙醇发酵产生的CO₂可以用作藻类养殖原料。

红藻是具有高生长速率的全球重要海藻。它们是多样性起源的代表； 更复杂的菌体由细丝组成。现在，卡帕藻属(Kappaphycus)和琼枝藻属 (Betaphycus)红藻是食品工业中使用的角叉菜聚糖的最重要的来源。江 蓠属(Gracilaria)、石花菜属(Gelidium)、鸡毛菜属(Pterocladia)和其 他红藻用于制备广泛用作微生物生长培养基中的胶凝剂和用于生物技术 应用的琼脂。这些藻细胞壁由长链多糖(如具有广泛商业用途的纤维素和 琼脂/角叉菜聚糖)组成。

角叉菜聚糖是由卡帕藻属和琼枝藻属的红色海藻提取的直链硫酸化 多糖家族。角叉菜聚糖由半乳糖和3，6-无水半乳糖单位的钠、钾、镁和 钙硫酸酯组成。可获得三种基本类型的角叉菜聚糖，它们在硫酸化酯的数 目和位置方面不同。这些多糖是大的、高度柔性的分子，在存在单价和二 价阳离子的条件下，其围绕彼此卷曲形成双螺旋结构。这给与它们在室温 下形成多种热可逆性凝胶的能力。在不同的产胶藻(carrageenophyte)中， 基于干重，角叉菜聚糖含量在25-35％变化。角叉菜聚糖在食品和制药工 业中广泛用作增稠剂、稳定剂和胶凝剂。

直至目前，印度的海藻工业单一性地依赖于收集天然原料。主要地， 这集中在马尾藻属(Sargassum)(用于藻酸盐和液态海藻肥料)、可食江蓠 (Gracilaria edulis)(用于低级琼脂)和凝花菜(Gelidiella acerosa)(用于中 高等琼脂)。所有这些在过去的五年里经历了急剧的变化。一方面，长心 卡帕藻适应印度水域，并且由于十年之久的研究结果证明其培育是可行的 (申请日为2005年2月22日的美国专利号US6858430)。该技术随后由 CSMCRI许可，其本身又刺激了在泰米尔纳德邦(Tamil Nadu)的培育行 为，帮助小组和NGOs从最终使用者那里买回保证(guarantee)。在过去 的二十年里，在全世界，包括印度，成功地进行了大规模的产胶藻培育， 因此不缺乏产生角叉菜聚糖的海藻。鉴于海藻在鲜重基础上包含大于90％ 的水分的事实，CSMCRI发明了一种不添加任何的水分液化新鲜海藻的 独特方法(美国专利号6,893,479)。通过这种简单的方法，可以以集成方式 回收两种产物，一种是浓缩的富含角叉菜聚糖的残渣，另一种是富含主要 和微量植物养分的植物汁液(液态海藻肥料-LSF)。为了满足农业需要， 需要大量的长心卡帕藻生物质，这可以通过在海滨和近海滨的培育获得。 回收汁液后，将产生大量富含角叉菜聚糖的残余生物质。当满足对于k- 角叉菜聚糖的原料需求后，残余的生物质可以用于生物乙醇生产。因此， 从海藻中回收多种产物使得培育在经济上更可行。良好的培育实践可以证 明卡帕藻属是用于乙醇生产的较廉价的原料。从基于海藻的工业的大量扩 张同时聚焦可持续性的观点看来，这些开发是非常重要的。

通常针对使用食品作物的大规模燃料生产的主要批判在于这可能使 农业生产背离食品作物，特别是在发展中国家中。事实在于能量作物计划 与食品作物竞争对农业用地、水、肥料、专业劳动力等的使用，这导致食 品价格上涨。此外，培育用于生物燃料生产的作物对生物多样性有影响。 因此，急需鉴定一种克服所有这些局限的用于生物乙醇生产的替代资源。 海洋藻类/海藻是理想的选择，原因在于它们生长在海洋中，在海洋中有 巨大的培育面积可用，并且由于高生长速率，无需专门的农业实践即可产 生巨大的生物质，因此减轻对农业用地的压力。除了这些之外，它们富含 碳水化合物，并且因此是生物乙醇生产的理想资源。

现有技术

可以参考属于Eswaran等的名称为“Integrated method for production  of carrageenan and liquid fertilizer from fresh seaweeds(从新鲜海藻生产角 叉菜聚糖和液态肥料的集成方法)”的美国专利号6,89,3479(2007)，他们 已经公开了一种由长心卡帕藻的新鲜生物质获得多种产物并且由此提高 海藻的价值的集成方法。这些产物为：i).汁液，其为一种潜在的液态生 物肥料，和ii).粒状富含角叉菜聚糖的残余材料。这种残余材料是用于提 取k-角叉菜聚糖的原料。该专利的缺点在于利用残余材料仅用于一种产 物，即k-角叉菜聚糖的制备。没有提及利用富含角叉菜聚糖的粒状残余 材料来生产乙醇。

可以参考Maleszka等在Enzyme and Microbial Tech.(酶和微生物技 术)(1982)4(5)：349-352中题目为“Ethanol production from D-galactose and  glycerol by Pachysolen tannophilus(通过嗜单宁管囊酵母(Pachysolen  tannophilus)由D-半乳糖和甘油制备乙醇)”的论文，他们描述了由先前 认为不发酵的糖类如D-半乳糖和甘油生产乙醇。他们研究由单糖如D-半 乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或D-木糖或甘油生产乙醇。他们报道嗜单宁 管囊酵母将上文提及的所有主要植物单糖转化成乙醇。他们还阐述该酵母 菌具有将来源于藻类的甘油发酵成乙醇的能力。该论文的缺点在于使用植 物单糖作为乙醇生产的底物。没有提及关于海洋藻类或海洋藻类多糖用于 乙醇生产的应用。

可以参考属于M Benjamin名称为“Methods and compositions for  producing metabolic products for algae(用于生产藻类代谢产物的方法和组 合物)”的美国专利号5270175(1993)，其公开了转化并且利用转化的海 洋大型藻类细胞生产乙醇。他们选择浒苔属(Enteromorpha sp.)，依据是 其快速生长和在两个月内在生长池中形成稠密垫的能力。他们由浒苔属制 备原生质体，并且通过插入在高表达启动子基因控制下的醇脱氢酶基因和 /或丙酮酸脱羧酶而修饰藻细胞。他们将产生醇的转化体在200ml海水培 养基中培养，并且在浅池中每2-3天将该培养物用海水充满5-7次。他们 报道藻细胞代谢途径中至少一种酶的过量表达导致产生代谢产物。该专利 的缺点在于：a)使用淀粉是主要多糖的遗传修饰的海藻，b)遗传转化是 复杂的过程，并且需要持续监测，c)由于植物的转基因性质，在其应用 前必须清楚调控规范。没有提及关于使用长心卡帕藻进行乙醇生产。此外， 乙醇不是作为副产物生产。

可以参考属于Ueda等名称为“Process for the production of ethanol  from microalgae(由微藻生产乙醇的方法)”的美国专利号US5578472 (1996)，其公开由微藻生产乙醇的方法。他们培养能够在细胞中积聚淀粉 的莱茵衣藻(Chlamydomonas feinhardtii)UTEX2247，收集藻细胞，浓缩 包含生长的藻细胞的藻培养液，从而获得藻细胞汁液，并且将在汁液中的 浓缩的藻细胞保持在暗处和厌氧气氛中以在6.0-9.0的pH范围以内形成 乙醇。他们将残余汁液进行甲烷发酵，燃烧其产生二氧化碳，二氧化碳用 在微藻培养步骤中。缺点为：a)使用微藻，b)在藻细胞中积聚的淀粉是 用于乙醇生产的底物，c)发酵过程在黑暗条件下进行。没有提及使用大 型微藻多糖(藻胶)作为乙醇生产的底物。

可以参考Hirano等在Energy(能量)(1997)22：137-142中题目为“CO₂fixation and ethanol production with microalgal photosynthesis and  intracellular anaerobic fermentation(利用微藻光合作用和细胞内厌氧发酵 进行CO₂固定和乙醇生产)”的论文，他们已经检验了微藻的乙醇生产力。 在从海水中分离多于200株微藻藻株并且筛选它们的生长速率、淀粉含量 和乙醇生产力后，鉴定普通小球藻(Chlorella vulgaris)(IAM C-534)关于 其淀粉含量(即37％)是最有希望的一种。他们从小球藻属(Chlorella) 细胞中提取淀粉，将淀粉糖化，用酵母菌发酵，并且获得65％的乙醇转 化。他们还检验了另一种类型的乙醇生产方法，即，在黑暗和厌氧条件下 的细胞内淀粉发酵。他们报道所有检测的藻株表现出细胞内淀粉降解和乙 醇产生。最后，他们推论出细胞内乙醇生产比常规乙醇发酵生产更简单和 能量密集。该论文的缺点为：a)使用微藻，b)使用提取的微藻成分淀粉 作为底物，c)利用在黑暗和厌氧条件下的细胞内淀粉发酵。没有提及使 用海藻或由海藻获得的富含角叉菜聚糖的物质作为乙醇生产的底物。

参考Ueno等在J.of Fermentation and Bioengineering(发酵和生物工 程杂志)(1998)86(1)：38-43中题目为“Ethanol production by Dark  Fermentation in the Marine Green alga，Chlorococcum littorale(通过在海洋 绿藻绿球藻(Chlorococcum littorale)中的黑暗发酵生产乙醇)”的论文， 他们已经研究了在海洋绿藻绿球藻(Chlorococcum littorale)中的黑暗发 酵，重点在于乙醇生产。他们报道在25℃在黑暗厌氧条件下在24小时内 消耗27％的细胞淀粉，通过其产生作为发酵产物的乙醇、乙酸、氢气和 二氧化碳。他们已经在30℃获得450微摩尔/g-干重的最大乙醇生产力。 该论文的缺点在于：a)利用具有作为碳水化合物的淀粉的微藻，c)发酵 过程在黑暗厌氧条件下进行生产乙醇。他们不使用微藻，特别是红色海藻。 也没有提及利用酵母菌或细菌进行发酵。

Hirayama等在他们在Studies in Surface Science and Catalysis(表面科 学和催化研究)(1998)114：657-660中的题目为“Ethanol production from  carbon dioxide by fermentative microalgae(通过发酵的微藻由二氧化碳生 产乙醇)”的论文中已经描述了从固定二氧化碳的可发酵微藻生产乙醇。 他们筛选了多于200株来自于海水的微藻藻株，筛选其通过自发酵的CO₂固定和乙醇生产。还检测分离株的生长速率、淀粉含量、和由胞内淀粉到 乙醇的转化率。基于其较高的生长速率(30g-干生物质/m².d)、淀粉含量 (基于干重的30％)和在黑暗和厌氧条件下由淀粉到乙醇的较高的转化 率(50％)，他们选择极好的藻株中的一种，衣藻属物种(Chlamydomonas  sp.)YA-SH-1。他们培育衣藻属物种，收集并且允许自发酵。最后，他们 从发酵液中提取乙醇。该论文的缺点在于：a)使用具有较高淀粉含量的 微藻，b)使用在黑暗条件下的自发酵方法。没有提及利用除淀粉外还具 有多糖的微藻，特别是红色海藻，进行乙醇生产并且没有作为副产物产生 乙醇。

可以参考Svein Jarle Horn于2000年投向挪威Trondheim的挪威科技 大学(Norwegian University of Science and Technology，NTNU)生物技术系 的题目为“Bioenergy from brown seaweeds(来自褐色海藻的生物能量)” 的Ph.D论文，其进行关于使用北方海带(Laminaria hyperborea)和泡叶 藻(Ascophyllum nodosum)生产能量的研究。在该工作中，从北方海带 叶提取的海带多糖和甘露醇用作乙醇生产的底物。他使用棕榈发酵细菌 (Zymobacter palmae)从甘露醇生产乙醇，其不能利用海带多糖。然而， 酵母Pichia angophorae能够同时从这两种底物生产乙醇。最后，他从褐 色海藻生产了甲烷和乙醇。据此，如果收集成本低，从海藻生产能量将是 经济的。可以注意到，来自藻酸盐工业的废物可以被认为是用于能量生产 的无成本原料。该工作的缺点在于使用褐色海藻。没有提及使用红藻作为 乙醇来源，没有作为副产物产生乙醇。

可以参考Horn等在J.of Industrial Microbiology and Biotechnology(工 业微生物学和生物技术杂志)(2000)25：249-254中题目为“Ethanol  production from seaweed extract(由海藻提取物的乙醇生产)”的论文，他 们已经报道由褐色海藻提取物生产乙醇。他们在pH 2.060℃1小时由培 育的北方海带的新鲜叶制备水性提取物。该提取物包含甘露醇和海带多 糖，产率为基于鲜重2％。使用四种微生物，一种细菌和三种酵母菌在批 次和连续培养物中发酵。他们在批次培养物中获得0.43g/g底物的乙醇产 率。该论文的缺点在于：a)损失(sacrificing)整个褐藻北方海带的植株， 和b)使用由甘露醇和海带多糖组成的海藻提取物作为糖底物。他们没有 使用红藻进行乙醇生产。此外，没有提及作为副产物生产乙醇。

可以参考Matsumoto等在Appl.Biochemistry and Biotechnology(应用 生物化学和生物技术)(2003)105：247-254中题目为“Saccharification of  marine microalgal biomass for bioethanol production using marine bacteria (使用海洋细菌糖化海洋微藻生物质进行生物乙醇生产)”的论文，他们 报道使用海洋细菌糖化海洋微藻多糖的方法。在分离的191株海洋细菌 中，鉴定水蛹假交替单胞菌(Pseudoalterimonas undina)是在盐水条件下 糖化最有潜力的细菌培养物。使用绿色微藻NKG 12070，其具有最高的 细胞内碳水化合物(如淀粉)浓度。在将水蛹假交替单胞菌接种到藻细胞 悬浮液中后，由于淀粉酶产生，观察到还原糖浓度的增加。缺点在于：a) 使用淀粉是主要碳水化合物的微藻作为原料，b)他们利用酶过程进行糖 化。没有提及使用海藻进行乙醇生产。

可以参考属于Woods等名称为“Genetically modified cyanobacteria for  the production of ethanol，the constructs and method thereof(用于生产乙醇 的遗传修饰的蓝藻，构建体及其方法)”的美国专利号US6699696(2004)， 他们已经公开由遗传修饰的蓝藻(cyanobacteria)、特别是聚球藻属 (Synechococcus)生产乙醇的方法。他们将获自运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)的编码丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的DNA片段构建 在pLOI295质粒中。这两种酶是由糖酵解途径产物丙酮酸产生乙醇所必 需的。将收集的蓝藻细胞通过结合所述构建体进行修饰，并且接种在含有 氨苄青霉素的平板中，以选择转化的氨苄青霉素抗性蓝藻细胞。这些修饰 的聚球藻属细胞能够以至少1.7μmol乙醇/mg叶绿素/小时的可回收的量 产生乙醇。该专利的缺点在于：a)使用微藻，特别是需要精确的专业知 识和连续监测的遗传修饰的聚球藻属。没有提及使用海藻进行醇生产。

可以参考属于Bush等名称为“Process for the production of ethanol  from algae(从藻类生产乙醇的方法)”的美国专利号US7135308(2006)， 他们已经公开了一种生产乙醇的方法，该方法通过从天然水域地点收集积 聚淀粉的、形成细丝的或形成群落的藻类来形成生物质，起始细胞腐烂， 发酵并且从发酵液分离乙醇。他们将藻类生物质保持在黑暗和厌氧条件 下，以起始生物质的腐烂，然后接种酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)来形成发酵溶液，从 该发酵溶液分离所产生的乙醇。该专利的缺点在于：a)由于他们使用天 然微藻繁殖物，因此使用的是混合的藻类培养物，b)使用微藻成分淀粉 作为底物。由于实验使用微藻繁殖物进行，因而他们没有使用纯的微藻培 养物。没有提及下述：a)在发酵前，淀粉水解成简单的糖，和b)使用微 藻进行乙醇生产，并且乙醇不是作为另外的产物生产。

可以参考Jessica等(2008)发表在Journal of Applied Phycology(应用 藻类学杂志)(DOI 10.1007/s10811-008-9384-7)中的题目为“Fermentation  study on Saccharina latissima for bioethanol production considering variable  pretreatments(考虑到可变的预先处理，关于Saccharina latissima对于生 物乙醇生产的发酵研究)”的论文，他们描述了藻类的酶预处理对利用褐 藻糖海带(糖海带(Laminaria saccharina))的生物乙醇生产的影响。昆 布多糖和甘露醇是除海藻酸外从褐藻门(pheophyta)获得的主要糖水化 合物。所有三种碳水化合物的量随季节和植物的生命周期变化。昆布多糖 由具有少量β-1，6-连接的β-1，3-连接的葡萄糖残基组成。该多糖在不同 pH和温度条件下容易用昆布多糖酶水解。然而，在23℃pH 6用酶处理 样品获得最大乙醇产量(0.49％)。该论文的缺点在于：a)损失整个海藻， b)由于pH调节在预处理过程中在水解产物中产生高盐含量，这妨碍乙 醇生产，c)乙醇不是作为另外的产物产生。

可以参考2007年3月东京海洋科技大学(Tokyo University of Marine  Sciences and Technology)三菱研究所(Mitsubishi Research Institute)在 www.pinktentacle.com/2007/03/seaweed-as-biofuel的研究，该研究公布了由 培育的海藻大规模生产生物乙醇的挑战性提案的详细内容。据此，海藻长 期被讨论作为典型地由作物如甘蔗和玉米制备的生物乙醇的一种潜在的 来源，但是想法从未成为现实。据此，马尾藻属海藻由于其较高的生长速 率以大规模培育，然后将藻多糖如岩藻多糖和海藻酸酶糖化，随后发酵产 生乙醇。据此，除了产生乙醇之外，海藻还将通过减少海洋中存在的过量 的营养物而有助于清理日本海。该提案的缺点在于：1.使用褐藻进行乙 醇生产，2.损失整个海藻进行乙醇生产，3.用褐藻马尾藻属替代食品藻 类(如紫菜(nori)和裙带菜(wakame))的培育，4.应用相对较慢的酶 糖化方法。他们没有提及使用红藻，没有提及作为副产物生产乙醇。

可以参考专业机械杂志(The professional Journal engineer)在其于 2008年1月7日发表在 (http://www.ambathen.um.dk/da/menu/OmOs/Klimaforandringer/DENMARK  LOOKSTOTURNACOMMONSEAWEEDINTOBIOFUELhtm？WBCMODE＝Pre％2CPresentationU中的题目为“Denmark looks to turn a common  seaweed into biofuel(丹麦希望将普通海藻转化成生物燃料)”的论文，其 提及资助评估由海莴苣(sea lettuce)(海藻)生产生物乙醇的潜力的项目。 他提及，绿藻石莼(Ulva lactuca)具有生产生物乙醇的潜力。他指出奥 尔胡斯大学(University of Aarhus)国家环境研究所(National  Environmental Research Institute)Michael Bo Rasmussen的观察，其中他 提及海莴苣作为由非食品生物质资源而不是谷物作物(如玉米和玉蜀黍 (maize))制备生物乙醇的丰富潜在资源。

可以参考Hiroshi Yamazaki在2008年6月1日在 http://bioenergy.checkbiotech.org/news/2007-06-27/Japan_experiments_with_ new_biofuels/的题目为“Japan experiments with new biofuels (日本使用新 生物燃料的实验)”的论文，其报道日本公司已经开始将生物乙醇燃料引 入市场，以希望显著减少CO₂的释放。他还补充，国内生物燃料生产， 特别是由可食用的材料的生物燃料生产，似乎是遥远的目标。然而，使用 新材料(包括海藻和木屑)的有希望的实验正引起注意。

近来，在http://www.eurozone-invest.com/biofuel.html上的文章描述使 用海藻或藻类来生产生物乙醇和生物柴油。据此，培育用于生物柴油生产 的藻类更难，原因在于它们需要特定的环境获得高生产力，并且可能容易 受不需要的物种的污染。另一方面，海藻和藻类富含复合糖类，如淀粉， 其量高于存在的油。通过转化和发酵，这种多糖转化成乙醇。

可以参考Aizawa等在Oceans 2007中题目为“Seaweed Bioethanol  Production in Japan-The Ocean Sunrise Project(日本的海藻生物乙醇生产- 海洋朝阳工程)”的论文，其阐述该工程目的在于通过利用日本专属经济 区(EEZ)和领海带的447万km²(世界第六大)的未使用面积来养殖和收 集铜藻(Sargassum horneri)而生产海藻生物乙醇。他们还补充，通过海 藻生物乙醇生产，该工程目的在于通过贡献化石燃料的替代能源而防止全 球变暖。该论文概述了由Tokyo Fisheries Promotion进行的项目可行性研 究的结果。该论文的缺点在于：a)使用铜藻生产乙醇。他们没有进行乙 醇生产，没有提及从红藻细胞内化合物提取半乳糖。

2008年6月2日在 http://www.prensa-latinaenglish.com/article.asp？ID＝％7B6392ED95-9842-486E-￥B4E5-676A4FA23D61％7D)&language＝EN上题目为“seaweed biofuel  developed(开发的海藻生物燃料)”的最近的报道描述由海藻制备的生物 燃料可能是由食品作物获得的与食品价格上涨相关的乙醇的替代品。在该 文章中，Bernard Stroazzo(Bio Fuel-System(生物燃料系统)的总裁)阐 述由海藻生产生物燃料是有希望的，产物既不影响环境也不会使人群食物 供给处于危险中。据此，与其他生物燃料相比，海藻具有非常有效的光合 作用系统，回收100％的太阳能。然而，最大问题在于研究者鉴定适宜的 海藻物种，从其可能产生大量的生物燃料。

Ricardo Radulovich在其2008年6月10日在COSMOS杂志 (http://www.cosmosmagazine.com/node/2040)中题目为“Let′s use seaweed as  fuel(让我们使用海藻作为燃料)”的文章中提到海藻通常用作食品、肥 料和动物饲料，但是也可以用作主要燃料。他还指出使用海藻进行生物燃 料生产的优点，如不需要土壤和水。

私有公司Algenol致力于广泛的研究和开发，尝试开发工业规模的生 产系统，以使用海水和大量的CO2由荒芜的田地上的藻类制备乙醇。 Algenol通过自然选择、环境选择和产生低成本和环境安全性生物燃料的 分子生物学工具而使用蓝藻(蓝绿藻)。如同所有植物，藻类利用光合作 用将太阳能转化为以油、碳水化合物和蛋白形式储备的化学能。Algenol 的专利技术从四种丰富的且实际上无限的可再生资源生产乙醇：藻类、阳 光、二氧化碳和海水。该过程的输出是乙醇、氧气、淡水和农业肥料。 Algenol的方法具有巨大的积极的能量平衡，并且不需要种植、收集、原 料运输、基于化石燃料的肥料并且在生长或乙醇生产过程中不释放CO2 (http://ww.algenolbiofuels.com/default.html)。该公司相信，其基于海水的方 法可以产生6,000加仑/英亩/年，与此相反，玉米和甘蔗分别产生约360 和890加仑/英亩。在该过程中，藻类通过光合作用消耗阳光和多于90％ 的系统CO₂，其中糖类被转化成乙醇。乙醇被立即泵出并且蒸发到生物反 应器中，其每个夜晚被捕获。该发明的缺点在于：使用蓝绿藻而不是海藻。 也没有提及作为副产品生产乙醇。

KBS World Radio于2008年6月17日公布题目为“Researchers produce  bioethanol with seaweed(研究者用海藻生产生物乙醇)”的报道。据此， 韩国海洋研究和开发研究所(The Korean Ocean Research and Development  Institute)声称该研究所与Gangwon National University的研究者联合使用 在Jeju岛海岸发现的一种类型的海藻生产生物乙醇。该研究所计划推动 并将研究进行到底，以使该技术商业化。

根据2008年6月23日在 http://dsc.discovery.com/news/2008/06/23/ireland-seaweed-ethanol.html dated  June 23公布的报道，其引用Discovery News，“Seaweed power：Ireland  Taps new energy source(海藻能量：爱尔兰选择新能源)”，Galway爱尔 兰国立大学(National University of Ireland)爱尔兰海藻中心(Irish Seaweed  Center)主任Stephan Khan(一位爱尔兰科学家)描述爱尔兰可能成为由 海藻生产生物燃料的主要扮演者。据此，藻类没有陆地生物质资源的负面 形象，认为其对较高的食品价格负责，影响水的使用并且破坏雨林。国际 应用藻类学学会(International society for Applied Phycology)正检验使用 褐色海藻生产生物乙醇的经济和社会方面。

农业综合产业通讯记者Ray Ryan撰写了题目为“Seaweed offers bright  future for biofuel industry(海藻提供生物燃料工业的光明未来)”的文章， 于2008年6月24日发表在网站 http://www.examiner.ie/story/business/gbojqlcwoj/rss2/上。参考上述，他讲 述利用其丰富的、可持续的海藻资源，爱尔兰准备好成为下一代生物燃料 生产中的重要扮演者。

Seaweedireland.com在http://dezeewierwinkel.nl/bio-fuel.html发表关于 生物燃料、生物气体、电和热的文章，该文章讲述海藻可以被小的微生物 分解，从而产生不同类型的醇。

发明目的

本发明的主要目标是提供由长心卡帕藻集成生产海藻液和乙醇的方 法，所述方法克服上述缺点。

本发明的另一个目标是提供由红色海藻生产作为副产物的生物乙醇 的方法。

本发明的另一个目标是提供由红色海藻、特别是由产胶藻类生产生物 乙醇的方法。

本发明的另一个目标是由产胶藻类、特别是长心卡帕藻生产生物乙 醇。

本发明的另一个目标是在压榨和回收海藻液后从由新鲜长心卡帕藻 产生的富含角叉菜聚糖的颗粒生产生物乙醇。

本发明的另一个目标是稀硫酸和升高的温度用于海藻水解将海藻多 糖转化为单糖的应用。

本发明的另一个目标是通过向水解物中反复添加新鲜藻类生物质而 将糖浓度增加至10％。

本发明的另一个目标是使用固体氢氧化钙来中和糖溶液中的硫酸。

本发明的另一个目标是通过过滤或离心去除不溶性CaSO₄。

本发明的另一个目标是通过电渗析(ED)去除糖溶液的可溶盐。

本发明的另一个目标是在灭菌前用氮源如蛋白胨、酵母提取物或麻疯 树属团块(Jatropha cake)的蛋白水解物加富水解物。

本发明的另一个目标是在灭菌的糖溶液中接种酿啤酒酵母，即，培养 号为NCIM 3455(ATCC 26602)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明的另一个目标是发酵糖溶液产生乙醇。

本发明的另一个目标是通过蒸馏从发酵液中分离生物乙醇以及生物 乙醇的浓缩。

本发明的另一个目标是使用乙醇蒸馏后的残余物质，连同中和过程中 产生的CaSO₄和ED过程中包含K₂SO₄作为主要可溶盐的淘汰物作为肥 料。

发明概述

因此，本发明提供用于由长心卡帕藻生产乙醇和海藻液的集成方法， 所述方法包括下述步骤：

(a)从海洋中收集培育的红色海藻；

(b)从新鲜卡帕藻属提取汁液，以释放出液态植物养分，留下富含角 叉菜聚糖的残余颗粒物质；

(c)洗涤所述残余颗粒，以去除盐和泥沙；

(d)使用0.5-5％范围以内的稀硫酸水解富含多糖的颗粒，并且在 80-200℃范围以内将溶液加热30-90分钟，以获得富含还原糖的水解物；

(e)通过过滤或在5000-7000rpm范围以内离心15分钟回收溶液；

(f)通过向所述过滤的溶液中添加新鲜长心卡帕藻颗粒而增加水解物 中的糖浓度，并且重复步骤(d)和(e)，直到糖浓度在2-10％范围以内；

(g)用碱如氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙和氢氧化钾调节水解物的pH 在4.5-8.0范围以内；

(h)通过过滤或在5000-7000rpm范围以内离心15分钟而分离不溶性 盐；

(i)通过电渗析将水解物脱盐，以去除可溶盐；

(j)用0.2-2.0％范围以内的氮源如蛋白胨、酵母提取物和麻疯树属团 块的蛋白水解物加富(enriching)所述水解物，然后将其在121℃灭菌15 分钟；

(k)在所加富的水解物中接种培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602) 的酿酒酵母，并且在25-35℃温育24-96小时范围以内的时间；

(l)监测乙醇生产；

(m)通过蒸馏从发酵液中分离乙醇；

(n)通过蒸馏浓缩乙醇。

在本发明的一个实施方案中，使用属于红藻门(Rhodophyta)种类和 卡帕藻属的产角叉菜聚糖的大型藻类进行乙醇生产，其中除海藻液之外， 乙醇作为来自富含角叉菜的颗粒的另外的产物产生。

在本发明的另一个实施方案中，糖化步骤包括在升高的温度下富含角 叉菜聚糖的颗粒的酸水解，其中在80-200℃范围以内的温度下通过0.5％ -5.0％范围以内的稀硫酸处理30-90min范围以内的时间，多糖被部分水 解成单糖，如半乳糖。

在本发明的另一个实施方案中，通过在相同溶液中反复水解新鲜颗 粒，最终水解物的还原糖浓度由2.0％增加至10％。

在本发明的另一个实施方案中，糖溶液保持在2％-10％范围以内。

在本发明的另一个实施方案中，回收的糖溶液具有0.6-1.0范围以内 的pH。

在本发明的另一个实施方案中，在中和步骤过程中产生的不溶性 CaSO₄通过在真空下过滤或以7000rpm离心15分钟去除，而可溶盐通过 电渗析方法去除。

在本发明的另一个实施方案中，水解物用浓度在0.2-2.0％范围以内的 氮源如蛋白胨和酵母提取物或麻疯树属团块的蛋白水解物加富。

在本发明的另一个实施方案中，在高压灭菌的水解物中接种标准酿啤 酒酵母菌，即培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602)的酿酒酵母的活性培 养物。

在本发明的另一个实施方案中，将接种的海藻水解物在有氧和厌氧条 件下在25-35℃范围以内培养24-96小时范围以内的时间，以将糖发酵为 乙醇。

在本发明的另一个实施方案中，通过蒸馏从发酵液分离生物乙醇。

在本发明的另一个实施方案中，将蒸馏后残余的发酵液连同在中和过 程中产生的不溶性CaSO₄和电渗析过程的淘汰物用作肥料。

在本发明的另一个实施方案中，最终水解物包含作为单糖的半乳糖、 部分水解的寡糖和未水解的角叉菜聚糖。

在本发明的另一个实施方案中，使用氢氧化钙将水解物的pH调节至 4.5-8.0的范围。

在本发明的另一个实施方案中，沉淀的硫酸钙通过过滤或离心去除。

在本发明的另一个实施方案中，使用电渗析法将水解物脱盐，以去除 可溶盐。

在本发明的另一个实施方案中，将最终水解物用蛋白胨和酵母提取物 或麻疯树属团块的蛋白水解物加富，以提供使生物发酵的氮源。

在本发明的另一个实施方案中，将培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602)的酿酒酵母接种在发酵液中，并且在30℃开始在有氧条件下然后 在厌氧条件下温育24-96小时范围以内的时间。

在本发明的另一个实施方案中，发酵过程中的乙醇生产通过GC-MS 监测。

在本发明的另一个实施方案中，从发酵液浓缩并蒸馏乙醇。

附图简述

图1电渗析过程的示意流程图。

发明详述

本发明的目的是生产生物乙醇，更具体地是提供一种通过发酵大型藻 类生物质生产乙醇的方法。本发明涉及开发通过利用红藻藻胶作为原料使 用红藻生产生物乙醇的方法。在本发明中，首次从红色海藻、特别是长心 卡帕藻中生产作为副产物的生物乙醇。红色海藻是快速生长的海洋植物， 其包括可降解的多糖，主要是琼脂或角叉菜聚糖。

生物乙醇的方法通常包括糖化和发酵。糖化通常通过浓酸/稀酸水解 和酶水解进行，然后使用细菌或酵母菌发酵。糖化通过在80-200℃范围 以内的温度下使用0.5％-5.0％范围以内的硫酸将藻类生物质进行稀酸水 解30-90分钟范围以内的时间而进行。由于角叉菜聚糖的高硫酸含量，这 导致角叉菜聚糖转化为半乳糖，同时产生可溶盐。通过在类似条件下在相 同溶液中处理新鲜的生物质而增加回收的水解物的还原糖浓度。重复该过 程3-5次，从而获得在2-10％范围以内的所需要的还原糖浓度，这使用 Nelson法分光光度监测。糖浓度的增加导致最终水解物中可溶盐浓度的 增加。使用氢氧化钙将得到的滤出液的pH调节至4.5-8.0的范围以内。

在中和过程中产生的不溶性硫酸钙沉淀通过过滤或在5000-7000rpm 范围以内离心15分钟去除，而可溶盐通过电渗析方法去除。在该过程中， 将电渗析堆(electrodialysis stack)用本实验室制备的共聚物型的5膜对 (cell pairs)的阳离子和阴离子交换膜装填。在膜堆(stack)中使用平行 流。该膜堆的单一有效膜面积是80cm²。海藻水解物通过ED膜堆的产物 (稀释物)区室循环。同时，水通过浓缩物区室循环。所有实验通过使用 适当的泵以分别为3.0L/h的产物和浓缩物流的循环流速进行。硫酸钠稀 溶液通过在末端的两个电极区室循环，以洗涤出电渗析产物。通过AC-DC 整流器方式在两个电极之间应用电势(7.5V)。稀释物和浓缩物流二者的循 环持续至所有溶解的盐淘汰物达到初始量的约90-95％。以规律的区间流 (intervals current)，记录电压和TDS。在实验结束时，分析稀释物和浓 缩物流的检测样品的TDS、传导率、pH、氯化物、硫酸盐、硬度、钠、 钾等。

电渗析过程后，将包含单糖、部分水解的寡糖或未水解的多糖的最终 水解物用0.2-2.0％范围以内的氮源如蛋白胨、酵母提取物或麻疯树属团块 的蛋白水解物加富，高压灭菌并且通过接种培养物号为NCIM 3455 (ATCC 26602)的酿酒酵母并将其在25-35℃培养24-96小时范围以内的时 间，从而将其单糖转化为乙醇。使用耦合GC-MS(QP 2010)的GC-MS (Shimadzu GC：2010)通过顶部空间(AOC-5000)分析仪监测乙醇生产，其中 测量发酵溶液的还原糖，从而确定发酵效率。最后，通过蒸馏从发酵溶液 分离所产生的乙醇，并且将残留物质用作肥料。

通过蒸馏从发酵液中回收生物乙醇，尽管所回收的乙醇不是燃料级别 的，但是可以通过如蒸馏、膜纯化、化学干燥的方法、或各种方法的组合 将其浓缩而转化成燃料级别的。

最后，本发明描述使用红色海藻的半乳糖以副产物生产生物乙醇。

本发明中采用的创造性步骤为：i)开发了一种从红色海藻中生产海 藻液和乙醇的集成方法，ii)作为副产物产生乙醇，iii)使用红色海藻作 为乙醇生产的原料，iv)使用红色海藻富含角叉菜聚糖的原料的硫酸化多 糖作为乙醇来源，v)用硫酸水解富含角叉菜聚糖的原料，用以将多糖转 化为单糖，vi)通过在相同的溶液中重复新鲜颗粒的水解而增加水解物的 糖浓度，vii)使用氢氧化钙进行中和，viii)通过过滤或离心去除所产生 的不溶性CaSO₄，ix)通过电渗析方法除去所述水解物的可溶盐，ix)用 氮源加富所述水解物，x)用培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602)的酿酒 酵母活性生长的酵母菌培养物发酵液体，xi)通过蒸馏回收乙醇，和xii) 使用包含硫酸钾和硫酸钠的电渗析的淘汰物连同在中和过程中产生的 CaSO₄和乙醇蒸馏后的残留物质作为肥料。

实施例

下述实施例通过举例说明的方式提供，因此不应该解释为限制本发明 的范围。

实施例1

从新鲜的卡帕藻属回收液体汁液后，洗涤残留的颗粒并且干燥。将已 知重量的干燥颗粒用稀硫酸在升高的温度下指定时间而进行糖化。分别通 过苯酚-硫酸法和Nelson′s法测量水解物中的全部的糖和还原糖。用于糖 化的条件和在糖化过程中产生的糖详见表1和2。

表1：

表2：

如在实施例1中所述，富含角叉菜聚糖的原料的较低浓度的酸和一次 性提取在水解物中产生低浓度的糖。为了在水解物中获得高的糖浓度，用 新鲜原料进行反复提取，如在实施例2中所述。

实施例2

为了在水解物中获得最大的还原糖浓度，将20g洗涤并且干燥的长心 卡帕藻颗粒在1000ml 0.5％的硫酸中提取。将水解物过滤，并且向前一循 环滤出液中加入相同量的新的新鲜颗粒，并且在相似条件下水解。相似地， 重复该循环三次。表3提供在每个循环中得到的糖浓度。

表3

此处，从60g颗粒中回收13.44g总还原糖，所述60g颗粒等价于48g 角叉菜聚糖(在去除水分和纤维含量(20％)后)。因此，28％的角叉菜聚糖 被转化为单糖。

为了提高水解效率和糖浓度，使用较高的酸浓度和重复提取，这产生 多糖到单糖的更好的转化，如在实施例3中所述。

实施例3

为了在水解物中获得最大的还原糖浓度，50g新鲜颗粒在1000ml 2.5％硫酸中提取，并且将新鲜颗粒加入到前一循环的滤出液中，并且在 相似条件下水解。相似地，重复该循环三次。表4提供在每个循环中得到 的糖浓度。

表4

此处，从150g颗粒中回收44.2g总还原糖，所述150g颗粒等价于120g 角叉菜聚糖(在去除水分和纤维含量(20％)后)。因此，36.8％的角叉菜聚 糖被转化为单糖。

实施例4

在长心卡帕藻颗粒酸水解后得到的糖化溶液本质上是酸性的，用固体 氢氧化钙将其pH调节至5.5-6.5。所得到的沉淀物通过过滤去除，滤出液 在将其用0.5％蛋白胨和0.5％酵母提取物加富、将其高压灭菌并且将其接 种酿啤酒酵母菌后用于发酵，所述酿啤酒酵母菌购自当地市场并且在葡萄 糖酵母提取物琼脂上纯化。所接种的培养液(培养液1和培养液2)，具 有不同的初始糖浓度，将其在摇床上培养24小时，从而在开始时给培养 物提供有氧条件，然后在厌氧和静置条件下进一步继续培养两天。之后每 24小时用GC-MS测量乙醇的形成。此外，使用HPLC证实半乳糖的利用， 其中发酵液中半乳糖峰随着温育时间消失。表5解释了由长心卡帕藻颗粒 得到的还原糖到乙醇的转化。标准乙醇(0.1％)用作定量测量的参照。 如表5所示，仅有17-23％的初始糖转化成乙醇。

表5

实施例5

在长心卡帕藻颗粒酸水解后得到的具有不同的初始糖浓度的糖化溶 液本质上是酸性的，用固体氢氧化钙将其pH调节至5.5-6.5。所得到的沉 淀物通过离心或过滤去除，滤出液在将其用0.5％蛋白胨和0.5％酵母提取 物加富、将其高压灭菌并且将其接种酿啤酒酵母菌后用于发酵。所接种的 培养液在摇床上培养24小时，从而在开始时给培养物提供有氧条件，然 后在厌氧和静置条件下进一步继续培养两天。之后每24小时分别用 GC-MS和Nelson’s方法测量乙醇的形成和还原糖的利用。表6列出了还 原糖到乙醇的转化。

表6

此处，由于多种其他产物也与乙醇一起产生，如丁醇、甲基丁醇、异 丁醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯等，据报道它们是糖发酵过程中的副产物，因 此仅有32-38％所利用的糖转化为乙醇。

用于该实验的酿啤酒酵母菌可能不适于乙醇发酵，因此从NCIM， NCL，Pune获得酿酒酵母的两种标准酵母菌培养物，并且使用它们进行 实验以鉴定最有希望的一种，这记述在实施例6中。

实施例6

在长心卡帕藻颗粒酸水解后得到的糖化溶液具有不同的初始糖浓度， 其中用固体氢氧化钙将pH调节至5.5-6.5。去除沉淀物后得到的澄清溶液 在将其用氮源如0.5％蛋白胨和0.5％酵母提取物加富、将其高压灭菌并且 将其接种获自印度Pune NCL的酿酒酵母培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602)和NCIM 3090(ATCC 9763)的两种标准酵母菌培养物后用于发 酵。所接种的培养液在摇床上培养24小时，从而在开始时给培养物提供 有氧条件，然后在厌氧和静置条件下进一步继续培养3天。4天后用 GC-MS测量乙醇的形成，并且测量所利用的糖。表7显示还原糖到乙醇 的转化。

表7

此处，发现菌株NCIM 3455对于乙醇的形成较优越。

实施例7

使用长心卡帕藻颗粒进行的生物乙醇生产按下述进行。将50g生物质 用1000ml 2.5％硫酸在100℃水解1小时。过滤提取物，并且向滤出液中 加入50g新鲜海藻生物质，在相似条件下重复水解以增加糖浓度。因此， 使用总共150g的原料重复提取三次。测量在所有三次循环的提取物中的 还原糖浓度(表8)。将在三次循环后得到的糖化溶液用固体氢氧化钙中 和至pH 5.5-6.0。去除硫酸钙沉淀物后得到的澄清溶液在将其用氮源如 0.5％蛋白胨和0.5％酵母提取物加富、将其高压灭菌并且将其接种酿酒酵 母培养物号为NCIM 3455(ATCC 26602)的有希望的标准酵母培养物后 用于发酵。所接种的培养液在摇床上培养24小时，从而在开始时给培养 物提供有氧条件，然后在摇床上在厌氧条件下进一步继续培养两天。之后 每24小时用GC-MS测量乙醇的形成，以及测量所利用的糖。表9解释 还原糖到乙醇的转化。结果表明大部分所利用的糖转化成乙醇。

3个循环后，从等价于120g角叉菜聚糖的150g颗粒获得36.82g还原 糖。因此，30％的角叉菜聚糖被转化成还原糖。

表8：长心卡帕藻颗粒提取物的糖浓度

表9：使用长心卡帕藻颗粒的糖利用和乙醇形成

此处，大部分所利用的糖被转化成乙醇。然而，糖利用效率非常低， 这是由于在水解物中存在可溶盐，其干扰培养物的发酵效率。为了克服这 一问题，使用电渗析过程来减少水解物中的可溶盐含量。

实施例8

使用长心卡帕藻颗粒进行的生物乙醇生产按下述进行。将50g生物质 用1000ml 2.5％硫酸在100℃水解1小时。过滤提取物，并且向滤出液中 加入50g新鲜海藻生物质，在相似条件下重复水解以增加糖浓度。因此， 使用总共250g的原料重复提取5次。测量在最终水解物中的还原糖浓度。 将在5次循环后得到的糖化溶液用固体氢氧化钙中和至pH 5.5-6.5。在中 和过程中产生的不溶性盐通过过滤或以6500rpm离心15分钟去除，而在 水解和中和过程中产生的可溶盐通过电渗析(ED)方法去除。将电渗析 堆用本实验室制备的共聚物型的5膜对的阳离子和阴离子交换膜装填。在 膜堆中使用平行流。该膜堆的单一有效膜面积是80cm²。海藻水解物通过 ED膜堆的产物(稀释物)区室循环。同时，水通过浓缩物区室循环。所 有实验通过使用适当的泵以分别为3.0L/h的产物和浓缩物流的循环流速 进行。硫酸钠稀溶液通过在末端的两个电极区室循环，以去除电渗析产物。 通过AC-DC整流器方式在两个电极之间应用电势(7.5V)。稀释物和浓缩 物流二者的循环持续至所有溶解的盐淘汰物达到初始量的约90-95％。以 规律的区间流，记录电压和TDS。在实验结束时，分析稀释物和浓缩物 流的检测样品的TDS、传导率、pH、氯化物、硫酸盐、硬度、钠、钾等。 在ED后得到的澄清溶液在将其用氮源如0.5％蛋白胨和0.5％酵母提取物 加富、将其高压灭菌并且将其接种酿酒酵母培养物号为NCIM 3455 (ATCC 26602)的有希望的标准酵母培养物后用于发酵。所接种的培养 液在30±2℃在摇床上培养24小时，并且用GC-MS测量乙醇的形成，以 及测量所利用的糖。电渗析对乙醇生产的影响通过将其与用相同水解物而 不用ED得到的结果相比较而进行研究。ED处理的水解物的分析显示在 表10中，而关于由ED处理的和ED未处理的水解物产生的乙醇的比较 数据显示在表11中。

表10：ED处理的由长心卡帕藻颗粒制备的水解物的分析

表11：ED对由长心卡帕藻的乙醇生产的影响

由于角叉菜聚糖的高硫酸盐含量，重复的酸水解和中和过程导致产生 高浓度的可溶盐，其干扰发酵过程。利用电渗析过程去除至多90％的可 溶盐显著提高糖的利用及其乙醇转化。

实施例9

在长心卡帕藻颗粒酸水解后得到的糖化溶液具有不同的初始糖浓度， 其中用固体氢氧化钙将pH调节至5.8。在通过过滤或以7000rpm离心15 分钟去除沉淀物后得到的澄清溶液进行电渗析脱盐，然后在将其用氮源如 由麻疯树属团块制备具有1.25％蛋白的蛋白水解物替代0.5％蛋白胨和 0.5％酵母提取物进行加富、将其高压灭菌并且将其接种酿酒酵母NCIM 3455(ATCC 26602)的标准酵母培养物后用于发酵。所接种的培养液在 30±2℃在摇床上培养24小时，从而在开始时给培养物提供有氧条件，然 后在厌氧和静置条件下进一步继续培养3天。4天后用GC-MS测量乙醇 的形成，以及测量所利用的糖。培养后，糖利用高至水解物中可用的全部 糖的84％，然而，糖到乙醇的转化百分数低至13.5％。

本发明的优点

1.利用大型藻类生物质生产乙醇与生物肥料的生产集成，其中乙醇 作为副产物产生。

2.在角叉菜聚糖生产后，将剩余的富含角叉菜聚糖的颗粒用作糖源 用于乙醇生产。

3.从相同的海藻获得多种产物使得其商业培育在经济上更可行。

4.在海洋中有巨大的面积可用来商业培育有潜力的海藻。

5.没有对农业用地和水以及食品作物的竞争。

6.对于海藻培育不需要精确的农业实践。

7.不使用肥料或杀虫剂，因此是生态友好的培育方法。

8.利用电渗析过程形成在水解物中存在的可溶盐的去除。

9.利用在中和和电渗析过程中和在乙醇蒸馏后产生的废弃产物作为 肥料。