灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗的组织培养基

摘要

本发明公开了一种适用于灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗繁育的组织培养基，包括下述培养基中的至少一种：愈伤组织诱导培养基：B5+6-BA2mg/L+KT2mg/L+NAA0.1mg/L+卡拉胶5.5~6.0g/L+蔗糖30g/L，调pH至5.6~5.8；不定芽分化培养基：B5+6-BA1mg/L+KT2mg/L+NAA0.1mg/L+卡拉胶5.5~6.0g/L+蔗糖30g/L，调pH至5.6~5.8；不定芽继代培养基：MB+6-BA1mg/L+IAA0.8mg/L+卡拉胶5.5~6.0g/L+蔗糖30g/L，调pH至5.6~5.8；生根培养基：1/3MB+IBA1.5mg/L+IAA0.1mg/L+卡拉胶5.5~6.0g/L+蔗糖20g/L，调pH至5.6~5.8；上述培养基具有愈伤组织诱导率高，不定芽分化率和增殖系数高，生根率高，试管苗移栽成活率高，芽苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根、新叶萌发快等优点，能够满足灰毡毛忍冬渝蕾1号大面积规模化栽培的需要，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种植物种苗的组织培养基。

背景技术

灰毡毛忍冬（Lonicera m acranthoides Hand. Mazz）是忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕小灌木或直立小灌木植物，其花蕾的绿原酸含量在全国各种金银花中最高，是西南、中南地区商品金银花的主要品种之一。

渝蕾1号于2008年经重庆市林木品种审定委员会审定为灰毡毛忍冬的一个新品种。该品种亩产鲜花达400千克以上，较传统种植灰毡毛忍冬增产30~80%，抗逆性和适应性也较传统家种灰毡毛忍冬强，其最显著的特点是花期长达20~30天且整个花期都是花蕾，基本上不开花，与传统家种灰毡毛忍冬7~10天的花蕾期相比，采摘期大大延长，便于采摘用工安排和加工时间安排。该品种已列入重庆“两翼”农户万元增收计划中。由于该品种植株性状变异较大，目前通常采用无性系育种方法如扦插、嫁接繁殖优良单株无性系，但嫁接的砧木和接穗资源不多，扦插成活率低于40%，导致繁殖系数较低，不能满足生产和市场需求。因此，通过组织培养的无性繁殖在短期内实现种苗产业化很有市场前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用于灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗繁育的组织培养基，具有愈伤组织诱导率高，不定芽分化率和增殖系数高，生根率高，试管苗移栽成活率高，芽苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根、新叶萌发快等优点，能够满足灰毡毛忍冬渝蕾1号大面积规模化栽培的需要。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗的组织培养基，包括下述培养基中的至少一种：

A．愈伤组织诱导培养基：以B5为基本培养基，并添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）2mg/L、激动素（KT）2mg/L、萘乙酸（NAA）0.1mg/L、卡拉胶5.5~6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6~5.8；

B．不定芽分化培养基：以B5为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶5.5~6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6~5.8；

C．不定芽继代培养基：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、吲哚乙酸（IAA）0.8mg/L、卡拉胶5.5~6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.6~5.8；

D．生根培养基：以1/3MB培养基为基本培养基，并添加吲哚丁酸（IBA）1.5mg/L、IAA 0.1mg/L、卡拉胶5.5~6.0g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.6~5.8。

进一步，所述灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗的组织培养基包括下述四种培养基：

A．愈伤组织诱导培养基：以B5为基本培养基，并添加6-BA 2mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

B．不定芽分化培养基：以B5为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

C．不定芽继代培养基：以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

D．生根培养基：以1/3MB培养基为基本培养基，并添加IBA 1.5mg/L、IAA 0.1mg/L、卡拉胶5.5g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.8。 

上述技术方案中涉及的B5培养基是1968年Gamborg等设计的培养基，为植物组织培养中的常用培养基；MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的培养基，也是植物组织培养中的常用培养基；MB培养基是发明人在MS培养基的基础上改良而得，主要是对MS培养基中大量元素的种类及其浓度进行了调整，微量元素的种类与MS培养基相同但各组分的浓度约相当于MS培养基中浓度的2/3，铁盐与有机物的种类及其浓度与MS培养基相同；1/2、1/3、1/4MB培养基是指培养基中大量元素各组分的浓度分别相当于MB培养基中浓度的1/2、1/3、1/4，微量元素、铁盐与有机物的浓度与MB培养基相同。B5、MS和MB培养基的具体配方如下表所示。

本发明的有益效果在于：本发明对适用于灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗繁育的组织培养基包括愈伤组织诱导培养基、不定芽分化培养基、不定芽继代培养基和生根培养基进行了系统研究和优化，所得培养基具有愈伤组织诱导率高，不定芽分化率和增殖系数高，生根率高，试管苗移栽成活率高，芽苗生长健壮、叶形叶色正常、皮下生根、新叶萌发快等优点，能够满足灰毡毛忍冬渝蕾1号大面积规模化栽培的需要，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为诱导出的愈伤组织。

图2为愈伤组织分化出的不定芽。

图3为不定芽的继代培养。

图4为生根培养。

图5为灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中使用的灰毡毛忍冬渝蕾1号外植体由重庆文理学院花卉研究所温室大棚提供。

1、愈伤组织诱导培养基的优化

将灰毡毛忍冬渝蕾1号外植体（当年抽出的叶片）用自来水冲洗干净，用体积分数为70%的乙醇溶液漂洗30秒，再用质量分数为0.1%的HgCl₂溶液消毒8分钟，最后用无菌水冲洗4~5次彻底洗去残余的HgCl₂。将消毒后的叶片切成1cm³大小，接种于愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基分别以MS、MB和B5作为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8。每种培养基处理3瓶，每瓶接种30个外植体。之后进行愈伤组织诱导培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，统计愈伤组织的诱导时间和愈伤组织数，计算诱导率。

结果见表1，愈伤组织诱导培养基的基本培养基对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤的诱导率影响较大，MS、MB和B5三种不同基本培养基的诱导率差异显著，其中B5培养基的平均诱导率最高（66.7%）且形成的愈伤组织呈黄绿色、较致密、生长较快；而愈伤组织诱导培养基的基本培养基对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤的诱导时间影响较小，三种不同基本培养基的诱导时间差异不显著，都在诱导2周后才有愈伤形成。因此，灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤组织诱导培养基的基本培养基优选B5。

表1  不同基本培养基对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤组织诱导的影响

2、不定芽分化培养基的优化

将灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤组织转接至不定芽分化培养基中。不定芽分化培养基是以B5作为基本培养基，分别添加不同浓度配比的6-BA、KT和NAA，同时添加卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8。每种培养基处理30个愈伤组织。之后进行不定芽分化培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，30天后统计分化芽数，计算分化率。

结果见表2，不定芽分化培养基的激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤组织分化的影响较大，6-BA、KT和NAA不同浓度配比的分化率差异显著，其中以6-BA 1mg/L+KT 2mg/L+NAA 0.1mg/L的分化率最高（56.7%）且芽的叶片颜色浓绿，生长健壮；此外，分析6-BA和KT的浓度对愈伤分化的影响，可见高浓度的6-BA使诱导出来的芽颜色偏黄且分化率相对较低，而高浓度的KT有利于叶片愈伤组织的分化且分化出的芽色绿，芽较健壮。因此，灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽分化培养基的激素浓度配比优选6-BA 1mg/L+KT 2mg/L+NAA 0.1mg/L。

表2  不同激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤组织分化的影响

3、不定芽继代培养基的优化

将灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片愈伤分化出的初代丛生芽切割成单芽，转接至不定芽继代培养基中。不定芽继代培养基分别以B5、MS和MB作为基本培养基，每种基本培养基分别添加不同浓度配比的6-BA、IAA和NAA，同时添加卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8。每种培养基接种30个芽。之后进行不定芽继代培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，25天后统计增殖总芽数，计算增殖系数。

结果见表3，不定芽继代培养基的基本培养基对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽继代的影响较大，在B5、MS和MB三种不同基本培养基中，B5培养基处理的叶片颜色偏黄且增殖系数相对较低，而MS和MB培养基处理的叶色正常，其中MB培养基处理的芽苗生长情况更好且增殖系数最高；此外，不定芽继代培养基的激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽继代的影响也较大，当NAA浓度固定时，随着6-BA浓度的降低，增殖系数明显下降，当6-BA浓度固定时，比较生长素IAA和NAA，可见二者的增殖系数差异较小，但NAA处理的不定芽基部愈伤大，不利于植株吸收营养，而IAA不存在此问题。因此，灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽继代培养基的基本培养基优选MB，激素浓度配比优选6-BA 1mg/L+IAA 0.8mg/L。

表3  不同基本培养基和激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽继代的影响

4、生根培养基的优化

将灰毡毛忍冬渝蕾1号继代丛生芽中生长健壮、叶形叶色正常、株高约1.5~2cm的芽切割下来转接至生根培养基中。生根培养基分别以1/4MB、1/3MB和1/2MB作为基本培养基，每种基本培养基分别添加不同浓度配比的IBA和IAA，同时添加卡拉胶5.5g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.8。每种培养基接种90个芽。之后进行生根培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养10小时，20天后统计生根数，计算生根率。

结果见表4，生根培养基的基本培养基对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽生根的影响较大，无机盐浓度降低有利于不定芽的生根，但浓度低于1/3MB时又会降低生根率，芽苗的生长情况也随无机物浓度的变化而变化，当无机盐浓度低于1/3MB时开始出现芽苗叶片偏黄、顶芽枯死等现象；此外，生根培养基的激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽生根的影响也较大，主要体现在生根率和芽苗生根部位上，当IBA浓度为0.5mg/L时，基部愈伤很大，部分根从愈伤中长出，生根率较低，随着IBA浓度的增加，基部不形成愈伤，直接从皮上生根，当IBA浓度为1.5mg/L时生根率达到最高74%。因此，生根培养基的基本培养基优选1/3MB，激素浓度配比优选IBA 1.5mg/L+IAA 0.1mg/L。

表4 不同基本培养基和激素浓度配比对灰毡毛忍冬渝蕾1号叶片不定芽生根的影响

综合上述培养基优化结果，利用上述培养基繁育灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗的方法包括以下步骤：

a．愈伤组织诱导：选择当年抽出的叶片作为外植体；将叶片用自来水冲洗干净，用体积分数为70%的乙醇溶液漂洗30秒，再用质量分数为0.1%的HgCl₂溶液消毒8分钟，最后用无菌水冲洗4~5次彻底洗去残余的HgCl₂；将消毒后的叶片切成1cm³大小，接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，获得愈伤组织（图1）；所述愈伤组织诱导培养基是以B5为基本培养基，并添加6-BA 2mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

b．不定芽分化：将步骤a所得愈伤组织转接至不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，获得初代丛生芽（图2）；所述不定芽分化培养基是以B5为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、KT 2mg/L、NAA 0.1mg/L、卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

c．不定芽继代：将步骤b所得初代丛生芽切割成单芽，转接至不定芽继代培养基中进行不定芽继代培养，每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养12小时，昼夜温差控制在8~12℃，获得继代丛生芽（图3）；所述不定芽继代培养基是以MB为基本培养基，并添加6-BA 1mg/L、IAA 0.8mg/L、卡拉胶6g/L和蔗糖30g/L，调节pH至5.8；

d．生根：待步骤c所得继代丛生芽生长至1.5~2cm高时，将丛生芽切割成单芽，转接至生根培养基中进行生根培养（图4），每天在温度为25±1℃、光照强度为2000~3000lx的条件下光照培养10小时，获得试管苗；所述生根培养基是以1/3MB培养基作为基本培养基，并添加IBA 1.5mg/L、IAA 0.1mg/L、卡拉胶5.5g/L和蔗糖20g/L，调节pH至5.8；

e．试管苗移栽：将步骤d所得试管苗移栽入体积比为1:9的珍珠岩-泥炭土混合基质中，每天在基质湿度约80%、光照强度为1500~3000lx的条件下光照培养12小时，每10天施用1次氮质量百分含量为25%、磷和钾质量百分含量各为5%（N15P5K5）的氮磷钾三元复混肥，施用浓度为1mg/mL，即得灰毡毛忍冬渝蕾1号种苗（图5）。

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。尽管通过上述实施例已经对本发明做了较为详细的例举，但本领域技术人员仍然可以根据发明内容部分和实施例部分所描述的技术内容，在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。