利用沙利度胺靶向因子的筛选方法

摘要

本发明的目的是提供开发在保持有用的作用的同时、除去致畸性的化合物。本发明提供一种非致畸性物质的筛选方法，其特征在于，使被验物质与Cereblon或其片段接触，评价被验物质对Cereblon或其片段的结合性，选择不与Cereblon或其片段结合的被验物质、或者与Cereblon或其片段的结合性低于沙利度胺与Cereblon或其片段的结合性的被验物质。

说明书

技术领域

本发明涉及利用作为沙利度胺靶向因子的Cereblon(塞勒布隆：有时 简记为CRBN。)或其片段的非致畸性物质的筛选方法及沙利度胺的拮抗物 的筛选方法，所述非致畸性物质例如，药品、药品添加物、食品、食品添 加物、特别是非致畸性沙利度胺衍生物。另外，本发明涉及与沙利度胺的 结合性低、但保持作为遍在蛋白连接酶复合体的构成因子的功能的突变型 CRBN、编码该突变型CRBN的核酸、及导入有该核酸并进行了表达的非 人动物。

背景技术

1950年代后半期到60年代初，沙利度胺作为镇静剂在超过四十个国 家销售，另外它还常常被处方用于防止妊娠中的女性的早孕反应。沙利度 胺具有致畸性的事实渐渐显著化，到其被停止使用为止，估计包含死产儿 在内造成了超过数千～1万人的畸形(形态形成障碍)(引用文献1-3)。如果 妊娠中第3-8周的女性服用沙利度胺，则在胎儿中引起被称为沙利度胺胚 胎病的四肢、耳、心脏、以及消化器官的形态形成障碍(引用文献1-3)。其 中四肢、耳的频率显著。作为海豹肢畸形(phocomelia)已知的四肢的异常的 特征是臂或腿变短，另外耳的异常以无耳症或小耳症、聋症为代表。尽管 在其原因阐明中进行了相当的努力，但关于该发育异常所知仍甚微。根据 到目前为止的研究可知沙利度胺具有氧化应激诱导、血管新生抑制效果， 这可作为致畸性的原因(引用文献4-5)。但是，残留有几个重要的问题。即， 怎样的分子是直接靶向，以及其靶向因子如何承担致畸性。

但是，作为人的轻度精神发育迟滞的原因的候选因子已知称为CRBN 的蛋白质(非专利文献1、引用文献11)。也有报告该蛋白质与称为损伤DNA 结合蛋白1(Damaged DNA Binding protein 1，DDB1)的蛋白质结合(非专 利文献2、引用文献12)，关于与沙利度胺的关联性没有任何的报告。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：J.J.Higgins，J.Pucilowska，R.Q.Lombardi，J.P. Rooney，Neurology 63，1927(2004).

非专利文献2：S.Angers et al.，Nature 443，590(2006).

发明内容

发明要解决的课题

近年来，沙利度胺多用在伴随多发性骨髓瘤、疼痛的作为麻风病的一 种的麻风性结节性红斑的治疗中(引用文献2、3、6、7)。虽然其详细的机 理不明，但已知沙利度胺对于这些疾病发挥良好的效果。但是，致畸性依 然存在，因此沙利度胺使用仅在严格的管制下进行(引用文献8)。为了更广 泛地应用该有用的效果，非常希望除去沙利度胺的致畸性。

本发明是在以上那样的技术背景下完成的，目的之一是提供在保持沙 利度胺的有用药理作用的同时、没有致畸性的沙利度胺的替代药的开发方 法。

用于解决课题的方法

本发明者为了解决上述课题反复深入研究的结果，发现沙利度胺与 CRBN结合，通过抑制以CRBN作为构成因子的遍在蛋白连接酶复合体的 活性而产生致畸性。如上所述，已知CRBN为人的轻度精神发育迟滞的原 因的候选因子，以及CRBN与DDB1进行结合，但关于与沙利度胺的关联 性完全不知。因此，在本申请提出时，完全不能预测CRBN是沙利度胺的 致畸性中的靶向因子。

根据以上的认识，通过使沙利度胺衍生物与Cereblon接触，研究与 Cereblon的结合性，可预见该沙利度胺衍生物的致畸性。

如果进一步发展该新认识，则不限于沙利度胺衍生物，对于所有的被 验物质只要研究其与CRBN的结合性，都可预见该物质有无沙利度胺样的 致畸性。

另外，本发明者还发现，来自人的CRBN的从N末端起第339～442 位的氨基酸残基是沙利度胺的结合区域，以及将从N末端起第384位的酪 氨酸及第386位的色氨酸替换成丙氨酸而得的来自人的CRBN在保持作为 遍在蛋白连接酶复合体的构成因子的功能的同时，与沙利度胺的结合性降 低。

本发明是根据以上的认识完成的。

即，本发明提供以下的[1]～[11]。

[1]一种非致畸性物质的筛选方法，其特征在于，使被验物质与 Cereblon或其片段接触，评价被验物质对Cereblon或其片段的结合性， 选择不与Cereblon或其片段结合的被验物质，或者与Cereblon或其片段 的结合性低于沙利度胺与Cereblon或其片段的结合性的被验物质。

[2]根据[1]所述的非致畸性物质的筛选方法，其特征在于，被验物质 为药品。

[3]根据[1]或[2]所述的非致畸性物质的筛选方法，其特征在于，被验 物质为通式(1)所示的沙利度胺衍生物，

其中，式(1)中，将X为R₅-R₇且Y为R₆-R₈时的化合物作为化合 物(A)，将X为R₅且Y为R₆-R₈时的化合物作为化合物(B)，以及将X为 R₅且Y为R₈时的化合物作为化合物(C)，

另外，R₁、R₂、R₃及R₄可选自-H；-OH；＝O；直链及支链烷烃、 直链及支链烯烃、直链及支链炔烃；环式烷烃、环式烯烃及环式炔烃；环 式及非环式烷烃、环式及非环式烯烃和环式及非环式炔烃的组合；醇、醛、 酮、羧酸、酯、或组合有环式、非环式的醚部分、或者环式/非环式部分的 组合；氮杂；氨基；-MOn或-O-MOn[式中，M为N且n为2；M 为S且n为2或3；或者M为P且n为1-3]；以及卤素；

R₅、R₆、R₇及R₈分别独立地选自式(2)或-O-，

式中，Z为任意，并且与上述R₁的定义相同；并且R₁₀与上述R₁的 定义相同，或者在没有Z的情况下R₁₀为＝O；

R₉是具有式(3)、(4)、(5)、(6)或(7)的部分，

式中，各个R₁₁-R₁₇独立地与上述R₅的定义相同，

式中，R₁₈、R₁₉及R₂₀独立地选自H、-CH₃、-COOH、-CONH₂、 -(CH₂)_n-COOH、-(CH₂)_nCONH₂，n为1-4。

[4]根据[1]～[3]的任一项所述的非致畸性物质的筛选方法，其特征在 于，Cereblon的片段是具有下述氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列是在 序列号7所示的氨基酸序列中，具有从其N末端起第339～442位的氨基 酸序列，在除此以外的序列号7所示的氨基酸序列中替换、缺失和/或添加 了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

[5]根据[1]～[4]的任一项所述的非致畸性物质的筛选方法，其特征在 于，Cereblon或其片段被固定于载体。

[6]根据[3]所述的非致畸性物质的筛选方法，其特征在于，沙利度胺 衍生物具有沙利度胺或已知的沙利度胺衍生物所具有的药理作用。

[7]一种致畸性物质的拮抗物的筛选方法，其特征在于，包括以下工 序：使被验物质与Cereblon或其片段接触，研究被验物质与Cereblon或 其片段的结合性，选择与Cereblon或其片段结合的被验物质的工序；以及 从通过上述工序选择的被验物质中选择减轻i)致畸性、或ii)含有Cereblon 的遍在蛋白连接酶复合体的活性抑制作用的物质的工序。

[8]根据[7]所述的致畸性物质的拮抗物的筛选方法，其特征在于， Cereblon或其片段被固定于载体。

[9]一种突变型Cereblon，其特征在于，具有以下(a)和/或(b)的氨基酸 替换：

(a)来自人的Cereblon中的从N末端起第384位的酪氨酸或与其相当 的氨基酸被替换成丙氨酸，

(b)来自人的Cereblon中的从N末端起第386位的色氨酸或与其相当 的氨基酸被替换成丙氨酸。

[10]一种核酸，其特征在于，编码[9]所述的突变型Cereblon。

[11]一种沙利度胺致畸性耐性非人动物，其特征在于，作为基因，导 入有[10]所述的核酸并进行了表达。

发明的效果

通过本发明的筛选方法得到的非致畸性物质，可预见有无沙利度胺样 的致畸性，非致畸性沙利度胺衍生物作为沙利度胺的代替药是有用的。另 外，通过本发明的筛选方法得到的沙利度胺的拮抗物具有减轻由沙利度胺 引起的致畸性风险的作用。

作为基因导入有本发明的编码突变型CRBN的核酸并进行了表达的动 物对沙利度胺的致畸性显示耐性，因此在沙利度胺药理效果的评价等中是 有用的。

附图说明

图1是关于沙利度胺(thal)对CRBN及DDB1的结合性的图。(A)使用 沙利度胺固定化珠(+)或者对照珠(-)，由HeLa细胞提取液中纯化沙利度 胺结合蛋白。结合于沙利度胺固定化珠的蛋白通过添加沙利度胺而溶出。 溶出的蛋白电泳后进行银染色(上图)。星号(^＊)为非特异性结合的蛋白。结 合的蛋白通过串联质量分析、蛋白质印迹鉴定为CRBN和DDB1。通过将 0.3mM的沙利度胺预先添加于与珠混合前的提取液中，溶出的CRBN和 DDB1减少。(B)在作为纯化的重组蛋白质的CRBN-FLAG及DDB1-V5-His 中混合沙利度胺固定化珠。通过蛋白质印迹来分析结合于沙利度胺固定化 珠的蛋白是CRBN或DDB1，结果结合于珠的蛋白为CRBN。(C)使 CRBN-FLAG、DDB1-V5-His同时或者单独在Sf9细胞中表达，使用FLAG 抗体进行免疫纯化。将纯化的蛋白质进行电泳，然后进行考马斯(Coomassie) 染色，结果检测出DDB1。

图2是关于通过CRBN、DDB1及Cullin 4A(Cul4A)形成E3复合体 的图。(A)使FH-CRBN及DDB1-V5-His在HeLa细胞中共表达，进行免 疫染色。DAPI为4’6-二脒基-2-苯基吲哚。CRBN、DDB1主要共定位于核 中，在细胞质中也检测出。(B)将稳定地表达FH-CRBN的293T细胞或对 照细胞(mock)提取液通过FLAG抗体进行免疫沉淀、蛋白质印迹，结果 DDB1、Cul4A、Roc1作为CRBN复合体共沉淀。(C)将图的量的FH-CRBN 和DDB2表达载体共转染293T细胞。通过蛋白质印迹来分析Input(加入 的样品量)、及用FLAG抗体与CRBN共沉淀的分子(IB)。通过使DDB2 强表达，与CRBN共沉淀的DDB1量降低。(D)在稳定地表达FH-CRBN 的293T细胞中导入Cul4A siRNA或者对照siRNA，添加MG132。用RIPA 缓冲液溶解细胞，用FLAG抗体免疫沉淀，然后用遍在蛋白(Ub)抗体进行 蛋白质印迹。由MG132处理产生的CRBN的自身遍在蛋白化可被Cul4A siRNA抑制。(E)在稳定地表达FH-CRBN(WT、野生型)或者缺失了与 DDB1的结合能力的CRBN突变体(Δmid、缺失了CRBN的第187～260 位氨基酸的突变体)的293T细胞中添加MG132，并进行与D同样的操作。 在ΔMid的表达细胞中，由MG132处理产生的CRBN突变体的自身遍在 蛋白化被抑制。

图3是关于由沙利度胺引起的CRBN功能的抑制的图。(A)CRBN(野 生型)以及CRBN突变体的图。星号表示丙氨酸替换。(B)在GST-CRBN 野生型或者突变体蛋白中混合沙利度胺固定化珠，通过银染色检测出结合 的CRBN突变体类。野生型以及表达CRBN的C末端侧104个氨基残基 的突变体发生了结合。以箭头表示全长的融合蛋白质。(C)在过表达 FH-CRBN野生型或者突变体类的293T细胞提取液中混合沙利度胺固定化 珠，通过蛋白质印迹检测出结合的CRBN突变体类。与野生型相比，CRBN Y384A、W386A突变体与沙利度胺固定化珠的结合较弱，在2点突变体 (YW/AA)中结合进一步降低。(D)将CRBN-V5-His(野生型)及突变体 FH-CRBN YW/AA共转染HeLa细胞，进行免疫染色。DAPI为4‘6-二脒 基-2-苯基吲哚。野生型以及突变体CRBN YW/AA的细胞内定位并无不同。 (E)将表达FH-CRBN YW/AA的293T细胞提取液用FLAG抗体免疫沉淀 后，进行蛋白质印迹分析，结果DDB1、Cul4A、Roc1与YW/AA变异CRBN 进行共沉淀。(F和G)在表达FH-CRBN(野生型)或FH-CRBN YW/AA的 293T细胞中进行图2E所示的工序。在(G)中，在回收的4小时前处理沙利 度胺。由MG132引起的CRBN的自身遍在蛋白化由于沙利度胺的前处置 而被抑制，在YW/AA变异CRBN中没有发现由沙利度胺引起的抑制。

图4是关于由沙利度胺处理及CRBN复合体的抑制引起的斑马鱼的发 育异常的图。(A及B)使斑马鱼胚在图的浓度的沙利度胺中进行药浴状态下 发育。通过沙利度胺的处置，胸鳍、听泡的发育被抑制。(C至F)将zcrbn  AMO(zcrbn吗啉代反义寡核苷酸(zcrbn antisense morpholino  oligonucleotide))单独或者与zcrbn mRNA一起注入单细胞期的胚中。通过 zcrbn AMO，胸鳍、听泡的发育被抑制，但可通过共导入zcrbn mRNA来 缓和(rescued)。(G至I)将zcul4a AMO单独或者与zcul4a mRNA一起注 入单细胞期的胚中。通过zcul4a AMO，胸鳍、听泡的发育被抑制，但可 通过共导入zcul4a mRNA来缓和。(A及C)固定75hpf的胚并用阿尔新蓝 染色。上图为胚的背侧图(dorsal view)。下图为胸鳍的放大图。胸鳍以箭头 表示。(B、E及H)30hpf的听泡的放大图。(D及G)对48hpf的胚用fgf8a (成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)8a)以及shh(音猬因子 (sonic hedgehog))探针进行原位杂交(in situ hybridization)。显示鳍芽(fin  bud)的放大图。发现通过zCrbn、zCul4a的表达抑制，fgf8a的表达降低， 可通过共同导入各自的mRNA来缓和。对shh表达基本没有影响。(F及 I)作为30hpf的听泡的尺寸相对于未处理的样品的比以图表示。 (^＊＊＊p＜0.001，uninj，非注入·未处理)。

图5是关于通过突变型CRBN的表达产生的沙利度胺致畸性抑制的 图。向单细胞期的胚注入zcrbn mRNA(野生型)或者zcrbn YW/AA的 mRNA，在沙利度胺进行药浴。(A)27hpf的听泡的放大照片。(B)将30hpf 的听泡的尺寸相对于未处理的样品的比以图表示。^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01。在 过表达zcrbn YW/AA的胚中，沙利度胺没有影响听泡的发育。(C及D)将 48hpf的胚用fgf8或者shh探针进行原位杂交。图中显示鳍芽的放大照片。 uninj，未处理。在表达zcrbn YW/AA的胚中，由沙利度胺引起的fgf8a 表达的减少缓和了。

图6是沙利度胺向FG珠的固定化方法的模式图。(A及B)作为沙利度 胺及其衍生物的FR259625的结构。(C)沙利度胺固定化反应的流程。

图7是关于纯化来自各种细胞种的沙利度胺结合因子的图。在如图所 示的细胞种的提取液中添加沙利度胺固定化珠使其反应。通过蛋白质印迹 来检测出被沙利度胺溶出的级分的DDB1以及CRBN。竞争性抑制是将 0.3mM的沙利度胺添加到与珠结合前的提取液中。在各种细胞种中，可作 为沙利度胺结合蛋白检测出CRBN以及DDB1。

图8是关于DDB1对CRBN的结合性的图。将稳定地表达FH-CRBN 的293T细胞株或者对照细胞(mock)提取液通过FLAG抗体进行免疫沉淀， 进行SDS-PAGE及银染色。DDB1与CRBN共沉淀。

图9是关于体外的CRBN的遍在蛋白化的图。由稳定地表达FH-CRBN 的293T细胞株纯化的FH-CRBN复合体为GST-遍在蛋白，在Ubal(相当 于E1)、UbcH5b(相当于E2)、ATP存在下或者非存在下进行自身遍在蛋 白化反应。将反应溶液使用图示的抗体进行蛋白质印迹。Mock是由对照 细胞进行FLAG纯化而得的级分。在CRBN复合体存在下观察到了自身 遍在蛋白化。

图10是显示DDB1的降低(knock-down)与CRBN蛋白量的关系的图。 将由导入有DDB1 siRNA或者对照的siRNA的293T细胞得到的提取液与 沙利度胺固定化珠混合，通过蛋白质印迹来分析Input中的DDB1或者 β-actin、以及与珠结合的CRBN。伴随DDB1的表达降低，与沙利度胺结 合的CRBN也减少。

图11是表示CRBN缺失突变体与遍在蛋白复合体形成的图。(A) CRBN(野生型)及CRBN缺失突变体的图。(B)使293T细胞表达 FH-CRBN(野生型)及其缺失突变体，在FLAG抗体中进行免疫沉淀。通 过蛋白质印迹来分析CRBN及其突变体、以及结合的内源性DDB1。其结 果判明，通过CRBN的第187～260位的氨基酸缺失而与DDB1的结合消 失。(C)使CRBN及缺失了第187～260位的氨基酸的突变体ΔMid在293T 细胞中表达。在FLAG抗体中免疫沉淀后，通过蛋白质印迹来分析与CRBN 或者ΔMid结合的DDB1以及Cul4A。ΔMid与DDB1、Cul4a的复合体形 成能力消失。

图12是关于CRBN的进化保守性的图。通过5种来比较CRBN直系 同源的氨基酸。用框围起来的氨基酸是在全部5种中保守的氨基酸。箭头 为通过缺失实验判明的沙利度胺结合区域，星号表示对沙利度胺结合非常 重要的氨基酸(Y384和W386)。参照图3。

图13是表示斑马鱼胚的zcrbn及zcul4a的表达的图。以整胚 (wholemount)原位杂交来验证48hpf胚中的zcrbn及zcul4a的表达。(A) zcrbn在头部血管、胸鳍及脑中高表达。其为侧面图，左为前部。(B)48hpf 的听泡中的zcrbn表达。(OV，箭头处)为背侧图，且前部为头部。(C)为48hpf 胚中的胸鳍中的zcrbn表达的放大图。表达在前位的间充质(proximal  mesenchyme，pm)中为高水平，在迁移间充质(migratory mesenchyme，mm) 中弱。(D)关于zcul4a的表达。在48hpf胚中，zcul4a在前脑、中脑及后脑、 胸鳍中高表达。(E)作为对照为在48hpf胚中的fgf8的表达。在中脑-后脑 边界部及后脑中表达。比例尺为0.2mm。

图14是关于zCrbn的生物化学分析结果的图。(A)在表达FH-zCrbn 的293T细胞提取液中混合沙利度胺固定化珠使其反应。用沙利度胺溶出 结合蛋白质，并通过蛋白质印迹来进行分析。zCrbn与沙利度胺结合。(B) 将表达FH-zCrbn的293T细胞提取液用FLAG抗体进行免疫沉淀，通过 蛋白质印迹来验证DDB1的结合。可知人的内源性DDB1结合。(C)在表 达FLAG-zCrbn(野生型)或者FLAG-zCrbn YW/AA的293T细胞提取液 中混合沙利度胺固定化珠。对于Input及利用沙利度胺的溶出级分以各种 量进行蛋白质印迹分析。沙利度胺对zCrbn YW/AA的结合明显较弱。

图15是模式地表示沙利度胺致畸性的分子机理的图。正常时CRBN 作为E3遍在蛋白连接酶复合体的亚基发挥功能，通过使未知的底物遍在 蛋白化来控制四肢、听泡的形成等各种发育进程(上图)。沙利度胺一与 CRBN结合，作为E3的功能就被抑制(下图)。底物的异常蓄积导致形成短 的四肢或小的听泡等各种发育异常。部分与fgf8的表达的降低相关。

图16是关于邻苯二甲酰亚胺与CRBN及DDB1的结合的图。将293T 细胞提取液与沙利度胺固定化珠混合。将与珠结合的因子用沙利度胺或者 等量的邻苯二甲酰亚胺溶出，通过蛋白质印迹来分析溶出级分中的CRBN 及DDB1。

图17是表示研究与CRBN的结合性的沙利度胺衍生物的结构式的图。

图18是关于沙利度胺衍生物与CRBN的结合的图。图中的载体表示 DMSO。在HEK293T细胞提取液中混合沙利度胺固定化珠，洗涤后，通 过沙利度胺衍生物溶出结合蛋白。对溶出级分中的CRBN进行蛋白质印迹 分析。图中的载体表示DMSO。SDS-Boil是将洗涤后的珠在含有2％SDS 的缓冲液中加热至98.5℃，解离结合于沙利度胺固定化珠的CRBN而得的 的级分。CRBN通过沙利度胺、戊二酰亚胺而溶出，但在添加邻苯二甲酰 亚胺、5-羟基-(2，6-二异丙基苯基)-1H-异吲哚-1，3-二酮(5HPP-33)时不溶出。

图19是显示沙利度胺或5HPP-33处理后的多发性骨髓瘤细胞Kms12 的细胞数的图。在KMS-12细胞中添加沙利度胺或者5HPP-33使终浓度为 100μM。在设定为37℃、5％CO₂的培养箱内培养48小时。为了测定细胞 数，添加活细胞数测定试剂SF(ナカライテスク)，进一步培养2小时后， 在波长450nm测定吸光度。5HPP-33对KMS-12显示强的增殖抑制。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

(1)非致畸性物质的筛选方法

本发明的非致畸性物质的筛选方法的特征在于，使被验物质接触 CRBN或其片段，评价被验物质对CRBN或其片段的结合性，选择不与 CRBN或其片段结合的被验物质、或者与CRBN或其片段的结合性低于沙 利度胺与CRBN或其片段的结合性的被验物质。

与CRBN等的结合性低于沙利度胺与CRBN等的结合性的被验物质 的选择，例如，进行使用沙利度胺代替被验物质的对照实验，通过比较被 验物质的结合性和沙利度胺的结合性来进行。

认为CRBN是沙利度胺的致畸性的靶向因子。因此，认为不与CRBN 结合的物质或与CRBN的结合性低于沙利度胺的物质，没有沙利度胺所具 有的致畸性，或者致畸性减轻。

对被验物质没有特别限定，优选对人或其他动物施与、或使其摄食的 物质，例如，可举出药品、药品添加剂、食品、食品添加剂或它们所含的 化学物质等。

在药品中，沙利度胺衍生物是重要的。

作为沙利度胺衍生物，例如可举出下面的通式(1)所示的化合物。

其中，式(1)中，将X为R₅-R₇且Y为R₆-R₈时的化合物作为化合 物(A)，将X为R₅且Y为R₆-R₈时的化合物作为化合物(B)，以及将X为 R₅且Y为R₈时的化合物作为化合物(C)，

另外，R₁、R₂、R₃及R₄可选自-H；-OH；＝O；直链及支链烷烃、 直链及支链烯烃、直链及支链炔烃；环式烷烃、环式烯烃及环式炔烃；环 式及非环式烷烃、环式及非环式烯烃和环式及非环式炔烃的组合；醇、醛、 酮、羧酸、酯、或组合有环式、非环式的醚部分、或者环式/非环式部分的 组合；氮杂；氨基；-MOn或-O-MOn[式中，M为N且n为2；M 为S且n为2或3；或者M为P且n为1-3]；以及卤素；

R₅、R₆、R₇及R₈分别独立地选自式(2)或-O-，

式中，z为任意，并且与上述R₁的定义相同，并且R₁₀与上述R₁的 定义相同；或者在没有z的情况下R₁₀为＝O；

R₉是具有式(3)、(4)、(5)、(6)或(7)的部分，

式中，各个R₁₁-R₁₇独立地与上述R₅的定义相同，

式中，R₁₈、R₁₉及R₂₀独立地选自H、-CH₃、-COOH、-CONH₂、 -(CH₂)_n-COOH、-(CH₂)_nCONH₂，n为1-4。

已知在沙利度胺衍生物的中，5-羟基-(2，6-二异丙基苯基)-1H-异吲哚 -1，3-二酮(5HPP-33)具有人骨髓瘤细胞的增殖抑制等的药理作用，但与 Cereblon的结合性相当低。

沙利度胺衍生物优选具有沙利度胺和/或已知的沙利度胺衍生物所具 有的药理作用。

作为沙利度胺的药理作用，确认了：(i)抑制由bFGF诱导的血管新生， (ii)抑制经LPS刺激的人单核细胞产生TNF-α，抑制通过人骨髓瘤细胞等 的肿瘤细胞和人骨髓基质细胞的共培养而增强的IL-6产生，(iii)促进多发 性骨髓瘤患者的末梢血中的自然杀伤细胞数的增加、T细胞受体刺激后的 IL-2及INF-γ产生的增强、及IL-2依赖的T细胞的增殖，(iv)对于人骨髓 瘤细胞等的肿瘤细胞，抑制细胞凋亡诱导和细胞增殖等。

另外，作为对沙利度胺的疾病的预防、治疗效果，可例示镇静作用、 麻风病治疗作用(具体为麻风性结节性红斑的治疗作用)、移植病治疗作用、 多发性骨髓瘤治疗作用、实体癌治疗作用、全身性红斑狼疮治疗作用、多 发性硬化症治疗作用、白塞氏病治疗作用、炎症性肠疾病(克罗恩氏病或溃 疡性大肠炎)治疗作用等。作为已知的沙利度胺衍生物的药理作用，可例示， 来那度胺(Lenalidomide)的多发性骨髓瘤治疗作用、骨髓增生异常综合症 (MDS)治疗作用，泊马度胺(Pomalidomide)的多发性骨髓瘤治疗作用、骨 髓纤维化症的治疗作用等。

CRBN为已知的蛋白质，编码该蛋白质的基因(CRBN基因)的碱基序 列已在数据库上公开。例如，来自人的CRBN基因的碱基序列，来自小鼠 的CRBN基因的碱基序列、来自大鼠的CRBN基因的碱基序列、及来自 斑马鱼的CRBN基因的碱基序列，分别以Gene ID：51185、Gene ID：58799、 Gene ID：297498及Gene ID：445491登记在Entre Gene。所使用的CRBN、 CRBN基因可以是天然的，也可使用包含在天然的CRBN的氨基酸序列中 缺失、替换或添加一个或数个氨基酸而得的氨基酸序列、且能形成具有活 性的遍在蛋白连接酶复合体的突变型CRBN或编码该突变型CRBN的基 因。

本发明者特定了来自人的CRBN中的沙利度胺结合区域。因此，即使 使用包含沙利度胺结合区域的CRBN的片段来代替CRBN，也可进行结合 性的评价。作为沙利度胺结合区域，可例示来自人的CRBN的C末端侧的 104个氨基酸的区域。在来自除人以外的生物的CRBN中，可将相当于该 C末端侧的104个氨基酸区域的区域(即，基于氨基酸的同一性进行排列时， 与来自人的CRBN的C末端侧的104个氨基酸区域一致的区域)作为沙利 度胺结合区域。

作为CRBN的片段，可举出下述氨基酸序列：在序列号7所示的来自 人CRBN的氨基酸序列中，具有从其N末端起第339～442位的氨基酸序 列，在除此以外的序列号7所示的氨基酸序列中替换、缺失和/或添加了一 个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；及相当于该来自人CRBN的片段的来 自各种生物的CRBN的片段等。另外，CRBN和/或其片段可添加其他的 蛋白质来制成融合蛋白质。

在本发明中使用的CRBN或其片段，可以是上述的来自各种生物的 CRBN、突变型CRBN或它们的片段的任一种，但本发明的目的在于，获 得对人不具有致畸性的沙利度胺衍生物，因此优选使用来自人的CRBN或 其片段。

CRBN和/或其片段优选预先固定于载体。作为载体，只要能够固定 CRBN和/或其片段即可，没有特别限定，优选粒状的载体，另外，优选具 有磁性的载体。作为优选的载体的例子，可举出具有有机聚合物皮膜的磁 性纳米珠。对具有有机聚合物皮膜的磁性纳米珠的粒径没有特别限定，优 选为1-500nm，更优选为20-300nm。作为有机聚合物，可举出GMA、GMA 与苯乙烯的共聚物、(聚)甲基丙烯酸、(聚)丙烯酸等。作为具有有机聚合物 皮膜的磁性纳米珠的具体例，可举出SG珠(kawaguchi等Nucleic Acids  Research 1989，17：6229-6240)、FG珠(Nishio等，Colloids and Surfaces  B：Biointerfaces 2008，64：162-169)、Dynabeads、Adembeads、nanomag等。

沙利度胺衍生物对CRBN的结合性评价可通过常规方法来进行，例如， 可通过利用BIAcore的表面等离子共振、等温滴定量热仪(ITC)等来评价结 合性。

本发明的筛选方法，只要能够评价被验物质与CRBN或其片段的结合 性即可，没有特别限定，例如可如以下的方法那样来实施。

(A)使用FG珠的筛选方法

首先制作固定化有沙利度胺的FG珠。将该固定化珠与表达CRBN的 细胞提取液、或者重组蛋白质混合，用旋转机在5转/分钟、4℃下使混和 状态持续1小时以上。接着用缓冲液洗涤后，例如，作为被验物质将混合 了沙利度胺衍生物的缓冲液通过珠，由此确认是否发生CRBN的溶出。作 为检测出方法，可举出蛋白质印迹、斑点印迹、CBB染色、银染色等。此 时，使用沙利度胺和/或已确认非结合的邻苯二甲酰亚胺作为对照实验的样 品。另外，通过使用多摩川精机株式会社的FG珠筛选装置Target Angler 系列等可分析大量的样品。

(B)使用BIAcore的筛选

首先使带有氨基或者羧基等官能基的CRBN固定于BIAcore基底芯 片。接着在安装了该固定化芯片的BIAcore3000等BIAcore计测装置(GE  Healthcare)中，流入各种衍生物，计测其解离常数。使用沙利度胺和/或邻 苯二甲酰亚胺作为对照实验。

(C)使用等温滴定量热仪的筛选

将含有沙利度胺衍生物的溶液向样品池中含有CRBN的溶液滴加数十 次(例如18次)。通过将各浓度的产生热量相对于池中的衍生物与CRBN的 摩尔比作图，来得到相互作用的结合等温线。由该结合等温线算出解离常 数。使用沙利度胺和/或邻苯二甲酰亚胺作为对照实验。

(2)致畸性物质的拮抗物的筛选方法

本发明的致畸性物质的拮抗物的筛选方法的特征在于包括以下工序： 通过混合等使被验物质与CRBN或其片段接触，评价被验物质是否与 CRBN或其片段结合，选择与CRBN或其片段结合的被验物质的工序；以 及从上述工序所选择的被验物质中，选择减轻i)致畸性、或ii)含有CRBN 的遍在蛋白连接酶复合体的活性抑制作用的物质的工序。

通过上述方法得到的沙利度胺等致畸性物质的拮抗物，抑制致畸性物 质与CRBN的结合。因此，通过在服用沙利度胺或其衍生物等致畸性物质 时合并使用该拮抗物，可减轻致畸性的风险。

前半的工序，即，使被验物质与CRBN或其片段接触，评价被验物质 是否与CRBN或其片段结合，选择与CRBN或其片段结合的被验物质的 工序，可与(1)的筛选方法同样地进行。

如果通过前半的工序所选择的物质不是激动物而是拮抗物，则该物质 应具有减轻沙利度胺等致畸性物质所具有作用的功能。因此，通过评价是 否减轻致畸性或含有CRBN的遍在蛋白连接酶复合体的活性抑制作用，可 选择致畸性物质的拮抗物。

作为沙利度胺具有的作用，除了一直以来已知的致畸性以外，可举出 此次由本发明者弄清楚的遍在蛋白连接酶复合体的活性抑制作用。

是否减轻沙利度胺所具有的作用，可通过比较被验物质的存在下和非 存在下的沙利度胺的作用来确认。

对本发明的致畸性物质的拮抗物的筛选方法没有特别限定，例如，可 如以下那样来实施。

首先确认有无与CRBN的结合。确认有无结合的方法与(1)的筛选方法 同样。这里对于显示显著结合的候选拮抗物可通过以下的方法来筛选。

(A)对利用体外系的遍在蛋白化的影响

在表达FH-CRBN的293T细胞中，添加候选拮抗物及沙利度胺。接 着通过蛋白质印迹来决定其细胞提取液的遍在蛋白化蛋白量。此时，如果 通过添加拮抗物，与沙利度胺单独的情况相比遍在蛋白化蛋白量的减少被 抑制，则该候选是拮抗物。

(B)使用斑马鱼的筛选

使除去卵壳后的斑马鱼胚，药浴沙利度胺和候选拮抗物。如果对于听 泡及鳍形成，与单独药浴沙利度胺的情况相比异常被缓和，则可称为拮抗 物。

(3)突变型CRBN

本发明的突变型CRBN的特征在于，具有以下的(a)和/或(b)的氨基酸 替换。

(a)来自人的CRBN中的从N末端起第384位的酪氨酸或与其相当的 氨基酸被替换成丙氨酸，

(b)来自人的CRBN中的从N末端起第386位的色氨酸或与其相当的 氨基酸被替换成丙氨酸。

在本发明中，所谓“相当于来自人的CRBN中的从N末端起第384位 的酪氨酸的氨基酸”，如图12所示，是指基于氨基酸的同一性排列时，与 来自人(Homo sapiens)的CRBN中的从N末端起第384位的酪氨酸一致的 氨基酸。如图12所示，来自小鼠(Mus musculus)的CRBN中从N末端起 第361位的酪氨酸、来自斑马鱼(Danio rerio)的CRBN中从N末端起第374 位的酪氨酸、来自黑腹果蝇(D.melanogaster)的CRBN中从N末端起第517 位的酪氨酸、来自拟南芥(A.thaliana)的CRBN中第504位的酪氨酸，与 其相当。同样地，在本发明中，所谓“相当于来自人的CRBN中的从N末 端起第386位的色氨酸的氨基酸”，是指基于氨基酸的同一性排列时，与来 自人的CRBN的从N末端起第386位的色氨酸一致的氨基酸。如图12所 示，来自小鼠的CRBN中从N末端起第363位的色氨酸、来自斑马鱼的 CRBN中从N末端起第376位的色氨酸、来自黑腹果蝇的CRBN中从N 末端起第519位的色氨酸、来自拟南芥的CRBN中第506位的色氨酸，与 其相当。

对于编码突变型CRBN的核酸向动物的导入及表达，可按照常规方法 来进行。例如，可通过构建包含编码突变型CRBN的DNA的表达载体， 将其导入动物的受精卵等来进行。作为导入核酸的动物，只要是人以外的 动物即可，没有特别限定，例如，可使用斑马鱼、鸡、小鼠、兔等。

本发明的突变型CRBN保持遍在蛋白连接酶活性，但不与沙利度胺结 合。因此，导入有编码该突变型CRBN的核酸、并进行了表达的动物，对 由沙利度胺引起的致畸性具有耐性。

导入有编码突变型CRBN的核酸、并进行了表达的动物，例如，可用 于致畸性以外的药理作用分析等用途。导入有突变型CRBN的兔、鸡是致 畸性耐性的，因此如果施与沙利度胺和/或其衍生物时显示药理作用，则该 药理作用完全是与致畸性相独立的作用。因此，在分析与致畸性的机理相 独立的沙利度胺作用的方面，导入有该变异CRBN的动物非常有用。

实施例

[实施例1]沙利度胺对CRBN及DDB1的结合性

为了纯化沙利度胺结合因子，本发明者使用作为磁性微粒的FG珠进 行了亲合纯化(引用文献9)。将作为添加了羧基的沙利度胺衍生物的 FR259625通过共价键固定化于FG珠(图6)，与人HeLa细胞的提取液混 合，进行培养。其后，进行洗涤，通过使用游离沙利度胺来使结合因子选 择性溶出。接着通过SDS-PAGE及银染色来分析溶出级分，结果可知， 127kDa和55kDa的二种蛋白质特异性地被溶出(图1A，道(Lane)3)。如果 与珠进行混合前预先将游离沙利度胺添加于提取液中，则通过亲合纯化得 到的这些蛋白质的收量显著减少(图1A，Lane 4)。即，这些蛋白质显示与沙 利度胺特异性结合。对这些127kDa及55kDa的蛋白质通过质量分析计来 进行分析，查明分别为DDB1及CRBN(表1)。已知这些蛋白质通过蛋白 质印迹(免疫印迹，immunoblotting)也可确认(图1A)，进而从各种细胞的 提取液中也可纯化出(图7)。为了研究与沙利度胺的相互作用是否是直接 的，本发明者纯化了这些重组蛋白质。仅CRBN-FLAG与沙利度胺固定化 珠结合，DDB1-V5-His不结合(图1B)。因此考虑，DDB1应该是介由CRBN 间接地与沙利度胺结合。作为结果得到如下结论：沙利度胺直接结合于 CRBN(图1C)，DDB1介由与CRBN的相互作用而与沙利度胺结合。

表1

[实施例2]利用CRBN、DDB1及Cul4A的E3复合体的形成

人的CRBN基因原本被报告为常染色体隐性轻度精神发育迟滞的原因 候选因子(引用文献11)，编码由442个氨基酸构成的蛋白质。该蛋白质在 进化上良好地保守，在植物至人中存在。通过近年来的蛋白质组学分析， 报告了CRBN与DDB1结合(引用文献12)，功能性的关联没有明确，CRBN 的生物功能几乎未知。

首先本发明者为了研究沙利度胺对CRBN功能的效果，进行了生物化 学分析。最初制作稳定地表达FH-CRBN的293T细胞株，由其细胞提取 液以FLAG抗体进行免疫亲合纯化，从而弄清CRBN结合蛋白质。对纯 化物进行银染色，结果明确了CRBN与DDB1以大致1∶1的摩尔比结合(图 8)。利用免疫染色(图2A)，结果CRBN和DDB1主要存在于核中。该结果 启示，CRBN和DDB1在核中担负重要的功能。已报告DDB1与Cul4 (Cul4A或者Cul4B)、Regulator of Cullin 1(Roc1)及底物受体一起形成E3 遍在蛋白连接酶(引用文献13，14)。基本上，E3遍在蛋白连接酶的功能， 是通过与遍在蛋白结合酶(E2)进行特异性相互作用而在底物中添加聚遍在 蛋白链(引用文献15，16)。Cul4作为支架蛋白发挥作用，Roc1具有环指结 构域(RING finger domain)，可与E2相互作用。作为底物受体，已知DDB2、 CSA、SV5-V、CDT2及AhR，与底物直接结合并介导遍在蛋白化(引用文 献13，7-20)。

本发明者研究CRBN是否与E3复合体的其他构成因子相互作用，明 确了DDB1、Cul4A及Roc1与FH-CRBN形成复合体(图2B)。如果CRBN 为新的底物受体，则对于与DDB1的结合，可期待CRBN与DDB2这样的 其他底物受体相互竞争。实际上，随着增加DDB2的表达量，与CRBN共 沉淀的DDB1的量减少(图2C)。即可得到如下结果：CRBN可能是 DDB1-Cul4-Roc1 E3遍在蛋白连接酶的底物结合亚基。

并且，本发明者实际上验证了CRBN复合体是否有E3遍在蛋白连接 酶活性。已知底物受体及Cul4在体外进行自身遍在蛋白化。使用带GST 标签的遍在蛋白、Unal(E1)、Ubal2(E2)以及CRBN复合体在体外进行了 遍在蛋白化分析，结果确实检测出由CRBN复合体产生的遍在蛋白化活性 (图9)。接着本发明者为了验证CRBN是否在活细胞内进行遍在蛋白化， 对表达FH-CRBN的293T细胞中进行作为蛋白酶体抑制剂的MG132处 置。CRBN的自身遍在蛋白化在MG132存在下被检测出，另外可知该遍 在蛋白化通过用siRNA对Cul4A进行表达抑制而减少(图2D)。由于作为 对照在使用DDB1的siRNA的情况下CRBN的表达量减少(图10)，因此 不能分析DDB1表达抑制对于CRBN的自身遍在蛋白化的影响。但是，这 启示了DDB1与CRBN在功能上有关。

接着，为了弄清CRBN的功能表达中的DDB1的作用，本发明者制作 了缺失与DDB1的结合能力的CRBN突变体。通过使用缺失突变体的分析 判明，缺失CRBN中的第187-260位的氨基酸区域的突变体不与DDB1结 合(图11，ΔMid)。在表达Δmid的293T细胞中，由MG132的处理产生的 自身遍在蛋白化与表达野生型CRBN时相比显著降低。由以上的结果启示， CRBN在功能上是E3遍在蛋白连接酶的亚基，受到Cul4A、DDB1依赖 的自身遍在蛋白化。

[实施例3]由沙利度胺引起的CRBN功能的抑制

为了弄清CRBN-沙利度胺间的结合和其功能的重要性的基础，本发明 者考虑，希望得到为沙利度胺非结合性但具有E3复合体形成能力的CRBN 点突变体。首先制作N末端侧缺失突变体和C末端侧缺失突变体，研究沙 利度胺结合区域，结果判明了是C末端的104个氨基酸的区域(图3A及 B)。由从拟南芥到人的多个CRBN同系物的同源性分析可知C末端侧极为 保守(图12)。考虑可能在进化上良好地保守的氨基酸在与沙利度胺的结合 中是重要的，因而制作几个点突变体。从而可知将二个氨基酸、Y384或者 W386替换丙氨酸而得的突变体的沙利度胺结合能力低下(图3C)。进而可 知，Y384A/W386A(称为CRBN YW/AA的二残基同时替换了的突变体) 与沙利度胺的结合能力极低(图3C)。本发明者研究了该CRBN YW/AA是 否保持活性。细胞内定位在野生型与该突变体之间未发现差异。本发明者 发现，即使在该CRBN YW/AA中DDB1、Cul4A、Roc1也通过免疫沉淀 而被纯化，在MG132存在下进行自身遍在蛋白化(图3E及F)。即可知， CRBN YW/AA与野生型CRBN同样地形成E3复合体，也保持了功能。

接着本发明者验证了在含有CRBN的E3复合体中沙利度胺是否抑制 遍在蛋白化。使293T细胞稳定地表达FH-CRBN或者FH-CRBN YW/AA， 以MG132及药理学上妥当的量的沙利度胺(10，30，100μM)进行处置。野生 型CRBN的自身遍在蛋白化被沙利度胺强力地抑制，但CRBN YW/AA的 自身遍在蛋白化不被沙利度胺抑制(图3G)。因此启示，沙利度胺通过与 CRBN结合来抑制其E3功能。

[实施例4]作为生物体内的沙利度胺的靶向的CRBN

接着本发明者使用动物模型来验证了在沙利度胺致畸性中CRBN的作 用。沙利度胺对于小鼠不呈现致畸性，对于兔、鸡则发挥致畸性(引用文献 1-3)。在本研究中，本发明者基于以下所示的理由而采用斑马鱼(Danio rerio) 作为模型。(i)由于发育快且身体透明而容易观察，(ii)基因抑制比较容易(引 用文献21)，(iii)斑马鱼适合于药理毒性科学(引用文献22)。到目前为止， 不知道沙利度胺对于斑马鱼是否显示致畸性，但近年来已知沙利度胺对于 斑马鱼引起血管新生抑制(引用文献23)，因此本发明者认为沙利度胺对于 斑马鱼也显示致畸性。

为了弄清沙利度胺在斑马鱼发育中的影响，将除去卵壳的胚移至包含 各种浓度的沙利度胺的培养基中。沙利度胺在2hpf(hours post  fertilizaition，受精后时间(小时))添加，在3天中观察发育进程。可知在药 浴了沙利度胺的胚中胸鳍及听泡的发育被抑制(图4A及B)。但是在其他 部位没有特别地检测到异常。更特异地，75hpf骨骼盘(endoskeletal disc) 的胸鳍形成被抑制(图4A)，30hpf听泡的尺寸减少(图4B)。关于胸鳍发育 的迟滞在药浴于沙利度胺的48hpf的胚中可检测出(图5C及D)。根据近年 来的研究，报告了硬骨鱼(teleost，包含斑马鱼)的胸鳍和听泡的发育，与四 足动物(tetrapod)的四肢和耳的发育具有同样的分子机理(引用文献24-26)。 这样，由沙利度胺诱导的斑马鱼的发育异常，与妊娠初期的女性由于服用 沙利度胺产生的发育异常极为类似，启示沙利度胺致畸性在脊椎动物中超 越种间地保守。

在斑马鱼中也存在CRBN的直系同源物(相当的物质)，称为zcrbn。 该基因产物与人的CRBN有70％左右的保守性。本发明者首先分析zcrbn  mRNA的表达谱，可知在48hpf中zcrbn在脑、头部血管、耳、以及胸鳍 中表达(图13)。zCrbn与沙利度胺结合也与人的DDB1结合(图14)。即认 为在斑马鱼中，人细胞系的分析结果也是有效的。接着，分析在斑马鱼初 期发育中zCrbn的影响。与沙利度胺同样地，在注入zcrbn吗啉代反义寡 核苷酸(AMO)的胚中可发现鳍及耳的发育异常(图4C-F)，与用沙利度胺进 行处置时的表达系类似。例如，在27hpf中注入zcrbn AMO而得的胚与野 生型相比听泡的尺寸也降低40％(图4F)。并且该结果可通过将zcrbn的 mRNA与AMO一起导入来抵消(图4C-F)。

根据这些结果，由沙利度胺引起的致畸作用极有可能是通过抑制 zCrbn的功能而引起的。那么，如果这样，通过表达不与沙利度胺结合但 保持功能的zCrbn，其致畸性应该被缓和。为了验证该想法，本发明者制 作了将Y374及W376替换成丙氨酸的突变体(相对于人中的YW/AA即 Y384A/W386A)。zCrbn YW/AA对沙利度胺的结合能力极低。在沙利度胺 非存在下，在过表达野生型zCrbn及zCrbn YW/AA的个体中没有发现鳍 及听泡的发育与无处置的个体存在差异。如图4B所示，通过400μM的沙 利度胺处置，显著地减少听泡的尺寸(与对照相比为64.5％。图5A及B)。 在过表达野生型zCrbn的胚中由于沙利度胺，听泡的尺寸与对照相比减少 到66％左右。但是，重要的是在过表达zCrbn YW/AA的胚中沙利度胺的 处置不影响听泡的尺寸(p＝0.347)。由于沙利度胺引起的鳍的退化也通过 zCrbn YW/AA的过表达而被抵消。这些结果显示，沙利度胺与CRBN结 合，通过抑制其功能而引起致畸性。

[实施例5]沙利度胺致畸性的分子机理

对于沙利度胺与CRBN的关联性进行判明，本发明者通过对zCul4a 进行表达抑制而验证了含有CRBN的遍在蛋白连接酶复合体是否与致畸性 相关。zcul4a mRNA在脑或鳍中强烈表达(图13)。如同预想，由于zcul4a  AMO而产生听泡及鳍的异常(图4G-I)。将在27hpf中对zCul4a进行了表 达抑制的胚中，听泡尺寸显著减少(对照尺寸的40％)，通过zcul4a的mRNA 导入可部分地被救济(rescue)。救济为部分地进行，或许是因为zcul4a AMO 的效力过强。由这些情况启示，至少遍在蛋白连接酶复合体对于耳和鳍的 发育是必要的，是沙利度胺的靶向。

由以上的结果可知，通过含有CRBN的E3复合体将一定的蛋白质遍 在蛋白化对于耳和/或鳍的发育是重要的，另外还启示，由沙利度胺引起的 发育异常与含有CRBN的E3复合体的功能不全有关。为了获得CRBN及 沙利度胺的下游信号传递的端倪，分析了作为鳍的发生的关键的已知分子。 音猬因子(sonic hedgehog，Shh)是在极化活性区(zPA，zone of polarizing  activity)表达的因子，规定四肢、鳍的前后轴(引用文献27)。另外Fgf8是 在肢、鳍的AER(顶端外胚层嵴，apical ectodermal ridge)中表达的因子， 是肢、鳍沿着基顶轴伸长所必需的。在施与沙利度胺的48hpf的胚中，fgf8a 的表达降低或者消失(图5C)，但shh的表达没有发现变化(图5D)。另外由 沙利度胺引起的fgf8a表达的降低通过zCrbn YW/AA的导入被救济 (rescued)。在导入了对zCrbn及zCul4A的AMO的胚中，fgf8a表达也降 低，shh表达未发现差异。因此，抑制FGF8产生的因子也许是沙利度胺 和/或含有CRBN的E3复合体的下游的靶向。

[实施例6]邻苯二甲酰亚胺对CRBN及DDB1的结合性

如以下那样研究作为已知的非致畸性沙利度胺衍生物的邻苯二甲酰亚 胺对CRBN及DDB1的结合性。

将293T细胞提取液与沙利度胺固定化珠混合后，进行洗涤。用沙利 度胺或邻苯二甲酰亚胺使与沙利度胺结合的因子溶出。通过蛋白质印迹来 分析溶出级分中的CRBN及DDB1。从沙利度胺的溶出级分中检测出 CRBN及DDB1，但从邻苯二甲酰亚胺(Phthal)的溶出级分中未检测出这些 蛋白质(图16)。

[实施例7]沙利度胺衍生物与CRBN的结合的研究

将293T细胞提取液与沙利度胺固定化珠混合，反应2小时。其后， 用0.5％NP-40裂解缓冲液(Tris-HCl pH值8，150mM NaCl，0.5％NP-40) 洗涤3次，通过在含有0.1-1mM的沙利度胺、邻苯二甲酰亚胺、戊二酰亚 胺、或者5HPP-33(将各化合物的结构式示于图17。)的0.5％NP-40裂解 缓冲液中混合1小时来进行CRBN的溶出。对于得到的溶出级分，在 SDS-PAGE后，进行对CRBN抗体的蛋白质印迹，从而进行分析。将该结 果示于图18。

如图所示，在使用含有邻苯二甲酰亚胺或5HPP-33的缓冲液时，CRBN 几乎不溶出。由此认为，邻苯二甲酰亚胺及5HPP-33对CRBN的结合性 低。

[实施例8]对多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制试验

研究沙利度胺及5HPP-33对多发性骨髓瘤细胞Kms12的增殖抑制作 用。

在多发性骨髓瘤细胞Kms12的培养中使用RPMI Medium 1640(10％ FBS)。进行各试剂处理时将Kms12调整为每1ml为2×10⁵个细胞，在2ml  Eppendorf离心管中分别注入2ml。添加的试剂(沙利度胺或者5HPP-33) 以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂制成终浓度的1000倍浓度的储备溶液，对 2ml的细胞悬浮液添加2μl的储备溶液，平稳且充分地进行颠倒混合。处 理后，将96孔板中每1孔分别注入100μl，将注入后的孔板在37℃、5％CO₂的培养箱中培养48小时。在处理后48小时的细胞数的测定中，在每1孔 中添加10μl的活细胞数测定试剂SF(nacalai tesque)，并在37℃、5％CO₂的培养箱(incubator)中培养2小时。与细胞数成比例的450nm吸光度的测 定中使用GloMax-Multi+Detection System(promega)。标准曲线的制作中 每1ml使用1×10⁶、3×10⁵、1×10⁵细胞的Kms12。将溶剂处置时的细胞数 作为100，以相对值表示药物添加时的细胞数。将48小时培养后的细胞数 的相对值示于图19。

如图所示，5HPP-33对多发性骨髓瘤细胞Kms12显示了强的增殖抑制 作用。如实施例7所示，5HPP-33对CRBN的结合性低。因此考虑，5HPP-33 的增殖抑制作用与CRBN的结合无关系。

[考察]

CRBN的功能是DDB1-Cul4A-Roc1 E3遍在蛋白连接酶复合体中的底 物受体的事实得到了支持。CRBN和作为已知底物受体的DDB2，与DDB1 竞争性结合。第二，CRBN与其他的底物受体同样地进行自身遍在蛋白化。 包括DDB2在内的多数底物受体具有WDXR结构(基序，motif)(引用文献 11、19)。另一方面，在少数的几个底物受体中缺失该WDXR结构(引用文 献13、18)。由于在CRBN中没有发现明确的WDXR基序，因而都是如后 者的类型。作为支持上述考虑的结果，可举出CRBN及Cul4A的利用斑 马鱼的表达抑制出现了类似的结果。但是，与CRBN的表达抑制相比， Cul4A的表达抑制对形质的影响更深刻。该观察结果并不奇怪。这是因为， 具有CRBN的DDB1-Cul4A遍在蛋白连接酶仅少量存在，CRBN仅对 DDB1-Cul4A的少数复合体有影响，另一方面，Cul4A的抑制影响所有复 合体。

沙利度胺的作用机理是多方面而且多角度的，并没有完全清楚。认为 沙利度胺的免疫调节作用、血管新生抑制作用与对麻风性结节性红斑、多 发性骨髓瘤的治疗效果或者致畸性相关(引用文献2、3)。另外报告了，沙 利度胺具有抑制TNF-alpha、VEGF等多种细胞因子的产生(引用文献30、 31)，以及细胞凋亡诱导、活性氧种(ROS)产生等作用(引用文献3、4、32)。 尽管积累了这些数据，但沙利度胺的直接靶向仍不明。在这里本发明者得 到了CRBN为沙利度胺的致畸性的主要的靶向因子的几个证据。第一，沙 利度胺直接与CRBN结合，并抑制CRBN的自身遍在蛋白化。原因是其 形成的遍在蛋白连接酶的抑制，在其他的遍在蛋白连接酶中也发现来类似 的现象(引用文献33)。第二，由沙利度胺引起的斑马鱼的发育异常，与将 CRBN进行表达抑制时类似，通过过表达沙利度胺非结合的CRBN突变体 而被缓和。第三，对于肢、·鳍的伸长所必须的FGF8是位于沙利度胺及 CRBN复合体的下游的靶向(图4D、4G、5C)。这些结果与过去的报告没 有矛盾而是一致的，利用沙利度胺的fgf8的表达抑制在使用兔的实验中已 经显示(引用文献34)。还报告了，在发育中的鸡的肢芽中，沙利度胺使BMP (骨形态发生蛋白，bone morphogenetic protein)的表达上升，并引起细胞 凋亡(引用文献32)。报告了小鼠BMP在AER中抑制FGF8的表达，并引 起细胞凋亡(引用文献35)。即CRBN是能够填补到目前为止不明的、在沙 利度胺与这些发育控制因子之间的空白的因子。

上述实施例的结果启示，由沙利度胺引起的致畸性是通过CRBN的结 合及与此相伴的遍在蛋白连接酶活性的抑制而引起的(图15)。本发明者推 测，由沙利度胺及CRBN引起的遍在蛋白依赖性的蛋白质分解的控制，造 成BMP、FGF8途径、正常发育机理的异常。其他的发生因子或许也受到 影响。但是，还残留很多的问题。有必要致力于以下问题：例如，含有CRBN 的E3复合体的靶向底物是什么、沙利度胺是怎样抑制CRBN的遍在蛋白 化等。

[实验方法与材料]

(1)试剂

添加二甲基亚砜(DMSO)使沙利度胺(Tocris Cookson)的终浓度为 400mM，加热至65℃使其溶解，立即使用。添加并进行溶解使MG132终 浓度为10mM。在实验中作为阴性对照(Control)使用等量的DMSO。

(2)沙利度胺固定化珠的制作

将关于沙利度胺固定化珠的制作的图示于图6。对磁性FG珠(5mg，引 用文献10)，使10mM的1-羟基苯并三唑、10mM 1-乙基-3-(3-二甲基-氨基 丙基)-碳二亚胺盐酸盐、以及2mM的FR259625(羧基沙利度胺衍生物)在 作为溶剂的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中在室温下反应4小时，从将沙利度 胺进行固定化。另外FG珠中的未反应的氨基通过在含有20％的醋酸酐的 DMF中反应来进行保护。完成的珠在4℃下保存。

(3)使用沙利度胺固定化珠的亲合纯化

沙利度胺固定化珠(0.5mg)用0.5％NP-40裂解缓冲液(50mM Tris  HCl pH值8，150mM NaCl，0.5％NP-40)进行平衡化。细胞提取液来自 HeLa、Jutkat、THP-1、U266，、HUVEC、LP101、SH-SY5Y、293T多种， 它们的提取法如同文献(引用文献36)。在这些提取液中混合珠，反应2小 时。用0.5％NP-40裂解缓冲液将珠洗涤3次后，用1mM沙利度胺进行 溶出。在几个实验中，在与珠的混合前将0.3mM的沙利度胺加入提取液中。 关于邻苯二甲酰亚胺是否结合，在以游离沙利度胺1mM进行溶出的过程 中，以1mM的邻苯二甲酰亚胺来替代沙利度胺进行溶出。

(4)质粒

CRBN、DDB2 cDNA是通过RT-PCR由HeLa总RNA得到的。CRBN 突变体通过标准的PCR法来制作。DDB1 cDNA接受来自Matsunaga博士 的提供。zCrbn及zCul4a cDNA是由24hpf的斑马鱼胚的总RNA通过 RT-PCR得到。在本研究中使用以下的载体。pcDNA3.1-FH-N、 pcDNA6/V5-His(Invitrogen)、pFastBac1(Invitrogen)、pLenti6(Invitrogen)、 pFASTBAC1(Invitrogen)、pLenti6(Invitrogen)、pCS2(+)及pGEX6P-1 (GE Healthcare)。pcDNA3.1-FH-N为pcDNA3.1的派生物，在pcDNA3.1 中导入有FLAG-HA序列。

(5)抗体

CRBN抗体是以人CRBN(65-76)为抗原由兔来制作的。FLAG(M2， Sigma)、HA(3F10，Roche)、V5(V5-10，Sigma)、GST(Sigma)、DDB1 (Abcam)及Roc1(Zymed)为购入。Cul4A及DDB2为转让，分别来自 Raychaudhuri博士、Matsunaga博士的厚赐。

(6)使用沙利度胺固定化珠的试验管内结合试验

重组CRBN-FLAG及DDB1-V5-His蛋白质在昆虫Sf9细胞中通过 Bac-to-bac(Invitrogen)杆状病毒系统来表达，分别通过抗FLAGm2琼脂 糖珠(Sigma)、Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)进行纯化。在纯化的CRBN-FLAG 和/或DDB1-V5-His中混合沙利度胺固定化珠，用SDS样品缓冲液溶出结 合蛋白质。在CRBN缺失突变体分析中，使GST融合CRBN及其突变体 在大肠菌BL21中表达，用谷胱甘肽-琼脂糖珠(GE helthcare)进行纯化。 CRBN突变体使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)导入293T细胞并使其过 表达。其后的结合试验与上述相同。

(7)免疫共沉淀

为了分析CRBN与DDB1间的相互作用，使CRBN-FLAG及 DDB1-V5-His在Sf9细胞内进行共表达。在细胞提取液中混合抗FLAG琼 脂糖珠，将结合因子用FLAG肽进行选择性溶出。为了纯化CRBN复合 体制作表达CRBN及其突变体的293T细胞，用上述的方法进行FLAG免 疫纯化。

(8)免疫染色

将过表达使用了HA标签或V5标签融合的CRBN、DDB1的HeLa 细胞进行固定后，与抗HA抗体或V5抗体混合，并使其与Alexa Fluor 594 或者488(Invitrogen)标记二抗反应。

(9)试验管内遍在蛋白化试验

遍在蛋白化试验参考引用文献37来进行。将FH-CRBN复合体 (200ng)、Uba 1(500ng，Biomol)、UbcH5b(500ng，Biomol)、GST-Ubiquitin (4000ng，Calbiochem)、4mM ATP在30℃下以15μl比例反应2小时。添 加SDS并在98℃加热5分钟使反应停止。

(10)活细胞中的自身遍在蛋白化

该试验参考引用文献38进行。在稳定表达FH-CRBN或者其突变体的 293T细胞中加入10μM的MG132或者单独的DMSO(载体)，反应3小时。 将细胞用含有25μM的MG132及10mM的N-乙基马来酰亚胺的RIPA缓 冲液溶解。将FH-CRBN用上述的方法进行免疫沉淀、分析。各浓度的沙 利度胺在处理MG132的1小时前添加。

(11)RNAi

使用如以下所示的Stealth RNAi oligonucleotide(Invitrogen)。

DDB1#1：5’-CAUACCUUGAUAAUGGUGUUGUGUU-3’(序列号1)

DDB1#2：5’-CAGUAAUGAACAAGGCUCCUAUGUA-3’(序列号2)

Cul4A#1：5’-GCAAAGCAUGUGGAUUCAAAGUUAA-3’(序列号3)

Cul4A#2：5’-GAAUCUCUGAUAGACAGAGACUAUA-3’(序列号4)

仅以正义链表示。作为对照使用Stealth RNAi negative control of low  GC content(Invitrogen)。使用Lipofectamine RNAiMAX在293T细胞中 导入40nM的寡核苷酸并在72小时后回收细胞。

(12)斑马鱼

鱼在28.5℃、14小时可见光周期、10小时暗周期的循环中饲养。

胚以自然交配来得到(引用文献35)。阿尔新蓝染色、显微注射、原位 杂交在以下项中显示。斑马鱼中的CRBN及Cul4A(zcrbn and zcul4a)按照 斑马鱼命名法委员会的指南。

(13)斑马鱼的沙利度胺处理

沙利度胺溶解于DMSO。接着添加在预先加热至65℃的E3培养基中 至400μM。将斑马鱼胚脱卵壳，如以下所示药浴沙利度胺。在2hpf将胚 在2mg/ml的蛋白酶型14(Sigma)中进行3分钟反应，用培养基洗涤5次。 在该过程中脱卵壳，立即交换成含沙利度胺培养基，观察3天。含沙利度 胺培养基每12小时更换。

(14)阿尔新蓝染色

将软骨细胞的外部基质用阿尔新蓝进行染色(引用文献40)。将斑马鱼 胚用3.7％的中性甲醛固定一夜。次日，用100％乙醇洗涤后，用PBS进行 再水合。接着，在含有0.05％胰蛋白酶的饱和四硼酸钠溶液中反应1-3小 时。通过3％的过氧化氢和1％的KOH溶液除去鱼的斑点，在含有70％甘 油的PBS溶液中保存。

(15)吗啉代反义寡核苷酸及mRNA的显微注射

单细胞期的显微注射按照引用文献39进行。我们在注入中使用氮气压 力微量注射器(IM 300，Narishige)。带帽(Cap)的mRNA在体外用 mMESSAGE mMACHINE体外转录试剂盒(Ambion)制作。

RNA在将要使用前用无核酸酶水调制成600ng/μl的浓度。反义寡核苷 酸(Gene Tools)如以下所述。

zCrbn AMO：5’-AGAGCTGTAGCTGGTTCCCCATTTC-3’(序列号5)

zCul4A AMO：5’-CTGGTGCTGAACATCTTCTGCCATC-3’(序列号6)

这些寡核苷酸用无核酸酶水调制成700μM的浓度来使用。

(16)整胚(wholemount)原位杂交

该实验按照引用文献41进行。zcrbn mRNA的反义探针使用5’-编码 区的513bp。zcul4a使用3’UTR(3’非编码区)的590bp。对应于shh及fgf8 的探针分别来自Krauss博士及Thisse博士的厚赐。为了增加探针的浸透 性，胚在含有0.1％Tween-20及10mg/ml的蛋白酶K的PBS中常温下反 应2分钟。

(17)听泡尺寸计测

对于48hpf的斑马鱼胚使用1％甲基纤维素及0.003％的3-氨基苯甲酸 乙酯(Sigma)实施麻醉，放置于载玻片。并且由各样品中随机选取10个个 体，将听泡拍照。尺寸使用NIH image J软件进行测量，与对照的听泡的 尺寸进行比较。计算平均值及标准偏差，p值使用曼-惠特尼U检验来算出。 吲用文献一览]

引用文献1：M.T.miller，K.Stromland，Teratology 60，306(1999).

引用文献2：M.melchert，A.List，Int.J.Biochem.Cell Biol.39，1489(2007).

引用文献3：J.Knobloch，U.Ruther，Cell Cycle 7，1121(2008).

引用文献4：T.Parman，m.J.Wiley，P.G.孔s，Nat.med.5，582(1999).

引用文献5：R.J.D′Amato，m.S.Loughnan，E.Flynn，J.Folkman，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，4082(1994).

引用文献6：J.Sheskin，Clin.Pharmacol.Ther.6，303(1965).

引用文献7：S.Singhal et al.，N.Engl.J.med.341，1565(1999).

引用文献8：J.B.Zeldis，B.A.Williams，S.D.Thomas，m.E.Elsayed，Clin. Ther.21，319(1999).

引用文献9：S.Sakamoto，Y.Kabe，m.Hatakeyama，Y.Yamaguchi，H. Handa，Chem.Rec.9，66(2009).

引用文献10：S.Sakamoto，Y.Kabe，m.Hatakeyama，Y.Yamaguchi，H. Handa，Chem.Rec.9，66(2009).

引用文献11：J.J.Higgins，J.Pucilowska，R.Q.Lombardi，J.P.Rooney， Neurology 63，1927(2004).

引用文献12：S.Angers et al.，Nature 443，590(2006).

引用文献13：R.Groisman et al.，Cell 113，357(2003).

引用文献14：F.Ohtake et al.，Nature 446，562(2007).

引用文献15：C.m.Pickart，Cell 116，181(2004).

引用文献16：M.D.Petroski，R.J.Deshaies，Nat.Rev.mol.Cell Biol.6，9 (2005).

引用文献17：K.Sugasawa et al.，Cell 121，387(2005).

引用文献18：R.Groisman et al.，Genes Dev.20，1429(2006).

引用文献19：O.Leupin，S.Bontron，m.Strubin，J.Virol.77，6274(2003).

引用文献20：J.Jin，E.E.Arias，J.Chen，J.W.Harper，J.C.Walter，mol. Cell 23，709(2006).

引用文献21：A.Nasevicius，S.C.Ekker，Nat.Genet.26，216(2000).

引用文献22：M.B.Veldman，S.Lin，Pediatr.Res.64，470(2008).

引用文献23：T.Yabu et al.，Blood 106，125(2005).

引用文献24：M.Tanaka et al.，Nature 416，527(2002).

引用文献25：M.C.Davis，R.D.Dahn，N.H.Shubin，Nature 447，473 (2007).

引用文献26：A.Streit，J.Anat.199，99(2001).

引用文献27：R.D.Riddle，R.L.Johnson，E.Laufer，C.Tabin，Cell 75， 1401(1993).

引用文献28：A.m.moon，m.R.Capecchi，Nat.Genet.26，455(2000).

引用文献29：M.Lewandoski，X.Sun，G.R.martin，Nat.Genet.26，460 (2000).

引用文献30：A.L.moreira et al.，J.Exp.med.177，1675(1993).

引用文献31：D.Gupta et al.，Leukemia 15，1950(2001).

引用文献32：J.Knobloch，J.D.Shaughnessy，Jr.，U.Ruther，FASEB J.21， 1410(2007).

引用文献33：T.Kamura，C.S.Brower，R.C.Conaway，J.W.Conaway，J. Biol.Chem.277，30388(2002).

引用文献34：J.m.Hansen，S.G.Gong，m.Philbert，C.Harris，Dev.Dyn. 225，186(2002).

引用文献35：S.Pajni-Underwood，C.P.Wilson，C.Elder，Y.mishina，m. Lewandoski，Development 134，2359(2007).

引用文献36：H.Uga et al.，mol.Pharmacol.70，1832(2006).

引用文献37：R.Groisman et al.，Cell 113，357(2003).

引用文献38：F.Ohtake et al.，Nature 446，562(2007).

引用文献39：H.Ando，T.Furuta，H.Okamoto，methods Cell Biol.77，159 (2004).

引用文献40：W.L.Kelly，m.m.Bryden，Stain Technol.58，131(1983).

引用文献41：C.Thisse，B.Thisse，Nat.Protoc.3，59(2008).

产业可利用性

本发明可用于判定被验物质是否具有沙利度胺样的致畸性，并可用于 开发沙利度胺的代替药或抑制沙利度胺的致畸性的药品等。