一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法

摘要

本发明公开了一种中性粒细胞抗菌肽(HNP)阻断剂治疗败血症的方法，包括制备小分子干扰RNA(siRNA)和抗人HNP抗体等阻断剂，阻断、中和及减少中性粒细胞HNP的产量、功能和生物活性。通过设计和化学合成法，体外制备小分子siRNA。通过设计生产HNP-1多肽与KLH交联，然后免疫试验兔，获得兔免疫球蛋白。用同一个HNP-1多肽，免疫小鼠，制备抗HNP-1抗体的可变区，然后制成人源化单克隆抗人HNP-1抗体。小分子siRNA和抗人HNP-1抗体均能有效阻断、中和及减少中性粒细胞的HNP产量、功能和生物活性，可用于治疗细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域。具体来说，本发明涉及一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法，包括制备小分子干扰RNA(siRNA)和抗人HNP抗体等阻断剂，阻断、中和及减少中性粒细胞HNP的产量、功能和生物活性，治疗细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。 

背景技术

已知中性粒细胞在败血症及多器官功能衰竭的发生发展中起着关键性的作用【参阅文献Brown，等，Lancet 368，157-169(2006)】。中性粒细胞含有大量的多肽、酶、小分子等物质。他们在杀死、裂解和消灭被吞噬进入中性粒细胞内的细菌、病毒和真菌有重要作用。然而，这一作用只有在中性粒细胞内可以完全发挥。一旦中性粒细胞自身裂解，这些物质可以损伤周边细胞、组织、乃至器官。因此，保护中性粒细胞完整是治疗败血症的重要手段。 

防御肽(defensin)在机体天然免疫中发挥重要作用【参阅文献Klotman等，Nat Rev Immunol 6，447-56(2006)和Selsted等，Nat Immunol 6，551-7(2005)】。他们直接或间接地杀伤细菌、病毒、真菌及其他微生物。人体白细胞和上皮细胞产生和分泌多种防御肽。人中性粒细胞分泌的有中性粒细胞防御肽(HNP)，包括HNP-1、-2、-3和-4，是主要的α-防御肽，它们在中性粒细胞防御和控制感染中起到重要作用。肠道Paneth细胞也分泌α-防御肽。它们是HD-5和HD-6二种，是肠道防御和控制感染的主要门户。许多表皮细胞，如多种上皮细胞及皮肤细胞等则分泌β-防御肽，如hBD-1、hBD-2、hBD-3、hBD-4等等。 

中性粒细胞中多达40％的蛋白成分是HNP【参阅文献Ganz等，Curr OpinImmunol 6，584-9(1994)和Selsted等，J Clin Invest 76，1436-1439(1985)】。这些HNP在正常情况下包囊在中性粒细胞的分泌颗粒内。因此，正常情况下人血清中HNP的浓度非常低，多数检测不到，最高在0.2微克/毫升。然而，在病理情况下，特别是在细菌感染时，大量中性粒细胞被活化并破坏，血液中HNP 含量明显升高【参阅文献Brown，等，Lancet 368，157-169(2006)】。已有报道称细菌感染性败血症时血液中HNP量可以达到170微克/毫升【参阅文献Ihi等，Clin Infect Dis 25，1134-1140(1997)和Panyutich等，J Lab Clin Med122，202-207(1993)】。这提示HNP除了直接杀灭外侵的微生物之外，还可能有病理性致病作用。文献尚未报道过HNP在败血症中有病理性致病作用。只有一篇文献提到大剂量HNP用于正常大鼠肺部时致使其肺功能低下和肺功能衰竭【参阅文献Zhang等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 280，L947-L954(2001)】。这只能间接表明HNP可能在败血症的发生发展中有重要作用。 

到目前为止，尚无医学和药学方法来阻断、减少和中和中性粒细胞HNP的产量、功能和生物活性，用于治疗细菌感染引起的败血症等疾病。 

发明内容

本发明的目的就是用医学和药学方法来阻断、减少和中和中性粒细胞外HNP的产量、功能和生物活性，治疗细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。首创一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症和其他相关疾病的方法，包括制备小分子干扰RNA(siRNA)和抗人HNP抗体阻断剂，阻断、减少和中和中性粒细胞HNP产量、功能和生物活性，治疗细菌感染引起的败血症和其他相关疾病。 

为实现本发明之目的，本发明中性粒细胞抗菌肽阻断剂通过以下技术方案来实现。

1、制备siRNA。经酶切的双链RNA会形成很多小片段，称为小片段抑制RNA(siRNA)。siRNA与信使RNA(mRNA)的同源序列互补结合，使mRNA降解成小片段RNA，从而导致mRNA失去功能，不能被翻译成蛋白质。设计siRNA，5′-AGGCACUGCUCUCCAAGAU-3′，并应用化学合成法体外制备siRNA小片段，保存于含有RNA稳定剂的溶液中。理论上，siRNA小片段可以用于减少中性粒细胞所有HNP亚型(HNP-1-4)的表达水平。该小分子siRNA可以有效地减少中性粒细胞产生HNP(见图1)。从而确保单一siRNA制剂可以有效降低同源互补HNP蛋白。 

2、制备抗人HNP-1抗体。为了生产特异的抗人HNP-1抗体，设计生产了HNP-1多肽，CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC。把这一多肽与KLH交联，然后免疫试验兔，取得大量抗体血清。再经免疫学亲和层析的方法纯化兔血清，获得兔 免疫球蛋白(IgG)。经动物和细胞试验结果表明，该抗人HNP-1抗体可以有效地中和中性粒细胞外HNP(见图2和图3)。为了达到治病这一目的，需要生产特异的人源化单克隆抗人HNP抗体。应用上述相同的HNP-1多肽，CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC，与KLH交联后，免疫Balb/c小鼠，ELISA方法证明产生了高效价的抗人HNP-1抗体。制备抗HNP-1抗体的可变区，然后制成人源化单克隆抗人HNP-1抗体。图4为人源化单克隆抗人HNP抗体的生产程序。 

HNP阻断剂治疗细菌感染引起的败血症和其他各类疾病是本发明的核心部分。siRNA和抗人HNP-1抗体，均能有效地抑制和阻断HNP产量、功能和生物活性。抗人HNP-1抗体能够抑制HNP引起的细胞损伤，也能抑制HNP导致的细胞凋亡。 

siRNA和抗人HNP-1抗体是二种不同的制剂。siRNA减少HNP在中性粒细胞内表达，然而抗人HNP-1抗体则是中和中性粒细胞外的HNP-1，所以这二种制剂同时应用可能有加强作用。 

本发明具有减少、抑制和消除HNP在细菌感染性疾病中的致病作用。与抗生素联合用药，可以加强抗生素的治疗效果。 

附图说明 

图1：siRNA降低HNP表达水平。从人骨髓分离培养单个核细胞，用每毫升1×16-8慢病毒pfu感染骨髓细胞导入siRNA48小时后，取1.5微克总RNA反转录成cDNA，50倍稀释后定量PCR检测HNP表达水平。 

图2：抗HNP-1抗体中和中性粒细胞外HNP激活Akt。从人痰液中提取的HNP复合物与抗人HNP-1抗体孵育30分钟后作用于肺癌A549细胞30分钟。裂解细胞后用免疫酶标记法检测细胞内Akt活性。*，#p＜0.001vs HNP组。 

图3：抗HNP-1抗体中和中性粒细胞外HNP引起细胞凋亡。从人痰液中提取的HNP复合物与抗人HNP-1抗体孵育30分钟后共同作用于肺癌A549细胞8小时后检测细胞凋亡。*，#p＜0.001vs HNP组。 

图4人源化单克隆抗人HNP抗体的生产程序 

具体实施方式

为进一步描述本发明，下面结合实施例对本发明一种中性粒细胞抗菌肽阻断剂治疗败血症的方法作进一步的描述。 

实施例1 

为高效表达siRNA，使用了慢病毒载体(Lentiviral vector)系统，因为慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围。基因序列AGGCACTGCTCTCCAAGAT被组装入自行研制的慢病毒载体中。慢病毒载体与其他载体成分共同导入人293T细胞中，以便复制表达慢病毒。48小时后，慢病毒滴度达到每毫升1×10¹³空斑形成单位(pfu)。 

为了检验上述siRNA能够有效抑制HNP表达，从大鼠骨髓中制备骨髓细胞。颈椎脱臼处死2只Wistar大鼠。75％酒精消毒全身，共取4根股骨。用RPMI1640(pH7.2)在无菌环境中冲洗出全部骨髓细胞。用吸管吹打5次，再通过4号针头5次，制成单细胞悬液。在1000转/分钟下离心10分钟，弃上清。沉淀用RPMI1640液调细胞浓度至每毫升1×10⁷个。用2％台盼蓝染色检查骨髓细胞活性，每次制备的细胞活性都在95％以上。于6孔板中加入1毫升1×10⁷个细胞培养。次日，用每毫升1×10⁸pfu慢病毒感染骨髓细胞48小时后提取总RNA，用1.5微克总RNA反转录成cDNA，50倍稀释后定量PCR检测HNP表达水平。如图1所示，在每毫升1×10⁶pfu慢病毒感染后骨髓细胞的HNP表达水平即有明显下降。用每毫升1×10⁸pfu慢病毒感染后更大程度地降低了骨髓细胞表达HNP。 

实施例2 

为了阐明抗人HNP-1抗体能够有效中和中性粒细胞外HNP的活性，作了二个试验。第一个试验，从30例慢性支气管肺炎病人的混合痰液中提取了复合HNP(70％为HNP-1、21％是HNP-2和只有5％是HNP-3，没有可检测的HNP-4)【参阅 文献Khine，等，Blood 107，2936-2942(2006)】。100微克/毫升HNP复合物与抗人HNP-1抗体(1、10和200微克/毫升)室温下孵育30分钟后，取其混合物10微克/毫升作用于肺癌A549细胞，30分钟后裂解细胞用免疫酶标记法检测细胞内Akt酶活性。结果显示抗人HNP-1抗体可以阻断HNP激活肺癌A549细胞内Akt酶活性【见图2】。第二个试验，用人痰液中提取的100微克/毫升HNP复合物与抗人HNP-1抗体(1、10和200微克/毫升)孵育30分钟后，共同作用于肺癌A549细胞，8小时后用Apoptosis Detection Kit检测细胞凋亡【见图3】。很明显，单用HNP复合物(100微克/毫升)后，65％细胞凋亡。抗人HNP-1抗体在1微克/毫升水平即已明显阻止HNP的细胞毒性作用。剂量加大后，抗人HNP-1抗体的这种阻断效应增强。 

最后，用抗人HNP抗体治疗败血症动物模型。败血症动物模型是在Wi star大鼠中建立的。总共6只Wistar大鼠被用于试验，其中3只大鼠腹腔内注射抗人HNP-1抗体(50微克/公斤)，3只大鼠腹腔内注射生理盐水作对照。生理盐水注射大鼠均成功诱导败血症，而抗人HNP-1抗体治疗者无一例败血症诱导成功。