用于核酸转染的二硫化物连接的聚乙二醇/肽缀合物

摘要

本发明涉及通式(I)的新型聚合载体分子及其变化形式，其允许在体内和体外将核酸有效地转染到细胞中，涉及由核酸和所述新型聚合载体分子形成的聚合载体货物复合物，还涉及制备所述新型聚合载体分子和所述新型聚合载体货物复合物的方法。本发明还提供所述新型聚合载体分子和新型聚合载体货物复合物作为用于治疗各种疾病的药物和在制备用于治疗此类疾病的药物组合物中的应用方法和用途。

说明书

本发明涉及通式(I)的新型聚合载体分子及其变化形式，其允许在体内 和体外将核酸有效地转染到细胞中，涉及由核酸和所述新型聚合载体分子 形成的聚合载体货物复合物，还涉及制备所述新型聚合载体分子和所述新 型聚合载体货物复合物的方法。本发明还提供所述新型聚合载体分子和新 型聚合载体货物复合物作为用于治疗各种疾病的药物和在制备用于治疗 此类疾病的药物组合物中的应用方法和用途。

目前，多种疾病需要涉及施用基于肽、蛋白、和核酸的药物、特别是 涉及将核酸转染到细胞或组织中的治疗。基于肽、蛋白、和核酸的药物的 完全治疗能力通常受到它们有限的穿过哺乳动物细胞质膜的能力的损害， 这导致较差的细胞通过和不充分的治疗功效。目前，这种妨碍代表着对于 生物医学开发和多种生物制药商业成功的主要挑战(参见，例如，Foerg 和Merkle，Journal of Pharmaceutical Sciences(制药科学杂志)，在线公布 于www.interscience.wiley.com，2008，97(1)：144-62)。

对于一些疾病或病症，已经开发了基因治疗途径作为此类治疗的特定 形式。这些治疗通常利用将核酸或基因转染到细胞或组织中，而基因治疗 方法另外涉及将这些核酸或基因中的一种或多种插入到个体细胞和组织 中来治疗疾病，例如，遗传性疾病，其中缺陷型突变等位基因被有功能的 等位基因替换。

然而，目前，将这些核酸或基因中的一种或多种转移或插入到个体细 胞中仍然代表主要的挑战，并且对于确保基于核酸的药物的良好治疗效果 (特别是在基因治疗领域中)绝对是必需的。

为了实现将核酸或基因成功转移到个体细胞中，必须克服多种不同的 障碍。核酸的转运典型地通过核酸与细胞膜的缔合以及随后由内体摄入而 进行。在内体中，引入的核酸与胞质分开。当在细胞溶胶中进行表达时， 这些核酸必须脱离胞质。如果核酸不成功脱离胞质，则内体与溶酶体融合 导致其内含物的降解，或者内体与细胞膜融合导致其内含物返回到细胞外 介质中。为了有效转移核酸，因此，内体逃逸似乎是除转染效率本身之外 最重要的步骤之一。迄今为止，存在解释这些问题的不同途径。然而，没 有一种途径至少在所有方面是成功的。

目前，本领域中所用的转染剂典型地包括肽、不同的聚合物、脂质以 及纳米颗粒和微粒(参见，例如，Gao，X.，K.S.Kim，等(2007)，Aaps J  9(1)：E92-104)。这些转染剂典型地已经仅成功地用在体外反应中。当在体 内将核酸转染到活动物的细胞中时，必须满足进一步的需要。例如，考虑 到凝集，复合物必须在生理盐溶液中是稳定的。此外，其不与宿主补体系 统的各部分相互作用。另外，复合物应该保护核酸不被到处存在的核酸酶 过早地在细胞外降解。此外，对于基因治疗应用，极其重要的是，载体不 被适应性免疫系统识别(免疫原性)并且不刺激非特异性的细胞因子爆发 (unspecific cytokine storm)(急性免疫应答)(参见Gao，Kim等，(2007， 同上)；Martin，M.E.和K.G.Rice(2007)，Aaps J 9(1)：E18-29；以及Foerg 和Merkle，(2008，同上))。

Foerg和Merkle(2008，同上)讨论基于肽、蛋白和核酸的药物的治疗 潜力。根据他们的分析，这些药物的完全的治疗潜力通常被其有限的穿过 哺乳动物细胞质膜的能力所损害，这导致较差的细胞通过和不充分的治疗 功效。目前，这种妨碍代表着对于生物医学开发和多种生物制药商业成功 的主要挑战。

在这种情形中，Gao等(Gao等The AAPS Journal(AAPS杂志)2007； 9(1)论文9)注意到在开发将治疗性基因递送至所选的细胞(在其中可以 获得正确的基因表达)的方法中对基因治疗的主要挑战。然而，基因递送 和将核酸特别成功的转染到细胞或组织中并不简单，并且典型地取决于多 种因素。为了成功的递送，例如，将核酸或基因递送至细胞或组织，必须 克服许多障碍。根据Gao等(2007)，一种理想的基因递送方法需要满足 3个主要标准：(1)应该保护转基因在细胞内基质中不被核酸酶降解，(2) 应该使得转基因穿过质膜，和(3)应该没有有害作用。

这些目标必须使用不同化合物或载体的组合来实现。显著地，存在一 些化合物或载体，其至少克服这些障碍中的一些。

最常见地，例如，核酸的转染，使用病毒或非病毒载体进行。为了成 功的递送，这些病毒或非病毒载体必须能够克服上文提及的障碍。目前可 用的最成功的基因治疗策略依赖于使用病毒载体，诸如腺病毒、腺相关病 毒、反转录病毒、和疱疹病毒。病毒载体能够以高效和长期基因表达的可 能性介导基因转移，并且满足3个标准中的2个。然而，基因治疗临床试 验所不包括的急性免疫反应、免疫原性、和插入诱变已经引起关于一些常 用病毒载体的严重的安全性关注。

当使用非病毒载体时，可能发现对该问题的解决方案。尽管非病毒载 体不如病毒载体有效，但是已经开发了多种非病毒载体来提供基因治疗的 更安全的备选方案。已经使用物理(无载体基因递送)和化学方法(基于 合成载体的基因递送)研究了非病毒基因递送方法。物理方法通常包括针 头注射、电穿孔、基因枪、超声、和流体动力学递送，利用穿透细胞膜并 且促使细胞内基因转移的物理力进行。化学方法典型地使用合成的或天然 存在的化合物(阳离子脂质、阳离子聚合物、脂质-聚合物杂化系统)作 为载体将转基因递送至细胞。尽管已经在基础科学和多种非病毒基因递送 系统的应用中取得了显著的进展，但是大部分的非病毒方法的有效性仍然 比病毒载体差得多，尤其是用于体内基因递送时(例如，参见，Gao等The  AAPS Journal(AAPS杂志)2007；9(1)论文9)。

在过去的十年间，已经宣告了对于核酸细胞递送的实质性改善的有吸 引力的展望，认为这由其与所谓的细胞穿透肽(CPPs)的物理组装或化学连 接所导致，所述细胞穿透肽也表示为蛋白-转导结构域(PTDs)(参见Foerg 和Merkle，(2008，同上))。CPPs表示10至约30个氨基酸的短肽序列， 其可以穿过哺乳动物细胞的质膜，并且因此可以为细胞药物递送提供无比 的机会。几乎所有这些肽都包含一系列与序列组合的阳离子氨基酸，其在 低pH下形成α-螺旋。当在体内pH通过质子泵持续降低时，通常快速起 始肽的构象变化。该螺旋基序介导插入到内体的膜中，导致其内容物释放 到细胞质中(参见Foerg和Merkle，(2008，同上)；和Vives，E.，P.Brodin， 等(1997).″A truncated HIV-1Tat protein basic domain rapidly translocates  through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus(截短的 HIV-1Tat蛋白碱性结构域快速通过质膜易位并且在细胞核中积聚).″J  Biol Chem(生物化学杂志)272(25)：16010-7)。尽管有这些优点，但是认 为CPP介导的药物递送的主要障碍由在与上皮和内皮的酶屏障接触或通 过上皮和内皮的酶屏障时的常见的肽快速代谢清除所组成。总之，CPPs 的代谢稳定性代表着其细胞生物利用度的重要生物制药学因素。然而，在 本领域中没有可用的CPPs，所述CPPs一方面足够稳定，足以在它们被 代谢清除之前将它们的货物运送到靶标，并且另一方面，在它们可能积聚 并且达到毒性水平之前可以从组织中清除。

本领域用于将货物分子递送到细胞中(例如，用于基因治疗)的另一 种方法包括肽配体(参见Martin和Rice(参见Martin和Rice，The AAPS  Journal(AAPS杂志)2007；9(1)论文3))。肽配体可以是取自较长蛋白 的短序列，其代表受体识别所需要的基本氨基酸，诸如用于靶向癌细胞的 EGF肽。已经鉴别了其它的肽配体，包括用于靶向凝集素-样氧化的LDL 受体(LOX-1)的配体。内皮细胞中LOX-1的上调与功能障碍状态如高血压 和动脉粥样硬化(atherosclerosis)相关。然而，此类肽配体不适用于多种 基因治疗途径，因为它们不能通过复合或黏附与其货物分子连接，而是需 要共价键，例如，交联剂，这典型地在细胞中表现出细胞毒性作用。

在本领域中，合成的载体也可以用于将货物分子递送到细胞中，例如， 用于基因治疗目的。然而，许多合成的载体的一个主要缺点是它们比病毒 载体差的转染效率，并且需要显著的改善才能够获得进一步的临床发展。 已经鉴定了限制核酸体外和体内转运的一些障碍，并且包括载体在生理条 件下较差的细胞内递送、毒性和不稳定性(参见，例如Read，M.L.，K.H. Bremner，等(2003).″Vectors based on reducible polycations facilitate  intracellular release of nucleic acids(基于可还原的聚阳离子的载体促进核 酸的细胞内释放).″J Gene Med(基因医学杂志)5(3)：232-45)。

基因治疗的一种特定的方法使用阳离子脂质。然而，尽管多种阳离子 脂质在细胞培养中表现出极好的转染活性，但是大部分在存在血清的条件 下表现得不好，仅有一些在体内有活性。当脂质复合物(lipoplexes)暴露于 血液、黏液上皮细胞衬液、或组织基质中存在的压倒性量的带负电荷且通 常是两性的蛋白和多糖时，在尺寸、表面电荷、和脂质组成方面发生急剧 变化。当体内施用时，脂质复合物倾向于与带负电荷的血液成分相互作用， 并且形成可能吸附到循环的红血细胞表面上、截留在厚的黏膜层或栓塞在 微血管中的大聚集体，这防止它们到达远端位置的既定靶细胞。此外，已 经观察到了与脂质复合物基因转运相关的毒性。症状特别包括诱导炎性细 胞因子。在人类中，在接受脂质复合物的受试者中观察到不同程度的不利 的炎性反应，包括流感样症状。因此，关于脂质复合物是否可以完全安全 地在人类中使用似乎是有疑问的。

基因治疗的另一种更有希望的方法使用阳离子聚合物。证明阳离子聚 合物对核酸转染是有效的，因为它们可以紧紧复合并缩合带负电荷的核 酸。因此，已经研究了多种阳离子聚合物作为体外和体内基因递送的载体。 这些包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚酰胺型胺类(polyamidoamine)和聚丙胺树 状聚体，聚丙烯胺，阳离子葡聚糖，壳聚糖，阳离子蛋白和阳离子肽。尽 管大部分阳离子聚合物共有将DNA缩合成小颗粒的功能并且通过经由与 细胞表面上阴离子位点的电荷-电荷相互作用的内吞作用促进细胞摄入， 但是它们的转染活性和毒性显著不同。有趣的是，由于较强的带负电荷核 酸货物的复合作用，随分子量升高，阳离子聚合物表现出更好的转染效率。 然而，升高的分子量也导致阳离子聚合物升高的毒性。PEI可能是活性最 强的，且是研究最多的用于基因递送的聚合物，但是其作为转染试剂的主 要缺点涉及其非生物降解的性质和毒性。此外，即使由高分子量聚合物形 成的人工合成多聚体(polyplexes)在生理条件下表现出提高的稳定性， 但是数据已表明此类聚合物可能妨碍载体卸载(unpacking)。例如，19 和36个残基的聚(L-赖氨酸)(PLL)表现出比180个残基的PLL更迅速 地与DNA解离，导致显著提高的短期基因表达。将DNA压缩成在受体 介导的基因递送中有活性的结构需要6-8个阳离子氨基酸的最短长度。然 而，由短的聚阳离子形成的人工合成多聚体在生理条件下是不稳定的，并 且典型地在生理盐溶液中迅速聚集。为了克服这一不利影响，Read等(参 见Read，M.L.，K.H.Bremner，等(2003).″Vectors based on reducible  polycations facilitate intracellular release of nucleic acids(基于可还原的聚阳 离子的载体促进核酸的细胞内释放).″J Gene Med(基因医学杂志)5(3)： 232-45；和Read，M.L.，S.Singh，等(2005).″A versatile reducible  polycation-based system for efficient delivery of a broad range of nucleic  acids(用于有效递送宽泛范围的核酸的通用基于聚阳离子的系统).″ Nucleic Acids Res(核酸研究)33(9)：e86)研发了一种新型合成的载体，该 载体基于通过肽Cys-Lys₁₀-Cys的氧化缩聚制备的直链可还原的聚阳离子 (RPC)，其可以通过细胞内环境分裂，从而促进核酸的释放。他们可能表 明，由RPC形成的人工合成多聚体通过还原条件而去稳定，能够有效释 放DNA和mRNA。RPC的分裂还将聚阳离子的毒性减少至与低分子量肽 相当的水平。Read等(2003，同上)的这种方法的缺点是另外需要内体裂 解剂氯喹或阳离子脂质DOTAP将转染效率提高至足够的水平。结果， Read等(2005，同上)在具有已知的内体缓冲能力的RPCs中包括组氨酸 残基。他们可能表明，富含组氨酸的RPCs可以被细胞内还原环境分裂， 能够在不需要内体裂解剂氯喹的条件下进行宽泛范围核酸的有效的细胞 质递送，所述核酸包括质粒DNA、mRNA和siRNA分子。

不幸的是，Read等(2005，同上)没有评价富含组氨酸的RPCs是否 可以直接用于体内应用。在他们的研究中，转染在不存在血清的条件下进 行，以避免可能由于血清蛋白与限制细胞摄入的人工合成多聚体的结合导 致的对组氨酸残基增强基因转运的能力的掩蔽。初步的实验表明富含组氨 酸的RPC人工合成多聚体的转染特性可以受到血清蛋白存在的影响，在 10％FCS(胎牛血清)中观察到GFP-阳性细胞减少50％。对于体内应用， 他们提议用亲水性聚合物聚-[N-(2羟基-丙基)甲基丙烯酰胺]进行修饰。不 幸的是，Read等(2005，同上)没有防止人工合成多聚体的聚集和聚阳离 子蛋白与血清蛋白的结合。此外，由于聚合物大量过剩(其特征在于高 N/P比率)，当复合核酸时，形成强阳离子复合物，由于它们强烈的盐诱 导凝集的倾向和与血清内容物的相互作用(调理作用(opsonization))，它 们仅在体内有有限的应用。另外，当用于基因治疗目的时，这些复合物可 能激发急性免疫应答。Read等(2003，同上)也没有提供公布中所示的关 于基于RPC的复合物的体内数据。还证明这些基于强阳离子RPC的复合 物在局部施用到皮肤中后完全没有活性。此外，Read等(2005，同上) 使用严格的氧化条件(30％DMSO)来诱导产生具有尽可能长的链长度的 高分子聚合物(“逐步生长聚合作用”)，从而确保核酸货物的完全复合。

以与Read等相似的方法，McKenzie等(McKenzie，D.L.，K.Y. Kwok，等(2000)，J Biol Chem(生物化学杂志)275(14)：9970-7.， McKenzie，D.L.，E.Smiley，等(2000)，Bioconjug Chem(生物缀合化 学)11(6)：901-9，和US 6,770,740 B1)出于减少对高分子聚阳离子观察到 的毒性的目的通过将多个半胱氨酸插入到短的合成肽中而开发了自交联 的肽作为基因递送剂。为了复合DNA，他们将自交联肽与DNA混合以 诱导肽间二硫键同时复合DNA货物。对于体内基因递送方法，他们提议 用在远离每个末端的位点可操作地连接到肽上的隐形剂(stealthing agent) (例如，聚乙二醇)或靶向剂衍生自交联肽。在另一种方法中，为掩蔽 DNA肽缩合物并由此减少与血液成分的相互作用的目的，同作者研发了 通过可还原或不可还原的连接用聚乙二醇衍生非交联阳离子肽CWK₁₈(Kwok，K.Y.，D.L.McKenzie，等(1999).″Formulation of highly soluble  poly(ethylene glycol)-peptide DNA condensates(配制高度可溶的聚(乙二 醇)-肽DNA缩合物).″J Pharm Sci(药学科学杂志)88(10)：996-1003.)。

总结上述，上文示例的现有技术有多种缺点。Read等(2003，同上) 或McKenzie等(2000 I和II，同上与US 6,770,740 B1)所述的自交联肽 的一个特别的缺点涉及在所形成的颗粒表面上的高正电荷。由于高的正电 荷，当这些颗粒在体内经历升高的盐浓度时，所述颗粒表现出倾向于凝集 的高度不稳定性。然而，这样的盐浓度在体内典型地存在于细胞或细胞外 介质中。此外，高度带正电荷的复合物表现出强烈的调理作用倾向。这导 致增加的由巨噬细胞的摄入，并且由于降解导致该复合物快速失活。具体 地，免疫系统细胞对这些复合物的摄入通常导致不同细胞因子的下游刺 激。然而，先天免疫系统的这种非特异性活化代表这些系统的严重缺点， 应该避免，特别是出于基因治疗的一些方面的目的，其中应该严格避免急 性免疫应答(细胞因子爆发)。另外，在生物系统中，带正电荷的复合物 可以容易地被细胞外基质或血清的带负电荷成分结合或固定。此外，复合 物中的核酸可能释放得太早，这导致复合物在体内的转运效率和半衰期降 低。此外，用对体内基因递送有利的隐形剂(如聚乙二醇(PEG))对载体 的可逆性衍生仅对肽单体是可能的，对自交联肽不可能，或相反用于具有 确定的聚合物链长度的聚合载体。特别地，这样的可逆性衍生在交联的阳 离子肽载体的末端是不可能的。另外，在现有技术中，仅记述了具有长聚 合物链或具有由自交联肽组成的不限定的聚合物链长度的高分子聚合物， 不利的是，其将它们的货物压缩到细胞中货物释放受到限制这样的程度。 这种极端不确定的聚合物链长度对于基于RPC的药物的批准更加有问 题。批准药物的一个前提是每种药物制剂总是具有相同的组成、相同的结 构和相同的特性。对于基于来自现有技术的RPC’s的复合物，这不能得 到确切的保证。此外，现有技术中提供的基于RPC的聚合物或复合物由 于其不确定的结构或聚合物链长度难以进行表征。但是，所得到的复合物 或聚合载体的表征对于药物的批准绝对是必需的。

因此，目前为止，还没有出现这样的可行的方法或载体：其允许压缩 和稳定核酸用于基因治疗目的或其它治疗应用，其表现出良好的转染活性 并结合核酸货物的良好释放，特别是在体内，并且毒性低或者甚至没有活 性，例如，由于通过自交联聚合物对核酸的可逆隐形和可逆复合的组合所 导致。因此，本领域对提供用于基因转运目的的载体仍然存在迫切的需求， 所述载体一方面足够稳定足以在它们被代谢分解之前将它们的货物运送 至靶标，并且另一方面可以在它们可能积聚且达到毒性水平之前从组织中 清除。

因此，本发明的目的是提供一种载体或络合剂(complexing agent)， 特别是用于基因治疗目的或其它治疗应用的核酸转染，其能够压缩核酸， 优选编码DNA或编码RNA，诸如mRNA，并且其不但允许在体外将核 酸有效转染到不同的细胞系中，而且允许在体内的转染。因为细胞摄入通 过内体途径发生，这样的载体或络合剂还应该允许或提供有效的核酸释 放。另外，优选的是，由核酸货物和所述载体或络合剂形成的本发明的聚 合载体货物复合物表现出提高的凝聚抗性。对于包含血清的介质，优选地， 还应该赋予核酸货物增加的稳定性。最重要的是，应该获得体内活性，由 此至少部分抑制急性免疫反应。此外，应该保证所述载体的可重现的生产 和表征。

这一目的通过本发明的主题得以解决，优选地通过后附权利要求的主 题得以解决。特别地，按照本发明的第一实施方案，上述目的通过通式(I) 的聚合载体分子得以解决：

L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L

其中，

P¹和P³彼此不同或相同，并且表示直链或支链的亲水性聚合物链， 每个P¹和P³具有至少一个-SH-结构部分，当与组分P²、或备 选地与(AA)_x、或[(AA)_x]_z(如果所述组分用作P¹和P²或P³和 P²之间的接头)和/或与其他组分(例如，(AA)_x，[(AA)_x]_z或 L)缩合时能够形成二硫键，所述直链或支链的亲水性聚合物 链彼此独立地选自聚乙二醇(PEG)，聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙 烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱，聚(羟烷基 L-天冬酰胺)，聚(2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基磷酸胆碱)，羟乙 基淀粉或聚(羟烷基L-谷氨酰胺)，其中所述亲水性聚合物链具 有约1kDa至约100kDa的分子量，优选约2kDa至约25kDa 的分子量；或更优选约2kDa至约10kDa的分子量，例如， 约5kDa至约25kDa或5kDa至约10kDa的分子量；

P²是阳离子或聚阳离子肽或蛋白，优选具有约3至约100个氨 基酸的长度，更优选具有约3至约50个氨基酸的长度，甚至 更优选具有约3至约25个氨基酸的长度，例如，约3至10， 5至15，10至20或15至25个氨基酸的长度，更优选具有约 5至约20个氨基酸的长度，甚至更优选具有约10至约20个 氨基酸的长度；

是阳离子或聚阳离子聚合物，典型地具有约0.5kDa至约30 kDa的分子量，包括约1kDa至约20kDa的分子量，甚至更 优选约1.5kDa至约10kDa的分子量，或具有约0.5kDa至 约100kDa的分子量，包括约10kDa至约50kDa的分子量， 甚至更优选约10kDa至约30kDa的分子量；

每个P²具有至少两个-SH-结构部分，当与其它组分P²或组分 P¹和/或P³或备选地与其他组分(例如，(AA)_x，或[(AA)_x]_z) 缩合时能够形成二硫键；

-S-S-是(可逆的)二硫键(对于更好的可读性，忽略括号)，其中 S优选地表示硫或-SH携带结构部分，其已经形成(可逆的) 二硫键。所述(可逆的)二硫键优选地通过任一组分P¹与P²， P²与P²，或P²与P³，或任选地本文定义的其他组分(例如，L， (AA)_x，[(AA)_x]_z等)的-SH-结构部分的缩合形成；所述-SH-结 构部分可以是这些组分结构的一部分或通过下文定义的修饰 添加；

L是任选的配体，其可以存在或不存在，并且可以独立于其它 选自RGD，转铁蛋白，叶酸，信号肽或信号序列，定位信号 或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体，细胞穿透肽(例如， TAT或KALA)，受体的配体(例如，细胞因子，激素，生长 因子等)，小分子(例如，糖类，如甘露糖或半乳糖或合成的 配体)，小分子激动剂，受体的抑制剂或拮抗剂(例如，RGD 肽模拟类似物)等；

n是整数，其典型地选自约1至50的范围，优选地选自约1，2 或3至30的范围，更优选选自约1，2，3，4，或5至25的 范围，或约1，2，3，4，或5至20的范围，或约1，2，3， 4，或5至15的范围，或约1，2，3，4，或5至10的范围， 包括例如约4至9，4至10，3至20，4至20，5至20，或 10至20的范围，或约3至15，4至15，5至15，或10至15 的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，n在约1， 2，3，4，或5至10的范围内，更优选地在约1，2，3，或4 至9的范围内，在约1，2，3，或4至8的范围内，或在约1， 2，或3至7的范围内。

本发明通式(I)的聚合载体分子通过新合成策略制备，并且有利地允 许限定聚合物链的长度，并且将不同(短)聚合物的理想特性组合到一种 聚合物中，例如，为了基因治疗或其他治疗应用的目的的有效核酸转染的 目的有效地压缩核酸而不失去活性，特别在体外有效地将核酸转染到不同 细胞系中以及体内转染。并且，本发明的聚合载体分子对细胞没有毒性， 并且提供其核酸货物的有效释放。最后，由于特别在通式(I)的本发明的聚 合载体分子末端可逆添加亲水性聚合物链(例如，PEG-单体)，其表现出 提高的凝聚抗性，所述亲水性聚合物链另外赋予核酸货物对包含血清的介 质的增加的稳定性，并且防止免疫系统识别所述聚合载体货物复合物。

甚至更有利地，本发明通式(I)的聚合载体分子允许很大程度上改变 其肽或聚合物内容物，并且因此非常容易且快速地调控其生物物理/生物 化学特性，特别是组分[S-P²-S]_n的阳离子特性，例如，通过结合相同或不 同的阳离子肽、蛋白或聚合物作为组分P²和任选地在重复组分[S-P²-S]中 添加其他组分，例如，氨基酸组分(AA)_x，从而形成修饰的重复组分，如 {[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}作为本发明聚合物载体的核心基序(其中a+b＝ n，参见下文)。即使由非常小的无毒性单体单位组成，本发明的聚合载体 分子形成具有确定链长度的阳离子结合序列，提供核酸货物的强缩合和复 合物稳定性。在胞质的还原环境(例如，胞质GSH)中，该复合物迅速 降解成其单体，其进一步被降解(例如，寡肽)或分泌(例如，PEG)。 这支持核酸货物在胞质中的释放(deliberation)。由于在胞质中降解成小 的寡肽，如对于高分子寡肽已知的，例如，对高分子寡聚精氨酸，没有观 察到毒性。PEG-“包被”还允许某种程度上在聚合载体末端用亲水性包 衣“包被”聚合载体，其防止盐介导的凝聚和与血清成分的不理想的相互 作用。在胞质中，在细胞的还原条件下，这种“包被”容易去除。此外， 这种作用促进核酸货物在胞质中的释放。

如上文定义，配体(L)可以任选地用在本发明通式(I)的聚合载体分子 中，例如，用于将本发明的载体聚合物及其复合的核酸导向特定细胞中。 它们可以独立于其它选自RGD，转铁蛋白，叶酸，信号肽或信号序列， 定位信号或序列，核定位信号或序列(NLS)，抗体，细胞穿透肽，(例如 TAT)，受体的配体(例如，细胞因子，激素，生长因子等)，小分子(例如， 糖类如甘露糖或半乳糖或合成的配体)，小分子激动剂，受体的抑制剂或 拮抗剂(例如，RGD肽模拟类似物)等。在这种情形中特别优选的是甘露 糖作为配体靶向在其细胞膜上携带甘露糖受体的抗原呈递细胞。在本发明 第一实施方案的进一步优选的方面，半乳糖作为任选的配体可以用来靶向 肝细胞。此类配体可以通过下文定义的可逆二硫键或通过任何其他可能的 化学附着连接至组分P¹和/或P³，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺 酸、胺等)，通过迈克尔加成(Michael addition)(例如马来酰亚胺结构部 分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学(click-chemistry)(例如叠氮化物 或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(methatesis)(例如烯烃类或炔烃类)，亚胺 或腙形成(醛类或酮类，肼(hydrazins)，羟胺类(hydroxylamins)，胺类)， 络合反应(抗生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许S_n-型置换反应的组 分(例如卤代烷，硫醇，醇类，胺类，肼，酰肼，磺酸酯，氧鏻盐 (oxyphosphonium salts))或可以用于连接其它组分的其它化学结构部分。

在本发明的式(I)的情形中，组分P¹和P³表示含有至少一个-SH-结构 部分的直链或支链的亲水性聚合物链，每个P¹和P³彼此独立地选自，例 如，聚乙二醇(PEG)，聚-N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺，聚-2-(甲基丙烯 酰基氧基)乙基磷酸胆碱，聚(羟烷基L-天冬酰胺)或聚(羟烷基L-谷氨酰 胺)。P¹和P³可以彼此不同或相同。优选地，每个亲水性聚合物P¹和P³具有约1kDa至约100kDa的分子量，优选约1kDa至约75kDa，更优 选约5kDa至约50kDa，甚至更优选约5kDa至约25kDa的分子量。另 外，每个亲水性聚合物P¹和P³典型地具有至少一个-SH-结构部分，其中 所述至少一个-SH-结构部分在与组分P²或与组分(AA)_x(如果其用作P¹与P²或P³与P²之间的接头，如下文定义)和任选地与其它组分(例如L 和/或(AA)_x，例如如果包含两个以上-SH-结构部分)缩合时，能够形成二 硫键。上述通式(I)的下述分式“P¹-S-S-P²”和“P²-S-S-P³”(对于更好的可读 性，忽略括号)，其中S，P¹和P³中的任一个如本文定义，典型地表示这 样的情形，其中亲水性聚合物P¹和P³的一个-SH-结构部分与上述通式(I) 的组分P²的一个-SH-结构部分缩合，其中这些-SH-结构部分的两个硫形 成如本文在式(I)中定义的二硫键-S-S-。这些-SH-结构部分典型地由亲水 性聚合物P¹和P³中的每一个提供，例如，通过内部半胱氨酸或任何其它 携带-SH结构部分的(修饰的)的氨基酸或化合物提供。因此，如果-SH- 结构部分是由半胱氨酸提供的，则分式“P¹-S-S-P²”和“P²-S-S-P³”也可以写 作“P¹-Cys-Cys-P²”和“P²-Cys-Cys-P³”，其中术语Cys-Cys表示通过二硫键 而不是通过肽键偶联的两个半胱氨酸。在这种情形中，这些式中的术语 “-S-S-”也可以写作“-S-Cys”，“-Cys-S”或“-Cys-Cys-”。在这种情形中，术 语“-Cys-Cys-”不表示肽键而是表示两个半胱氨酸通过它们的-SH-结构部 分形成二硫键的连接。因此，术语“-Cys-Cys-”也可以一般理解为 “-(Cys-S)-(S-Cys)-”，其中在这种特定情形中，S表示半胱氨酸-SH-结构 部分的硫。同样地，术语“-S-Cys”和“-Cys-S”表示含有-SH的结构部分 和半胱氨酸之间的二硫键，其也可以写作“-S-(S-Cys)”和“-(Cys-S)-S”。 备选地，亲水性聚合物P¹和P³可以用-SH结构部分修饰，优选地通过与 携带-SH结构部分的化合物进行的化学反应进行修饰，以便亲水性聚合 物P¹和P³中的每一个携带至少一个这样的-SH结构部分。这样携带-SH 结构部分的化合物可以是，例如，(另外的)半胱氨酸或任何进一步(修 饰的)携带-SH结构部分的氨基酸。这样的化合物也可以是任何非氨基 化合物或结构部分，其包含或允许将-SH结构部分引入到本文定义的亲 水性聚合物P¹和P³中。这样的非氨基化合物可以通过化学反应或结合化 合物，例如，通过结合3-硫代丙酸或thioimolane，通过酰胺形成(例如， 羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克尔加成(Michael addition)(例如马来酰亚 胺结构部分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学(click-chemistry)(例如 叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(例如烯烃类或炔烃类)，亚胺或腙 形成(醛类或酮类，肼，羟胺类，胺类)，络合反应(抗生物素蛋白，生物素， 蛋白质G)或允许S_n-型置换反应的组分(例如卤代烷，硫醇，醇类，胺类， 肼，酰肼，磺酸酯，氧鏻盐)或可以用于连接其它组分的其它化学结构部 分而连接到本发明式(I)的亲水性聚合物P¹和P³上。在这种情形中的特别 优选的PEG衍生物是α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)。在每种情形中，SH- 结构部分，例如半胱氨酸或任意进一步(修饰的)氨基酸或化合物的SH- 结构部分，可以存在于亲水性聚合物P¹和P³的末端或内部的任何位置。 如本文定义，亲水性聚合物P¹和P³中的每一种典型地具有至少一个-SH- 结构部分(优选地在一个末端)，但是也可以包含两个或者甚至多个-SH- 结构部分，其可以用于另外连接本文定义的其它组分，例如，配体、氨基 酸组分(AA)_x、抗体、细胞穿透肽(例如TAT)等。

按照本发明第一实施方案的进一步优选的方面，亲水性聚合物P¹和 P³中的每一种还可以包含至少一个其它官能结构部分，其允许连接本文 定义的其它组分，例如，配体、氨基酸组分(AA)_x等。所述官能结构部分 可以选自允许其它组分连接的官能度(functionalities)，例如，本文定义 的官能度，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克 尔加成(例如马来酰亚胺结构部分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学 (click-chemistry)(例如叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(例如烯烃类 或炔烃类)，亚胺或腙形成(醛类或酮类，肼，羟胺类，胺类)，络合反应(抗 生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许S_n-型置换反应的组分(例如卤代 烷，硫醇，醇类，胺类，肼，酰肼，磺酸酯，氧鏻盐)或可以用于连接其 它组分的其它化学结构部分。

在本发明式(I)的情形中的组分P²优选表示阳离子或聚阳离子肽或蛋 白，或备选地表示阳离子或聚阳离子聚合物。每个组分P²典型地具有至 少两个-SH-结构部分，当与其它组分P²、组分P¹和/或P³或备选地与其 它组分(例如氨基酸组分(AA)_x)缩合时能够形成二硫键。组分P²典型地 存在于本发明式(I)的重复组分[-S-P²-S-]_n中。术语“阳离子或聚阳离子” 典型地是指带电荷分子，其在约1-9、优选4-9、5-8或甚至6-8的pH值， 更优选在9以下、8以下、或7以下的pH值，最优选在生理pH值，例 如，约7.3-7.4，是带正电荷的(阳离子)。因此，按照本发明作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或作为根据本发明是组分P²的阳离子或聚 阳离子聚合物在生理条件下带正电荷，特别是在体内细胞的生理盐条件下 带正电荷。

在本发明式(I)的组分P²是阳离子或聚阳离子肽或蛋白的特定情形 中，组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b的阳离子特性(如下文定义) 可以按其在整个组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的阳离子氨基 酸的含量来确定。优选地，组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的阳 离子氨基酸的含量为至少10％，20％，或30％，优选至少40％，更优选 至少50％，60％或70％，而且优选至少80％，90％，或甚至95％，96％， 97％，98％，99％或100％，最优选至少30％，40％，50％，60％，70％， 80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％，或可以在约10％至 90％的范围内，更优选在约15％-75％的范围内，甚至更优选在约20％-50％ 的范围内，例如20％，30％，40％或50％，或在由前文提及的任意两个数 值形成的范围内，条件是在整个组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b} 中的所有氨基酸(例如，阳离子、亲脂性、亲水性、芳香族和其它氨基酸) 的含量是100％。

在本发明式(I)的组分P²是阳离子或聚阳离子聚合物的特定情形中， 组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}的阳离子特性可以按其与组分 [S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}的总电荷相比在整个组分[S-P²-S]_n或 {[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的阳离子电荷含量来确定。优选地，在本文定 义的(生理)pH下组分[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的阳离子电 荷含量是至少10％，20％，或30％，优选至少40％，更优选至少50％， 60％或70％，而且优选至少80％，90％，或甚至95％，96％，97％，98％， 99％或100％，最优选至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％， 95％，96％，97％，98％，99％或100％，或可以在约10％-90％的范围内， 更优选在约15％-75％的范围内，甚至优选在约20％-50％的范围内，例 如20％，30％，40％或50％，或在由前文提及的任意两个数值形成的范围 内，条件是在本文定义的(生理)pH下在整个组分[S-P²-S]_n或 {[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的所有电荷(例如，正电荷和负电荷)的含量 是100％。

在由核酸货物和按照本文定义的通式(I)L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L(或 按照其在本文中的任一种分式)的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体 货物复合物的特定情形中，特别优选的是整个重复组分[S-P²-S]_n或 {[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}中的所有电荷中至少有10％是阳离子，从而允许 带负电荷的核酸货物的复合。

作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白，或作为组分P²的阳离子 或聚阳离子聚合物，优选地是直链分子，然而，还可以使用支化的阳离子 或聚阳离子肽或蛋白作为组分P²或支化的阳离子或聚阳离子聚合物作为 组分P²。

典型地，组分P²，例如本文定义的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或阳 离子或聚阳离子聚合物，连接到其相邻组分，例如组分P¹和P³，和/或作 为重复组分[S-P²-S]_n的一部分通过二硫键(-S-S-)连接至其它组分P²，或连 接至作为{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}的一部分的(AA)_x组分。在这种情形中， 在重复组分[S-P²-S]_n中邻近组分P²的硫和通式(I)L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L 中定义的硫是提供二硫键所必需的，可以由组分P²自身通过本文定义的 -SH结构部分而提供，或可以通过修饰组分P²因此在上述重复组分 [S-P²-S]_n的定义中具有-SH结构部分而提供。组分P²的-SH结构部分优 选如本文关于组分P¹和P³所定义。如果按照上述意思形成二硫键(-S-S-) 所必需的此类-SH-结构部分由组分P²自身提供，这可以这样存在，例如， 通过已经存在于组分P²的氨基酸序列的任意位置在组分P²的氨基酸序列 内的携带-SH结构部分的至少两个半胱氨酸或任何进一步(修饰的)氨 基酸或化学化合物而存在。备选地，组分P²可以相应地用携带(游离)-SH 结构部分的化学化合物修饰，例如，半胱氨酸或任意进一步(修饰的)氨 基酸或化学化合物进行修饰。由此，组分P²优选地携带至少两个-SH-结 构部分，其硫原子能够在与本文定义的组分P¹或P³的-SH-结构部分缩合 时形成二硫键或在第一组分P²和另一组分P²之间形成二硫键，等。此类 -SH-结构部分优选如本文定义。优选地，所述至少两个SH-结构部分位于 组分P²的末端或在其末端附近。

按照本发明第一实施方案的一个特定的方面，在上述通式(I)的重复 组分[S-P²-S]_n内的组分P²可以包含半胱氨酸作为-SH结构部分。在这一 情形中，重复组分[S-P²-S]_n因此可以写作：

[Cys-P²-Cys]_n

其中n和P²如本文定义，并且每个Cys提供-SH-结构部分用于二硫键。 Cys是其三字母密码表示的氨基酸半胱氨酸。(为了举例说明的目的，在 本说明书中，二硫键-S-S-通常还可以写作-(Cys-S)-(S-Cys)-，其中Cys-S 表示具有天然存在的-SH结构部分的半胱氨酸，其中该-SH结构部分与 第二半胱氨酸的-SH结构部分形成二硫键。因此，重复组分[Cys-P²-Cys]_n还可以写作[(S-Cys)-P²-(Cys-S)]_n，其表示由半胱氨酸提供的-SH-结构部分 和半胱氨酸自身提供二硫键的硫。)

在上述完整式(I)的情形中，第一实施方案的这一特定方面因此可以 定义如下：

L-P¹-S-[Cys-P²-Cys]_n-S-P³-L

其中L，P¹，P²，P³和n如本文定义，S是硫，并且每个Cys提供一个-SH- 结构部分用于二硫键。

在每种情形中，SH-结构部分，例如用于修饰组分P²的半胱氨酸或任 意进一步(修饰的)氨基酸或其它化合物的SH-结构部分，可以存在于作 为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白或阳离子或聚阳离子聚合物，存 在于内部或在其一个或两个末端，例如，如果用阳离子或聚阳离子肽或蛋 白作为组分P²，可以存在于作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白的 N端或C端、这两个末端、和或在内部的任意位置。优选地，-SH结构 部分可以存在于组分P²的至少一个末端，更优选地存在于两个末端，例 如，存在于作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白的N端和/或C端、 更优选地在N端和C端两端。

由于其重复特征，组分[S-P²-S]_n可以表示一种情形，其中组分P²的 至少两个-SH-结构部分中的一个与上述通式(I)的另一个组分P²的-SH-结 构部分缩合，其中这些-SH-结构部分的两个硫在第一组分P²和至少一个 其它组分P²之间形成二硫键(-S-S-)。

在这种情形中，本发明式(I)中组分P²的重复数定义为整数n。是整 数，典型地选自约1-50的范围，优选选自约1，2或3至30的范围，更 优选选自约1，2，3，4，或5至25的范围，或约1，2，3，4，或5至 20的范围，或约1，2，3，4，或5至15的范围，或约1，2，3，4，或5 至10的范围，包括例如，约3至20，4至20，5至20，或10至20的范 围，或约3至15，4至15，5至15，或10至15的范围，或约6至11或 7至10的范围。例如，如果在重复组分[S-P²-S]_n中，整数n是5，则重复 组分[S-P²-S]_n优选如下：

[S-P²-S-S-P²-S-S-P²-S-S-P²-S-S-P²-S]

在上述实例中，组分P²出现5次(优选以线性顺序)，其中每个组分 P²通过符合上述重复组分[S-P²-S]_n定义的二硫键与其邻近组分连接。任意 组分P²可以彼此相同或不同。

按照这一实施方案的一个特定方面，组分P²表示长度为约3至约100 个氨基酸、更优选长度约3至约50个氨基酸、甚至更优选长度约3至约 25个氨基酸、例如，长度约3-10、5-15、10-20或15-25个氨基酸、更优 选长度为约5至约20个和甚至更优选长度约10至约20个氨基酸的阳离 子或聚阳离子肽或蛋白。

作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以是适于这一目的并且 具有至少两个-SH-结构部分的任何蛋白或肽，特别是按照本发明定义能 够复合核酸并且由此优选地缩合所述核酸的任意阳离子或聚阳离子肽或 蛋白。

作为组分P²的具有至少两个-SH-结构部分的特别优选的阳离子或 聚阳离子肽或蛋白可以选自鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L- 赖氨酸(PLL)，碱性多肽，聚精氨酸，细胞穿透肽(CPPs)，嵌合CPPs，如 Transportan，或MPG肽，HIV-结合肽，Tat，HIV-1 Tat(HIV)，Tat-衍生 肽，寡聚精氨酸，穿透肽家族成员，例如穿透肽(Penetratin)，触角足- 衍生肽(Antennapedia-derived peptides)(特别是来自Drosophila  antennapedia)，pAntp，pIsl等，抗微生物-衍生的CPPs，例如Buforin-2， Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT-衍生肽，SAP，MAP，KALA， PpTG20，富含脯氨酸的肽，Loligomere，富含精氨酸的肽，降钙素-肽， FGF，乳铁蛋白，组蛋白，VP22衍生的或类似物肽，HSV，VP22(单纯 疱疹(Herpes simplex))，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620， 富含脯氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，Pep-1，L-寡聚物，降钙素肽等。

按照本发明第一实施方案的一个特别优选的方面，作为组分P²的阳 离子或聚阳离子肽或蛋白选自具有下述总合式(II)的下述阳离子肽，优选 满足它们另外具有至少两个-SH-结构部分的条件：

{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x}；(式(II))

其中l+m+n+o+x＝8-15，且l，m，n或o彼此独立地可以是选自0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15的任意数，条 件是Arg，Lys，His和Orn的总含量占寡肽所有氨基酸的至少10％；且 Xaa可以是选自除Arg、Lys、His或Orn之外的天然(＝天然存在的)或非 天然氨基酸的任意氨基酸；且x可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8， 9，10，11，12，13或14的任意数，条件是Xaa的总含量不超过寡肽所 有氨基酸的90％。氨基酸Arg、Lys、His、Orn和Xaa的任一个可以位于 肽的任意位置。该式的特别优选的肽是寡聚精氨酸，如例如，Arg₇，Arg₈， Arg₉，Arg₇，H₃R₉，R₉H₃，H₃R₉H₃，YSSR₉SSY，(RKH)₄，Y(RKH)₂R等(SEQ  ID NOs：1-9)。

按照第一实施方案的特别优选的方面，作为组分P²的具有上文所示 的实验式(II)且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或 蛋白可以，但不限于，选自以下亚组的式：

Arg₈，Arg₉，Arg₁₀，Arg₁₁，Arg₁₂，Arg₁₃，Arg₁₄，Arg₁₅；(SEQ ID NOs：2-3，10-15)；

Lys₈，Lys₉，Lys₁₀，Lys₁₁，Lys₁₂，Lys₁₃，Lys₁₄，Lys₁₅；(SEQ ID NOs：16-23)；

His₈，His₉，His₁₀，His₁₁，His₁₂，His₁₃，His₁₄，His₁₅；(SEQ ID NOs：24-31)；

Orn₈，Orn₉，Orn₁₀，Orn₁₁，Orn₁₂，Orn₁₃，Orn₁₄，Orn₁₅；(SEQ ID NOs：32-39)；

按照第一实施方案的特别优选的方面，作为组分P²的具有上文所示 的实验式(II)且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或 蛋白可以，但不限于，选自以下亚组的式，其中下式(如同实验式(II)) 不指定任何氨基酸顺序，但是意欲通过专门指定作为各个肽的组分的氨基 酸(的顺序)来反映实验式。因此，例如，实验式Arg_(7-14)Lys₁意欲意指 落入该式的肽包含顺序不限的7-14个Arg残基和1个Lys残基。如果该 肽包含7个Arg残基和1个Lys残基，包括所有具有7个Arg残基和1 个Lys残基的变体。因此，Lys残基可以位于例如由7个Arg和1个Lys 残基组成的8氨基酸长序列中的任意位置。该亚组优选地包括：

按照第一实施方案的另一个特别优选的方面，作为组分P²的具有上 文所示的实验式(II)且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离 子肽或蛋白可以，但不限于，选自下式：Arg₈，Arg₉，Arg₁₀，Arg₁₁，Arg₁₂， Arg₁₃，Arg₁₄，Arg₁₅；Lys₈，Lys₉，Lys₁₀，Lys₁₁，Lys₁₂，Lys₁₃，Lys₁₄，Lys₁₅； His₈，His₉，His₁₀，His₁₁，His₁₂，His₁₃，His₁₄，His₁₅；Orn₈，Orn₉，Orn₁₀， Orn₁₁，Orn₁₂，Orn₁₃，Orn₁₄，Orn₁₅；(SEQ ID NOs：2-3，10-39，参见上文)。

按照第一实施方案的进一步特别优选的方面，作为组分P²的具有上 文所示的实验式(II)且另外具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离 子肽或蛋白可以，但不限于，选自由下述通式组成的亚组：Arg₉(还称为 R₉)，Arg₉His₃(还称为R₉H₃)，His₃Arg₉His₃(还称为H₃R₉H₃)， TyrSerSerArg₉SerSerTyr(还称为YS SR₉SSY)，His₃Arg₉SerSerTyr(还称为 H₃R₉SSY)，(ArgLysHis)₄(还称为(RKH)₄)，Tyr(ArgLysHis)₂Arg(还称为 Y(RKH)₂R)；(SEQ ID NOs：2，5-9，40，见上文)。甚至更优选地，这些通 式定义如下：

按照第一实施方案的一个进一步特别优选的方面，作为组分P²的按 照上文所示的式{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x}(式(II))定义且另外具 有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以，但不限于， 选自式(IIa)，优选地满足至少一个-SH-结构部分由半胱氨酸残基提供的条 件：

{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Cys)_x}(式(IIa))

其中(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；且x如本文定义，

备选地，作为组分P²的按照上文所示的式 {(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x}(式(II))定义且另外具有至少两个-SH- 结构部分的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以，但不限于，选自式(IIa’)， 优选地满足至少一个-SH-结构部分由半胱氨酸残基提供的条件：

{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa’)_x；(Cys)_y}(式(IIa’))

其中(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；且x如本文定义，Xaa’是选自除Arg、Lys、 His、Orn或Cys之外的天然(＝天然存在的)或非天然氨基酸的任意氨基 酸，且y是选自1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19，20，21-30，31-40，41-50，51-60，61-70，71-80和81-90 的任意数，条件是Arg(精氨酸)，Lys(赖氨酸)，His(组氨酸)和Orn(鸟氨 酸)的总含量占寡肽所有氨基酸的至少10％。

本发明的第一实施方案的这些方面可以用于这样的情形，其中组分 P²选自上文所示的实验式(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x(式(II))的阳离 子或聚阳离子肽或蛋白，其包含或已经用至少一个半胱氨酸修饰作为符合 上述意思的-SH结构部分，以使作为组分P²的阳离子或聚阳离子肽携带 至少一个半胱氨酸，其能够与式(I)的其它组分形成二硫键。

按照第一实施方案的另一个特别优选的方面，作为组分P²的按照上 文所示的式{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x}(式(II))定义且优选地另外 具有至少两个-SH-结构部分的阳离子或聚阳离子肽或蛋白可以，但不限 于，选自式(IIb)，优选地满足至少两个-SH-结构部分由两个末端半胱氨酸 残基提供的条件：

Cys{(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x}Cys(式(IIb))

其中(Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x如本文定义并且形成按照(半经验) 式(II)的氨基酸的核心。示例性的实例可以包含侧连两个Cys的任意上述 序列和下述序列：

更优选地下述示例性的序列(SEQ ID NOs：73-84)：

本发明的第一实施方案的这一方面可以应用于这样的情形，即，其 中作为组分P²的聚阳离子肽或蛋白，例如，当如上文所示的实验式 (Arg)_l；(Lys)_m；(His)_n；(Orn)_o；(Xaa)_x(式(II))所定义时，己经用至少两个(末端) 半胱氨酸修饰作为符合上述意思的-SH结构部分，以使组分P²携带至少 两个(末端)半胱氨酸，其能够与式(I)的其它组分形成二硫键。

按照第一实施方案的另一个方面，组分P²表示阳离子或聚阳离子聚 合物，其选自，例如，适合于本情形的任何阳离子聚合物，条件是该阳离 子聚合物具有至少两个-SH-结构部分，其提供连接组分P²与组分P¹或P³、 或与其它组分P²或氨基酸组分(AA)_x的二硫键。因此，同样如本文定义， 组分P²可以作为本文定义的由分式[S-P²-S]_n或{[S-P²-S]_a/[S-(AA)_x-S]_b}所 示的重复组分存在，其中在所述重复组分中可以使用相同的或不同的阳离 子或聚阳离子聚合物P²。

优选地，组分P²表示阳离子或聚阳离子聚合物，其典型地具有约0.5 kDa至约100kDa的分子量，约1kDa至约75kDa，约5kDa至约50kDa， 约5kDa至约30kDa的分子量，或约10kDa至约50kDa的分子量，或 约10kDa至约30kDa，优选约0.5kDa至约30kDa，更优选约1kDa至 约20kDa的分子量，并且甚至更优选约1.5kDa至约10kDa的分子量。 另外地，作为组分P²的阳离子或聚阳离子聚合物典型地具有至少两个-SH 结构部分，其能够在与本文定义的组分P¹或P³或与其它组分P²或氨基酸 组分(AA)_x缩合时形成二硫键。

当组分P²表示阳离子或聚阳离子聚合物时，这样的聚合物可以选自 丙烯酸酯，改性的丙烯酸酯，如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙 烯酸酯))，壳聚糖，氮丙啶或2-乙基-2-唑啉(形成低聚亚乙基亚胺或改 性的低聚亚乙基亚胺)，通过二丙烯酸酯与胺类反应形成低聚β氨基酯或 聚酰胺型胺类而获得的聚合物，或其它聚合物，如聚酯、聚碳酸酯等。这 些阳离子或聚阳离子聚合物的每个分子典型地具有至少两个-SH-结构部 分，其中这些至少两个-SH-结构部分可以通过化学修饰引入到阳离子或 聚阳离子聚合物中，例如，使用imonothiolan，3-硫代丙酸进行化学修饰 或引入含有-SH-结构部分的氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸或任何进一 步(修饰的)氨基酸。所述-SH-结构部分优选地如上文已经关于组分P¹、 P²或P³所定义的。

本发明式(I)的组分P²优选作为重复组分[-S-P²-S-]_n存在。所述重复组 分[S-P²-S]_n可以使用至少一个或甚至多个相同或不同的上文定义的组分 P²并且在聚合缩合反应中通过它们的-SH-结构部分将其聚合而制备。

按照第一实施方案的一个特定的方面，所述重复组分[S-P²-S]_n可以使 用至少一个或甚至多个相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子肽或 蛋白并且在聚合缩合反应中通过它们的-SH-结构部分将其聚合而制备。 因此，所述重复组分[S-P²-S]_n包含由整数n确定的至少一个或甚至多个相 同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子蛋白或肽中的多个。

按照第一实施方案的另一个特定方面，所述重复组分[S-P²-S]_n可以使 用至少一种或甚至多种相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子聚合 物并且在聚合缩合反应中通过它们的-SH-结构部分将其聚合而制备。因 此，所述重复组分[S-P²-S]_n包含由整数n确定的至少一个或甚至多个相同 或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子聚合物中的多个。

按照第一实施方案的另一个特定方面，所述重复组分[S-P²-S]_n可以使 用至少一种或甚至多种相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子聚合 物和至少一种或甚至多种相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子肽 或蛋白并且在聚合缩合反应中通过它们的-SH-结构部分将其聚合而制 备。因此，所述重复组分[S-P²-S]_n包含均由整数n确定的至少一个或甚至 多个相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子聚合物和至少一个或甚 至多个相同或不同的上文定义的阳离子或聚阳离子肽或蛋白中的多个。

按照第一实施方案的另一个方面，本发明上述式(I)的聚合载体可以 包含至少一个氨基酸组分(AA)_x，其中AA优选是如下文定义的氨基酸， 当作为氨基酸组分(AA)_x存在时，其允许(基本上)修饰本文定义的式(I) 的本发明聚合载体的生物物理/生物化学特性。按照本发明，在所述氨基 酸组分(AA)_x(重复)中的氨基酸数目由x限定。在上述情形中，x优选 是整数，并且可以选自约1至100的范围，优选选自约1-50的范围，更 优选1-30，甚至更优选选自包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14或15-30的数字，例如，选自约1-30的范围，选自约1-15的 范围，或选自包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或15的数字，或可以选自由前述数值中的任意两个形成的范围。

所述组分(AA)_x可以包含在上述式(I)的本发明聚合载体的各个部分 中，并且因此可以连接到本发明式(I)的聚合载体的所有组分上。特别优选 的是，(AA)_x作为配体或重复组分[S-P²-S]_n的一部分而存在。

在这种情形中，特别优选的是，所述氨基酸组分(AA)_x包含或侧连(例 如，末端侧连)至少一个含有-SH的结构部分，其允许通过二硫键将该 组分(AA)_x引入到如本文定义的式(I)的聚合载体中。在这种情形中，所述 氨基酸组分(AA)_x还可以作为组分-S-(AA)_x-或-S-(AA)_x-S-，其中S表示含 有-SH的结构部分(当然，或是二硫键的一个硫)，例如，半胱氨酸残基。 在含有-SH的结构部分是半胱氨酸的特定情形中，所述氨基酸组分(AA)_x还可以作为-Cys-(AA)_x-或-Cys-(AA)_x-Cys-，其中Cys表示半胱氨酸并且 提供二硫键必需的-SH-结构部分。(因此，-Cys-(AA)_x-Cys-还可以写作 -(S-Cys)-(AA)_x-(Cys-S)-，-Cys-(AA)_x-还可以写作-(S-Cys)-(AA)_x-)。所述 含有-SH的结构部分还可以使用如上文关于组分P¹、P²或P³所示的任何 修饰或反应引入到氨基酸组分(AA)_x中。在将氨基酸组分(AA)_x连接到本 发明式(I)的聚合载体的两个组分上的特定情形中，优选的是(AA)_x含有至 少两个-SH-结构部分，例如，至少两个半胱氨酸，优选位于其末端。如 果(AA)_x是重复组分[S-P²-S]_n的一部分的话，这是特别优选的。

在备选方案中，通过任何可能的化学加成反应将所述氨基酸组分 (AA)_x引入到本发明式(I)的聚合载体中。因此，所述氨基酸组分(AA)_x包 含至少一个另外的官能结构部分，其允许将其连接到本文定义的其它组分 上，例如，连接到组分P¹或P³，P²，L，或其它氨基酸组分(AA)_x等上。 所述官能结构部分可以选自允许其它组分连接的官能性，例如，本文定义 的官能性，例如，通过酰胺形成(例如，羧酸、磺酸、胺等)，通过迈克 尔加成(例如马来酰亚胺结构部分，α，β不饱和羰基等)，通过click化学 (click-chemistry)(例如叠氮化物或炔烃)，通过烯烃/炔烃歧化(例如烯烃类 或炔烃类)，亚胺或腙形成(醛类或酮类，肼，羟胺类，胺类)，络合反应(抗 生物素蛋白，生物素，蛋白质G)或允许S_n-型置换反应的组分(例如卤代 烷，硫醇，醇类，胺类，肼，酰肼，磺酸酯，氧鏻盐)或可以用于连接其 它组分的其它化学结构部分而连接。

氨基酸组分(AA)_x还可以作为混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z而存 在，其中氨基酸组分(AA)_x的数目由z进一步限定。在该情形中，z是整 数，并且可以选自约1-30的范围，优选选自约1-15的范围，更优选1-10 或1-5，甚至更优选地选自这样的数字，所述数字选自1，2，3，4，5，6， 7，8，9，10，11，12，13，14或15，或可以选自由前述数值中的任意两 个形成的范围。所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以用来将数个相同 的或不同的本文定义的氨基酸组分(AA)_x整合在本发明的聚合载体中。优 选地，在所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z中，所述氨基酸组分(AA)_x 可以包含或可以侧连(例如，末端侧连)至少一个含有-SH的结构部分， 优选至少两个如上文已定义的含有-SH的结构部分，其允许通过缩合聚 合用二硫键偶联不同的氨基酸组分(AA)_x。同样如上述，所述混合的重复 氨基酸组分[(AA)_x]_z还可以作为[S-(AA)_x-S]_z，其中S表示含有-SH的结构 部分，例如半胱氨酸残基。在所述含有-SH的结构部分是半胱氨酸的特 定情形中，所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z还可以作为 [Cys-(AA)_x-Cys]_z，其中Cys表示半胱氨酸并且提供二硫键必需的-SH-结 构部分。所述含有-SH的结构部分还可以使用如上文关于组分P¹、P²或 P³所示的任何修饰或反应引入到氨基酸组分(AA)_x中。

所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以提供有 至少一个-SH-结构部分，例如以式(AA)_x-SH表示的形式。然后，式 (AA)_x-SH的组分(AA)_x或式[(AA)_x]_z-SH的混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以通过二硫键结合到组分L、P¹、P²和/或P³中的任一个或另一个组分 (AA)_x上。如果结合到组分P¹和/或组分P³上，组分P¹和/或P³优选地具 有至少两个-SH-结构部分，从而允许组分P¹和/或P³通过形成二硫键的 -SH-结构部分(见上文)进一步结合到组分P²上。采用式(AA)_x-SH所示的 形式的氨基酸组分(AA)_x或式[(AA)_x]_z-SH的混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z也可以用来终止缩合反应，原因在于其单个的-SH结构部分。在 这种情形中，采用式(AA)_x-SH所示的形式的氨基酸组分(AA)_x优选在末端 偶联到组分P¹和/或P³上。采用式(AA)_x-SH所示的形式的氨基酸组分 (AA)_x或式[(AA)_x]_z-SH的混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z还可以用来通过 组分L、P¹、P²和/或P³或(AA)_x中的任一个的另一个内部-SH-结构部分 在内部结合到组分L、P¹、P²和/或P³中的任一个或另一个组分(AA)_x上。

此外，所述氨基酸组分(AA)_x可以提供有两个-SH-结构部分(或甚至 多个)，例如，以式HS-(AA)_x-SH所示的形式。另外，所述混合的重复氨 基酸组分[(AA)_x]_z可以提供有两个-SH-结构部分(或甚至多个)，例如， 以式HS-[(AA)_x]_z-SH所示的形式，以允许通过二硫键结合两个官能性， 例如，如果所述氨基酸组分(AA)_x或所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z用作两个其它组分之间的接头(例如，作为组分L与P¹之间、组分P¹与 P²之间、在重复组分[S-P²-S]_n中或作为其一部分、组分P²与P³之间和/ 或组分P³与L之间的接头)。在这种情形中，一个-SH结构部分优选地在 第一步使用本领域已知的保护基进行保护，形成式HS-(AA)_x-S-保护基的 氨基酸组分(AA)_x或式HS-[(AA)_x]_z-S-保护基的混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z。然后，所述氨基酸组分(AA)_x或所述混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z可以结合到组分L、P¹、P²和/或P³上，从而通过未保护的-SH结 构部分形成第一个二硫键。然后，典型地将所保护的-SH-结构部分去保 护，并且结合到其它组分L、P¹、P²和/或P³的另一个游离的-SH-结构部 分上，从而形成第二个二硫键。在所述氨基酸组分(AA)_x或所述混合的重 复氨基酸组分[(AA)_x]_z是重复组分[S-P²-S]_n的一部分的情形中，优选的是， (AA)_x与P²之间的二硫键形成与重复组分[S-P²-S]_n的缩聚反应同时发生， 并且因此对至少两个末端-SH-结构部分没有保护不是必需的。

备选地，所述氨基酸组分(AA)_x或所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以提供有如上文已经关于组分P¹和P²和/或P³所述的其它官能性，其 允许所述氨基酸组分(AA)_x与组分P¹、P²和/或P³或(AA)_x的任一种并且任 选地与组分L的结合或所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z与组分P¹、P²和/或P³或(AA)_x的任一种并且任选地与组分L的结合。

因此，按照本发明，所述氨基酸组分(AA)_x和/或所述混合的重复氨基 酸组分[(AA)_x]_z可以利用或不利用二硫键连接结合到P¹，P²，P³，(AA)_x和/或L上。不利用二硫键连接的结合可以通过任意上述反应实现，优选 地通过利用本文定义的酰胺-化学(amid-chemistry)将所述氨基酸组分 (AA)_x或所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z与P¹，P²，P³，(AA)_x和/或L 结合。如果需要或必需，氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z的另一个末端，例如，N或C端，可以用于偶联另一个组分，如 配体L。为了这一目的，氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z的另一个末端优选地包含或通过修饰而包含其它官能性，例如， 炔烃-种类(见上文)，其可以用来通过例如click化学(click-chemistry) 加合另一组分。这样的构建体，例如L-(AA)_x-P¹-S-或L-[(AA)_x]_z-P¹-S-， 可以用来终止重复组分[S-P²-S]_n的聚合缩合反应。如果配体是通过酸敏感 性键结合的，则该键可以在内体中被分裂，并且本发明的聚合载体在其表 面上呈递氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z。

所述氨基酸组分(AA)_x或所述混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以作 为上述通式(I)的另一种组分存在，例如作为组分P¹或P³与P²之间的接头， 作为组分L与P¹或P²之间的接头或作为重复组分[S-P²-S]_n的另外的组分。

按照第一备选方案，所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z可以作为组分P¹或P³与组分P²之间的接头存在。这优选地表示 在下式的式(I)完整的本发明的聚合载体的情形中：

L-P¹-S-S-(AA)_x-S-[S-P²-S]_n-S-(AA)_x-S-S-P³-L，或

L-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_z-[S-P²-S]_n-[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-L，

其中n，x，z，S，L，AA，P¹，P²和P³优选地如本文定义。在上式中， 术语“-S-S-”表示二硫键，其中二硫键的该至少一个硫也可以由半胱氨酸提 供。在这种情形中，这些式中的术语“-S-S-”也可以写作“-S-Cys”，“-Cys-S” 或“-Cys-Cys-”。在这种情形中，术语“-Cys-Cys-”不表示肽键而是两个半胱 氨酸通过它们的-SH-结构部分形成二硫键的连接。因此，术语“-Cys-Cys-” 也可以一般理解为“-(Cys-S)-(S-Cys)-”，其中在这一特定情形中，S表示 半胱氨酸的-SH-结构部分的硫。同样地，术语“-S-Cys”和“-Cys-S”表示含 有-SH的结构部分和半胱氨酸之间的二硫键，其也可以写作“-S-(S-Cys)” 和“-(Cys-S)-S”。

按照第二备选方案，所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z可以作为组分P¹或P³与组分L之间的接头存在。这优选地表示 在下式的式(I)完整的本发明的聚合载体的情形中：

L-(AA)_x-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-(AA)_x-L，或

L-[(AA)_x]_z-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-[(AA)_x]_z-L，

或备选地

L-(AA)_x-S-S-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-S-S-(AA)_x-S-S-L，或

L-S-S-(AA)_x-S-S-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-S-S-(AA)_x-S-S-L，或

L-S-[S-(AA)_x-S]_z-S-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-S-[S-(AA)_x-S]_z-S-L等，

其中n，x，z，S，L，AA，P¹，P²和P³优选地如本文定义。在上式中， 术语“-S-S-”表示如上文已经定义的二硫键。

按照第三备选方案，所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分 [(AA)_x]_z可以作为组分P¹和/或P³的一部分存在，其中氨基酸组分(AA)_x可以无需其它配体L直接结合到组分P¹和/或P³(例如，组分P¹和/或P³的末端)上。在这种情形中，(AA)_x组分可以采用上述定义的配体的形式。 这优选地表示在下式的式(I)完整的本发明的聚合载体的情形中：

(AA)_x-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-(AA)_x，或

[(AA)_x]_z-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-[(AA)_x]_z，或

或备选地

(AA)_x-S-S-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-S-S-(AA)_x，或

H-[S-(AA)_x-S]_z-S-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-S-P³-S-[S-(AA)_x-S]_z-H，

其中n，x，z，S，AA，P¹，P²和P³优选地如本文定义。在上式中，术语 “-S-S-”表示如上文已经定义的二硫键。在最后的式中末端的游离-SH结 构部分还可以用本文定义的单硫醇化合物封端。

按照第四且特别优选的备选方案，氨基酸组分(AA)_x，优选地写作 S-(AA)_x-S或[S-(AA)_x-S]，可以用来修饰组分P²，特别是上式(I)的重复组 分[S-P²-S]_n中组分S-P²-S的含量。这可以表示在例如下式(Ia)的式(I)完整 的聚合载体的情形中：

L-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-L，

其中x，S，L，AA，P¹，P²和P³优选地如本文定义。在上式(Ia)中，单 个组分[S-P²-S]和[S-(AA)_x-S]中的任一个可以以任意顺序存在于分式 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中。单个组分[S-P²-S]和[S-(AA)_x-S]在分式 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中的数目由整数a和b确定，其中a+b＝n。n是 整数并且如上文关于式(I)定义。

a是整数，典型地独立于整数b选自约1至50的范围，优选选自约1， 2或3至30的范围，更优选选自约1，2，3，4，或5至25的范围，或约 1，2，3，4，或5至20的范围，或约1，2，3，4，或5至15的范围， 或约1，2，3，4，或5至10的范围，包括，例如，约3至20，4至20， 5至20，或10至20的范围，或约3至15，4至15，5至15，或10至15 的范围，或约6至11或7至10的范围。最优选地，a是在约1，2，3，4， 或5至10的范围内，更优选在约1，2，3，或4至9的范围内，在约1， 2，3，或4至8的范围内，或在约1，2，或3至7的范围内。

b是整数，典型地独立于整数a选自约0至50或约1至50的范围， 优选选自约0，1，2或3至30的范围，更优选选自约0，1，2，3，4， 或5至25的范围，或约0，1，2，3，4，或5至20的范围，或约0，1， 2，3，4，或5至15的范围，或约0，1，2，3，4，或5至10的范围， 包括，例如，约3至20，4至20，5至20，或10至20的范围，或约3 至15，4至15，5至15，或10至15的范围，或约6至11或7至10的 范围。最优选地，b是在约1，2，3，4，或5至10的范围内，更优选在 约1，2，3，或4至9的范围内，在约1，2，3，或4至8的范围内，或 在约1，2，或3至7的范围内。

在上式中，术语“-S-S-”(为更好的可读性，忽略括号)表示如上文已经 定义的二硫键。

在式(I)的完整聚合载体的任一前述备选方案的情形中，还可以实现组 分P²的修饰，特别是重复组分[S-P²-S]_n的组分S-P²-S的修饰，通过用氨 基酸组分(AA)_x稀释其而进行，

L-P¹-S-S-(AA)_x-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-(AA)_x-S-S-P³-L，或

L-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_z-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-L，或

L-(AA)_x-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-(AA)_x-L，或

L-[(AA)_x]_z-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-[(AA)_x]_z-L，或

L-(AA)_x-S-S-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-S-S-(AA)_x-S-S-L，或

L-S-S-(AA)_x-S-S-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-S-S-(AA)_x-S-S-L，或

L-S-[S-(AA)_x-S]_z-S-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-S-[S-(AA)_x-S]_z-S-L， 或

(AA)_x-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-(AA)_x，或

[(AA)_x]_z-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-[(AA)_x]_z，或

(AA)_x-S-S-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-S-S-(AA)_x，或

H-[S-(AA)_x-S]_z-S-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-S-[S-(AA)_x-S]_z-H，

其中n，x，z，a，b，S，L，AA，P¹，P²和P³优选地如本文定义。同样 地，术语“-S-S-”表示二硫键并且优选地如本文定义。

在上述备选方案中，其中组分[S-P²-S]优选地用氨基酸组分[S-(AA)_x-S] “稀释”，比率由整数a和b确定，其中a+b＝n。优选地，选择整数a 和b以不失去组分[S-P²-S]的阳离子结合特性，而是最小程度保留在亚式/ 组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中。这允许将本发明式(I)的聚合载体的重复组 分[S-P²-S]_n中的组分[S-P²-S]的阳离子结合强度弱化(“稀释”)至理想的 程度。

在这一特定的情形中，亚式/组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}的(理想的) 阳离子结合强度可以用不同方法确定。

按照第一备选方案，本发明式(I)的组分P²特别优选是本文定义的阳 离子或聚阳离子肽。此外，氨基酸组分(AA)_x，优选地写作[S-(AA)_x-S]， 典型地类似于肽序列。在这一特定的情形中，亚式/组分 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}的阳离子特性可以由其在完整亚式/组分中的阳离 子氨基酸含量确定。优选地，亚式/组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中的阳离 子氨基酸的含量为至少10％，20％，或30％，优选至少40％，更优选至 少50％，60％或70％，而且还优选至少80％，90％，或甚至95％，96％， 97％，98％，99％或100％，最优选至少30％，40％，50％，60％，70％， 80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％，或可以在约10％至 90％的范围内，更优选在约15％至75％的范围内，甚至优选在约20％至 50％的范围内，例如20％，30％，40％或50％，或在由前述数值中的任意 两个形成的范围内，条件是，完整亚式/组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中所 有氨基酸(例如，阳离子、亲脂性、亲水性、芳香和其它氨基酸)的含量 是100％。

按照第二备选方案，本发明式(I)的组分P²特别优选是本文定义的阳 离子或聚阳离子聚合物。氨基酸组分(AA)_x，优选地写作[S-(AA)_x-S]，典 型地类似于肽序列。在这一特定的情形中，亚式/组分 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}的阳离子特性可以由其在完整亚式/组分中的阳离 子电荷含量确定。优选地，在本文定义的(生理)pH下，亚式/组分 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中的阳离子电荷含量是至少10％，20％，或30％， 优选至少40％，更优选至少50％，60％或70％，而且优选至少80％，90％， 或甚至95％，96％，97％，98％，99％或100％，最优选至少30％，40％， 50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％， 或可以在约10％至90％的范围内，更优选在约15％至75％的范围内，甚 至优选在约20％至50％的范围内，例如20％，30％，40％或50％，或在由 前述数值中的任意两个形成的范围内，条件是，在本文定义的(生理)pH 下完整亚式/组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}中所有电荷(例如正电荷和负电 荷)的含量是100％。

在本发明的情形中，氨基酸组分(AA)_x可以选自下述备选方案。

按照第一备选方案，氨基酸组分(AA)_x可以是芳香氨基酸组分(AA)_x。 与聚合载体分子的阳离子电荷序列与磷酸骨架的结合相反，在本发明式(I) 的创新性聚合载体中结合芳香氨基酸或序列作为芳香氨基酸组分(AA)_x允许本发明的聚合载体与核酸的不同(第二)结合，原因在于芳香氨基酸 与核酸货物的碱基的相互作用。例如，这种相互作用可以通过插入或通过 次要的或主要的沟槽结合而发生。这种类型的相互作用不倾向于被阴离子 复合配偶体(例如，肝素、透明质酸)解压缩(decompaction)，所述阴 离子复合配偶体在体内主要存在于胞外基质中，并且对盐作用的敏感性也 较差。

对于这一目的，芳香氨基酸组分(AA)_x中的氨基酸AA可以选自相同 的或不同的芳香氨基酸，例如，选自Trp，Tyr，或Phe。备选地，氨基酸 AA(或完整的芳香氨基酸组分(AA)_x)可以选自下述肽组合：Trp-Tyr， Tyr-Trp，Trp-Trp，Tyr-Tyr，Trp-Tyr-Trp，Tyr-Trp-Tyr，Trp-Trp-Trp， Tyr-Tyr-Tyr，Trp-Tyr-Trp-Tyr，Tyr-Trp-Tyr-Trp，Trp-Trp-Trp-Trp，Phe-Tyr， Tyr-Phe，Phe-Phe，Phe-Tyr-Phe，Tyr-Phe-Tyr，Phe-Phe-Phe，Phe-Tyr-Phe-Tyr， Tyr-Phe-Tyr-Phe，Phe-Phe-Phe-Phe，Phe-Trp，Trp-Phe，Phe-Phe， Phe-Trp-Phe，Trp-Phe-Trp，Phe-Trp-Phe-Trp，Trp-Phe-Trp-Phe，或 Tyr-Tyr-Tyr-Tyr等(SEQ ID NOs：85-112)或它们的组合。

另外，芳香氨基酸组分(AA)_x可以包含或可以侧连含有-SH的结构部 分，其允许通过二硫键引入该组分作为上述通式(I)的另一部分，例如，作 为接头或更优选地作为重复组分[S-P²-S]_n的组分。所述含有-SH的结构部 分可以是本文定义的适合将本文定义的一种组分偶联到本文定义的另一 组分上的任意结构部分。例如，所述含有-SH的结构部分可以是半胱氨 酸。那么，例如，所述芳香氨基酸组分(AA)_x可以选自，例如，肽组合 Cys-Tyr-Cys，Cys-Trp-Cys，Cys-Trp-Tyr-Cys，Cys-Tyr-Trp-Cys， Cys-Trp-Trp-Cys，Cys-Tyr-Tyr-Cys，Cys-Trp-Tyr-Trp-Cys， Cys-Tyr-Trp-Tyr-Cys，Cys-Trp-Trp-Trp-Cys，Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys， Cys-Trp-Tyr-Trp-Tyr-Cys，Cys-Tyr-Trp-Tyr-Trp-Cys， Cys-Trp-Trp-Trp-Trp-Cys，Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Cys，Cys-Phe-Cys， Cys-Phe-Tyr-Cys，Cys-Tyr-Phe-Cys，Cys-Phe-Phe-Cys，Cys-Tyr-Tyr-Cys， Cys-Phe-Tyr-Phe-Cys，Cys-Tyr-Phe-Tyr-Cys，Cys-Phe-Phe-Phe-Cys， Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys，Cys-Phe-Tyr-Phe-Tyr-Cys，Cys-Tyr-Phe-Tyr-Phe-Cys， 或Cys-Phe-Phe-Phe-Phe-Cys，Cys-Phe-Trp-Cys，Cys-Trp-Phe-Cys， Cys-Trp-Trp-Cys，Cys-Phe-Trp-Phe-Cys，Cys-Trp-Phe-Trp-Cys， Cys-Phe-Trp-Phe-Trp-Cys，Cys-Trp-Phe-Trp-Phe-Cys等(SEQ ID NOs： 113-145)或它们的组合。上述每个Cys还可以被本文定义的携带游离-SH- 结构部分的任何修饰的肽或化学化合物所替换。

另外，芳香氨基酸组分(AA)_x可以包含至少一个脯氨酸，其可以作为 芳香氨基酸组分(AA)_x中较长的Trp、Tyr和Phe重复序列的结构中断剂， 优选包含两个、三个或更多个脯氨酸。

按照第二备选方案，氨基酸组分(AA)_x可以是亲水性(且优选是不带电 荷的极性)氨基酸组分(AA)_x。在本发明式(I)的创新性聚合载体中结合亲水 性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸或序列作为氨基亲水性(且优选是不 带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x允许与核酸货物的结合更加柔性。这导 致更有效地压缩核酸货物，并且因此获得更好的针对核酸酶和不需要的解 压缩的保护。还允许提供本发明式(I)的(长)聚合载体，其相对于完整载体 或优选在重复组分[S-P²-S]_n内具有减少的阳离子电荷，并且在这一情形 中，如果需要或必需的话，更好地调节结合特性。

对于这一目的，亲水性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x中的氨基酸AA可以选自相同的或不同的亲水性(且优选是不带电荷的极 性)氨基酸，例如，选自Thr，Ser，Asn或Gln。备选地，氨基酸AA(或 完整的亲水性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x)可以选自下 述肽组合：Ser-Thr，Thr-Ser，Ser-Ser，Thr-Thr，Ser-Thr-Ser，Thr-Ser-Thr， Ser-Ser-Ser，Thr-Thr-Thr，Ser-Thr-Ser-Thr，Thr-Ser-Thr-Ser，Ser-Ser-Ser-Ser， Thr-Thr-Thr-Thr，Gln-Asn，Asn-Gln，Gln-Gln，Asn-Asn，Gln-Asn-Gln， Asn-Gln-Asn，Gln-Gln-Gln，Asn-Asn-Asn，Gln-Asn-Gln-Asn， Asn-Gln-Asn-Gln，Gln-Gln-Gln-Gln，Asn-Asn-Asn-Asn，Ser-Asn，Asn-Ser， Ser-Ser，Asn-Asn，Ser-Asn-Ser，Asn-Ser-Asn，Ser-Ser-Ser，Asn-Asn-Asn， Ser-Asn-Ser-Asn，Asn-Ser-Asn-Ser，Ser-Ser-Ser-Ser，或Asn-Asn-Asn-Asn， 等(SEQ ID NOs：146-181)或它们的组合。

另外，亲水性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x可以包含 或可以侧连含有-SH的结构部分，其允许通过二硫键引入该组分作为上 述通式(I)的另一部分，例如，作为接头或更优选地作为重复组分[S-P²-S]_n的组分。所述含有-SH的结构部分可以是本文定义的适合将本文定义的 一种组分偶联到本文定义的另一组分上的任意结构部分。例如，所述含有 -SH的结构部分可以是半胱氨酸。那么，例如，所述亲水性(且优选是不 带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x可以选自，例如，肽组合Cys-Thr-Cys， Cys-Ser-Cys，Cys-Ser-Thr-Cys，Cys-Thr-Ser-Cys，Cys-Ser-Ser-Cys， Cys-Thr-Thr-Cys，Cys-Ser-Thr-Ser-Cys，Cys-Thr-Ser-Thr-Cys， Cys-Ser-Ser-Ser-Cys，Cys-Thr-Thr-Thr-Cys，Cys-Ser-Thr-Ser-Thr-Cys， Cys-Thr-Ser-Thr-Ser-Cys，Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-Cys， Cys-Thr-Thr-Thr-Thr-Cys，Cys-Asn-Cys，Cys-Gln-Cys，Cys-Gln-Asn-Cys， Cys-Asn-Gln-Cys，Cys-Gln-Gln-Cys，Cys-Asn-Asn-Cys， Cys-Gln-Asn-Gln-Cys，Cys-Asn-Gln-Asn-Cys，Cys-Gln-Gln-Gln-Cys， Cys-Asn-Asn-Asn-Cys，Cys-Gln-Asn-Gln-Asn-Cys， Cys-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys，Cys-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys， Cys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys，Cys-Asn-Cys，Cys-Ser-Cys，Cys-Ser-Asn-Cys， Cys-Asn-Ser-Cys，Cys-Ser-Ser-Cys，Cys-Asn-Asn-Cys， Cys-Ser-Asn-Ser-Cys，Cys-Asn-Ser-Asn-Cys，Cys-Ser-Ser-Ser-Cys， Cys-Asn-Asn-Asn-Cys，Cys-Ser-Asn-Ser-Asn-Cys， Cys-Asn-Ser-Asn-Ser-Cys，Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-Cys，或 Cys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys，等(SEQ ID NOs：182-223)或它们的组合。 上述每个Cys还可以被本文定义的携带游离-SH-结构部分的任何修饰的 肽或化学化合物所替换。

另外，亲水性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸组分(AA)_x可以包含 至少一个脯氨酸，其可以作为亲水性(且优选是不带电荷的极性)氨基酸组 分(AA)_x中较长的Ser、Thr和Asn重复序列的结构中断剂，优选包含两个、 三个或多个脯氨酸。

按照第三备选方案，氨基酸组分(AA)_x可以是亲脂性氨基酸组分 (AA)_x。在本发明式(I)的创新性聚合载体中结合亲脂性氨基酸或序列作为 氨基亲脂性氨基酸组分(AA)_x允许更强地压缩核酸货物和/或在形成复合 物时更强地压缩式(I)的聚合载体及其核酸货物。这特别是由于本发明聚合 载体的一条或多条聚合物链(特别是亲脂性氨基酸组分(AA)_x的亲脂性部 分，优选在分式/组分{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}的情形中)与核酸货物的相 互作用导致。这种相互作用优选地将为式(I)的聚合载体及其核酸货物之间 的复合物增加另外的稳定性。这种稳定性在某种程度上可以比得上一类在 不同聚合物链之间的非共价交联。尤其是在水性环境中，这种相互作用典 型地很强，并且提供显著的影响。

对于这一目的，亲脂性氨基酸组分(AA)_x中的氨基酸AA可以选自相 同的或不同的亲脂性氨基酸，例如，选自Leu，Val，Ile，Ala，Met。备 选地，氨基酸AA(或完整的亲脂性氨基酸组分(AA)_x)可以选自下述肽 组合：Leu-Val，Val-Leu，Leu-Leu，Val-Val，Leu-Val-Leu，Val-Leu-Val， Leu-Leu-Leu，Val-Val-Val，Leu-Val-Leu-Val，Val-Leu-Val-Leu， Leu-Leu-Leu-Leu，Val-Val-Val-Val，Ile-Ala，Ala-Ile，Ile-Ile，Ala-Ala， Ile-Ala-Ile，Ala-Ile-Ala，Ile-Ile-Ile，Ala-Ala-Ala，Ile-Ala-Ile-Ala， Ala-Ile-Ala-Ile，Ile-Ile-Ile-Ile，Ala-Ala-Ala-Ala，Met-Ala，Ala-Met，Met-Met， Ala-Ala，Met-Ala-Met，Ala-Met-Ala，Met-Met-Met，Ala-Ala-Ala， Met-Ala-Met-Ala，Ala-Met-Ala-Met，或Met-Met-Met-Met等(SEQ ID NOs： 224-258)或它们的组合。

另外，亲脂性氨基酸组分(AA)_x可以包含或可以侧连含有-SH的结构 部分，其允许通过二硫键引入该组分作为上述通式(I)的另一部分，例如， 作为接头或更优选地作为重复组分[S-P²-S]_n的组分。所述含有-SH的结构 部分可以是本文定义的适合将本文定义的一种组分偶联到本文定义的另 一组分上的任意结构部分。例如，所述含有-SH的结构部分可以是半胱 氨酸。那么，例如，所述亲脂性氨基酸组分(AA)_x可以选自，例如，肽组 合Cys-Val-Cys，Cys-Leu-Cys，Cys-Leu-Val-Cys，Cys-Val-Leu-Cys， Cys-Leu-Leu-Cys，Cys-Val-Val-Cys，Cys-Leu-Val-Leu-Cys， Cys-Val-Leu-Val-Cys，Cys-Leu-Leu-Leu-Cys，Cys-Val-Val-Val-Cys， Cys-Leu-Val-Leu-Val-Cys，Cys-Val-Leu-Val-Leu-Cys， Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys，Cys-Val-Val-Val-Val-Cys，Cys-Ala-Cys， Cys-Ile-Cys，Cys-Ile-Ala-Cys，Cys-Ala-Ile-Cys，Cys-Ile-Ile-Cys， Cys-Ala-Ala-Cys，Cys-Ile-Ala-Ile-Cys，Cys-Ala-Ile-Ala-Cys， Cys-Ile-Ile-Ile-Cys，Cys-Ala-Ala-Ala-Cys，Cys-Ile-Ala-Ile-Ala-Cys， Cys-Ala-Ile-Ala-Ile-Cys，Cys-Ile-Ile-Ile-Ile-Cys，或 Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys，Cys-Met-Cys，Cys-Met-Ala-Cys， Cys-Ala-Met-Cys，Cys-Met-Met-Cys，Cys-Ala-Ala-Cys， Cys-Met-Ala-Met-Cys，Cys-Ala-Met-Ala-Cys，Cys-Met-Met-Met-Cys， Cys-Ala-Ala-Ala-Cys，Cys-Met-Ala-Met-Ala-Cys， Cys-Ala-Met-Ala-Met-Cys，Cys-Met-Met-Met-Met-Cys，或 Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys等(SEQ ID NOs：289-299)或它们的组合。上述 每个Cys还可以被本文定义的携带游离-SH-结构部分的任何修饰的肽或 化学化合物所替换。

另外，亲脂性氨基酸组分(AA)_x可以包含至少一个脯氨酸，其可以作 为亲脂性氨基酸组分(AA)_x中较长的Leu、Val、Ile、Ala和Met重复序列 的结构中断剂，优选包含两个、三个或多个脯氨酸。

按照第四备选方案，氨基酸组分(AA)_x可以是弱碱性氨基酸组分 (AA)_x。在本发明式(I)的创新性聚合载体中结合弱碱性氨基酸或序列作为 弱碱性氨基酸组分(AA)_x可以质子海绵，并且促进内体逃逸(也称为内体 释放)(质子海绵效应)。结合所述弱碱性氨基酸组分(AA)_x优选地提高转 染效率。

对于这一目的，弱碱性氨基酸组分(AA)_x中的氨基酸AA可以选自相 同的或不同的弱氨基酸，例如，选自组氨酸或天冬氨酸盐(aspartate)(天 冬氨酸(aspartic acid))。备选地，弱碱性氨基酸AA(或完整的弱碱性氨基 酸组分(AA)_x)可以选自下述肽组合：Asp-His，His-Asp，Asp-Asp，His-His， Asp-His-Asp，His-Asp-His，Asp-Asp-Asp，His-His-His，Asp-His-Asp-His， His-Asp-His-Asp，Asp-Asp-Asp-Asp，或His-His-His-His等(SEQ ID NOs： 300-311)或它们的组合。

另外，弱碱性氨基酸组分(AA)_x可以包含或可以侧连含有-SH的结构 部分，其允许通过二硫键引入该组分作为上述通式(I)的另一部分，例如， 作为接头或更优选地作为重复组分[S-P²-S]_n的组分。所述含有-SH的结构 部分可以是本文定义的适合将本文定义的一种组分偶联到本文定义的另 一组分上的任意结构部分。例如，所述含有-SH的结构部分可以是半胱 氨酸。那么，例如，所述弱碱性氨基酸组分(AA)_x可以选自，例如，肽组 合Cys-His-Cys，Cys-Asp-Cys，Cys-Asp-His-Cys，Cys-His-Asp-Cys， Cys-Asp-Asp-Cys，Cys-His-His-Cys，Cys-Asp-His-Asp-Cys， Cys-His-Asp-His-Cys，Cys-Asp-Asp-Asp-Cys，Cys-His-His-His-Cys， Cys-Asp-His-Asp-His-Cys，Cys-His-Asp-His-Asp-Cys， Cys-Asp-Asp-Asp-Asp-Cys，或Cys-His-His-His-His-Cys等(SEQ ID NOs： 312-325)或它们的组合。上述每个Cys还可以被本文定义的携带游离-SH- 结构部分的任何修饰的肽或化学化合物所替换。

另外，弱碱性氨基酸组分(AA)_x可以包含至少一个脯氨酸，其可以作 为弱碱性氨基酸组分(AA)_x中较长的组氨酸或天冬氨酸盐(aspartate)(天冬 氨酸(aspartic acid))重复序列的结构中断剂，优选包含两个、三个或多个 脯氨酸。

另外，本发明上述式(I)(或根据本文中任意其分式)的聚合载体可 以包含下述作为另外的组分，优选作为配体L或作为氨基酸组分(AA)_x： 允许本发明上述式(I)的聚合载体易位到特定的靶标，例如，易位到细胞中， 到细胞核中，到内体区室中的信号肽，定位信号或序列或核定位信号或序 列(NLS)，关于线粒体基质的序列，关于质膜的定位序列，关于高尔基体、 细胞核、胞质和细胞骨架(cytosceleton)等的定位序列。所述信号肽、定 位信号或序列或核定位信号可以用于转运任何本文定义的核酸，优选 RNA或DNA，更优选shRNA或pDNA，例如，将其转运到细胞核中。 不限于此，所述信号肽、定位信号或序列或核定位信号可以包含，例如， 关于内质网的定位序列。具体的定位信号或序列或核定位信号可以包括， 例如，KDEL(SEQ ID NO：326)，DDEL(SEQ ID NO：327)，DEEL(SEQ ID  NO：328)，QEDL(SEQ ID NO：329)，RDEL(SEQ ID NO：330)，和 GQNLSTSN(SEQ ID NO：331)，核定位序列，包括PKKKRKV(SEQ ID NO： 332)，PQKKIKS(SEQ ID NO：333)，QPKKP(SEQ ID NO：334)，RKKR (SEQ ID NO：335)，RKKRRQRRRAHQ(SEQ ID NO：336)， RQARRNRRRRWRERQR(SEQ ID NO：337)，MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID NO：338)，GAALTILV(SEQ ID NO：339)，和GAALTLLG(SEQ ID  NO：340)，关于内体区室的定位序列，包括MDDQRDLISNNEQLP(SEQ  ID  NO：341)，关于线粒体基质的定位序列，包括 MLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX(SEQ ID NO：342)，关 于质膜的定位序列：GCVCSSNP(SEQ ID NO：343)，GQTVTTPL(SEQ ID  NO：344)，GQELSQHE(SEQ ID NO：345)，GNSPSYNP(SEQ ID NO：346)， GVSGSKGQ(SEQ ID NO：347)，GQTITTPL(SEQ ID NO：348)， GQTLTTPL(SEQ ID NO：349)，GQIFSRSA(SEQ ID NO：350)，GQIHGLSP (SEQ ID NO：351)，GARASVLS(SEQ ID NO：352)，和GCTLSAEE(SEQ  ID NO：353)，关于内质网和细胞核的定位序列，包括GAQVSSQK(SEQ ID  NO：354)，和GAQLSRNT(SEQ ID NO：355)，关于高尔基体、细胞核、 胞质和细胞骨架的定位序列，包括GNAAAAKK(SEQ ID NO：356)，关于 胞质和细胞骨架的定位序列，包括GNEASYPL(SEQ ID NO：357)，关于 质膜和细胞骨架的定位序列，包括GSSKSKPK(SEQ ID NO：358)等。本 文定义的分泌信号肽序列的实例包括，但不限于，经典或非经典MHC- 分子的信号序列(例如，I和II类MHC分子的信号序列，例如，I类MHC 分子HLA-A*0201的信号序列)，本文定义的细胞因子或免疫球蛋白的信 号序列，本文定义的免疫球蛋白或抗体的不变链的信号序列，Lamp1、 Tapasin、Erp57、Calretikulin、钙联接蛋白(Calnexin)、和其它膜相关蛋白 或与内质网(ER)或内体-溶酶体区室相关的蛋白的信号序列。特别优选 地，按照本发明可以使用I类MHC分子HLA-A*0201的信号序列。最优 选地，所述另外的组分可以作为本文定义的组分L而存在。备选地，所 述另外的组分还可以例如结合到本文定义的组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x上，例如结合到组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x中任一种的侧链上，优选通 过组分P²的侧链进行结合，或任选地作为组分L与P¹或P³与L之间的 接头。与组分L、P¹、P²或P³任一种的结合还可以用对酸敏感的键实现， 优选地通过组分L、P¹、P²、P³任一种的侧链，其允许在较低pH值(例 如在本文定义的生理pH值下)解离或释放所述另外的组分。

另外，本发明上述式(I)(或根据本文中任意其分式)的聚合载体可 以包含其它功能肽或蛋白，优选地作为配体或氨基酸组分(AA)_x，其可以 相应地调节本发明的聚合载体的官能性。按照一个备选方案，所述其它功 能肽或蛋白可以包括用于转运的所谓的细胞穿透肽(CPPs)或阳离子肽。特 别优选的是CPPs，其在内体中诱导pH-介导的构象变化，并且通过插入 到脂质体的脂质层而导致本发明的聚合载体(其与核酸复合)由内体的释 放提高。用于转运的所谓的细胞穿透肽(CPPs)或阳离子肽，可以包括，但 不限于鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，碱性多 肽，聚精氨酸，细胞穿透肽(CPPs)，嵌合CPPs，如Transportan，或MPG 肽，HIV-结合肽，Tat，HIV-1Tat(HIV)，Tat-衍生肽，寡聚精氨酸，穿透 肽家族成员，例如穿透肽(Penetratin)，触角足-衍生肽(特别是来自 Drosophila antennapedia)，pAntp，pIsl等，抗微生物-衍生的CPPs，例如 Buforin-2，Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT-衍生肽，SAP，MAP， KALA，PpTG20，富含脯氨酸的肽，Loligomers，富含精氨酸的肽，降钙 素-肽，FGF，乳铁蛋白，聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，组蛋白，VP22衍生 的或类似物肽，HSV，VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白转导结构 域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽， Pep-1，L-寡聚物，降钙素肽等。同样地，所述另外的组分可以作为本文 定义的组分L或(AA)_x而存在。备选地，所述另外的组分还可以结合到本 文定义的组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x上，例如结合到组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x中任一种的侧链上，优选通过组分P²的侧链进行结合，或任选地 作为组分L与P¹或P³与L之间的接头。与组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x任一种的结合还可以用对酸敏感的键实现，优选地通过组分L、P¹、P²、 P³或(AA)_x任一种的侧链，其允许在较低pH值(例如在本文定义的生理 pH值下)解离或释放所述另外的组分。在这一情形中，特别优选的是， 该另外的组分作为配体L或作为式(I)的重复组分[S-P²-S]_n的氨基酸组分 (AA)_x而存在。

按照最后一个备选方案，本发明上述式(I)(或本文中任意其分式) 的聚合载体可以包含可以在细胞中发挥任意有利作用的任意肽或蛋白作 为另外的组分，优选作为氨基酸组分(AA)_x。特别优选的是选自下列的肽 或蛋白：治疗活性蛋白或肽，抗原，例如肿瘤抗原，致病性抗原(动物抗 原，病毒抗原，原生动物抗原，细菌抗原，变应性抗原)，自体免疫抗原， 或其它抗原，变应原，抗体，免疫刺激性蛋白或肽，抗原特异性T-细胞 受体，或如下文关于编码核酸定义的适于特定(治疗性)应用的任意其他 蛋白或肽。特别优选的是来自本文定义的抗原的肽表位。同样地，所述另 外的组分可以优选作为本文定义的(AA)_x存在。备选地，所述另外的组分 还可以结合到本文定义的组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x上，例如，结合到 组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x中任一种的侧链上，优选通过组分P²的侧链 进行结合，或任选地作为组分L与P¹或P³与L之间的接头。与组分L、 P¹、P²、P³或(AA)_x任一种的结合还可以用对酸敏感的键实现，优选地通 过组分L、P¹、P²、P³或(AA)_x任一种的侧链，其允许在较低pH值(例如 在本文定义的生理pH值下)解离或释放所述另外的组分。在这一情形中， 特别优选的是这种另外的组分作为式(I)的重复组分[S-P²-S]_n的氨基酸组 分(AA)_x存在。

本发明式(I)的聚合载体可以包含至少一个上文提及的阳离子或聚阳 离子肽、蛋白或聚合物或其他组分，例如(AA)，其中任意上述备选方案 可以彼此组合，并且可以通过将它们在聚合缩合反应中通过其-SH-结构 部分聚合而形成。

此外，按照本发明的第二实施方案，本发明潜在的目的是通过由核 酸货物和本文定义的通式(I)L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L(或本文定义的任意其 分式)的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物来解决的。该 复合物还可以称为用于本申请的目的的“复合的核酸”。

在本发明的聚合载体货物复合物中，本文定义的通式(I) L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L(或本文中任意其分式)的聚合载体分子和核酸货 物典型地以本发明聚合载体分子：核酸约5至10000的摩尔比率、优选地 以约5至5000的摩尔比率、更优选地以约5至2500的摩尔比率、甚至更 优选地以约5至2000的摩尔比率、最优选地以约5至1000的摩尔比率而 提供，或以本发明聚合载体分子：核酸约50至1000的摩尔比率、例如， 以本发明聚合载体分子：核酸约10至5000的摩尔比率、以约20至2500 的摩尔比率、以约25至2000摩尔比率而提供。

此外，在本发明的聚合载体货物复合物中，本文定义的通式(I) L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L(或本文中任意其分式)的聚合载体分子和核酸货 物优选以约0.1至20的N/P-比率、优选以约0.2至12的N/P-比率、甚至 更优选以约0.4至10或0.6至5的N/P-比率提供。在这一情形中，N/P- 比率定义为完整的本发明的聚合载体货物复合物的氮/磷酸根比率(N/P- 比率)。这典型地是本发明的聚合载体中肽(如果使用肽的话)的含量/ 量的例示，和在本发明的聚合载体货物复合物中结合或复合的核酸的含量 /量的特征。其可以基于下述计算：例如，1μg RNA典型地包含约3nmol 磷酸根残基，条件是所述RNA表现出碱基的统计学分布。另外，1μg肽 典型地包含约x*1μg/M(肽)nmol氮残基，这取决于分子量和其(阳离子) 氨基酸的数目x。

在本发明的情形中，由核酸货物和通式(I)(或本文中任意其分式) 的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的所述核酸货物可 以是任意适合的核酸，例如，其选自任意DNA，优选但不限于，例如， 基因组DNA，单链DNA分子，双链DNA分子，编码DNA，DNA引物， DNA探针，pDNA，免疫刺激性DNA或可以选自，例如，任意PNA(肽 核酸)或可以选自，例如，任意RNA，优选但不限于，编码RNA，信使 RNA(mRNA)，siRNA，shRNA，反义RNA，或riboswitches，免疫刺激 性RNA(isRNA)核酶或适体等。核酸还可以是核糖体RNA(rRNA)，转运 RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)，或病毒RNA(vRNA)。优选地，所述 核酸是RNA，更优选是编码RNA。甚至更优选地，核酸可以是(线性) 单链RNA，甚至更优选是mRNA。在本发明的情形中，mRNA典型地是 RNA，其由一些结构元件组成，例如，可选的5’-UTR区，位于上游的核 糖体结合位点，接着是编码区，可选的3’-UTR区，其后可以接着聚-A尾 (和/或聚-C尾)。mRNA可以作为单顺反子、双顺反子、或甚至多顺反 子RNA存在，即为携带一种、两种或多种(相同的或不同的)本文定义 的蛋白或肽的编码序列的RNA。在双顺反子或甚至多顺反子mRNA中的 所述编码序列可以被至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列隔开。

此外，由核酸货物和通式(I)(或本文中任意其分式)的聚合载体分 子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸可以是单链或双链核酸(分 子)(由于两条单链核酸(分子)的非共价缔合，其也可以视为核酸(分 子))或部分双链或部分单链的核酸，其至少部分自我互补(这些部分双 链的或部分单链的核酸分子二者典型地由较长的和较短的单链核酸分子 形成或由两条长度大约相同的单链核酸分子形成，其中一条单链核酸分子 与另一条单链核酸分子部分互补，并且二者由此在该区域中形成双链核酸 分子，即，部分双链或部分单链的核酸(分子))。优选地，所述核酸(分 子)可以是单链核酸分子。此外，所述核酸(分子)可以是环形或线性核 酸分子，优选是线性核酸分子。

编码核酸：

本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子可以编码蛋白或肽，其可 以选自，但不限于此，例如，治疗活性蛋白或肽，例如选自辅助蛋白 (adjuvant protein)，抗原，例如肿瘤抗原，致病性抗原(例如选自动物 抗原，病毒抗原，原生动物抗原，细菌抗原)，变应性抗原，自体免疫抗 原，或其它抗原，变应原，抗体，免疫刺激性蛋白或肽，抗原特异性T- 细胞受体，或适于特定(治疗性)应用的任意其他蛋白或肽，其中可以将 编码核酸转运到细胞、组织或生物体中，并且随后可以在该细胞、组织或 生物体中表达蛋白。

本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子的编码区可以作为单顺反 子核酸、双顺反子核酸或甚至多顺反子核酸存在，即为携带一种、两种或 多种蛋白或肽的编码序列的核酸。在双顺反子或甚至多顺反子核酸中的所 述编码序列可以由至少一个内部核糖体进入位点(IRES)序列隔开，或由信 号肽隔开，所述信号肽诱导所得到的包含数个蛋白或肽的多肽的分裂。

在特别优选的方面中，所编码的肽或蛋白选自人、病毒、细菌、原 生动物蛋白或肽。

a)治疗活性蛋白

在本发明的情形中，治疗活性蛋白或肽可以由本文定义的本发明的 聚合载体货物复合物的核酸分子所编码。治疗活性蛋白在本文中定义为对 治愈有作用、预防性防止或治疗性治疗疾病(优选如本文定义的疾病)的 蛋白，或是个体需要的蛋白。这些可以选自技术人员从现有技术中已知的 任何天然的或合成设计存在的重组或分离的蛋白。不限于此，治疗活性蛋 白可以包括能够刺激或抑制细胞中的信号转导的蛋白，例如，细胞因子， 淋巴因子，单核因子，生长因子，受体，信号转导分子，转录因子等；抗 凝剂；抗凝血酶；抗变应性蛋白；凋亡因子或凋亡相关的蛋白，治疗活性 酶和与任何获得性疾病或任何遗传性疾病相联系的任何蛋白。

治疗活性蛋白，其可以由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物 的核酸分子编码，也可以是辅助蛋白。在这一情形中，辅助蛋白优选理解 为能够引发本文定义的先天性免疫应答的任何蛋白。优选地，所述先天性 免疫应答包括模式识别受体的激活，所述受体诸如例如，选自Toll-样受 体(TLR)家族的受体，包括，例如，选自人TLR1至TLR10或选自鼠Toll 样受体TLR1至TLR13的Toll样受体。更优选地，所述辅助蛋白选自人 辅助蛋白或选自致病性辅助蛋白，选自由下列组成的组，但不限于此，细 菌蛋白，原生动物蛋白，病毒蛋白，或真菌蛋白，动物蛋白，特别是选自 细菌辅助蛋白。另外，还可以使用编码参与辅助作用的人蛋白(例如，模 式识别受体的配体、模式识别受体、信号转导途径的蛋白、转录因子或细 胞因子)的核酸。

b)抗原

本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子可以备选地编 码抗原。按照本发明，术语“抗原”是指由免疫系统识别并且能够引发抗 原-特异性免疫应答(例如，通过形成作为被动免疫应答的一部分的抗体 或抗原-特异性T细胞)的物质。在这种情形中，蛋白的抗原性表位、片 段或肽特别意指B细胞和T细胞表位，其可以分别被B细胞、抗体或T 细胞识别。

在本发明的情形中，由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的 核酸分子编码的抗原典型地包括落入上述定义中的任何抗原、抗原性表位 或抗原性肽，更优选是蛋白和肽抗原，例如，肿瘤抗原，变应性抗原，自 体免疫自身抗原，致病性抗原等。特别地，由本文定义的本发明的聚合载 体货物复合物的核酸分子编码的抗原可以是在细胞外产生的抗原，更典型 地是不是来源于宿主生物体(例如，人)本身(即非自身抗原)而是来源 于宿主生物体之外的宿主细胞的抗原，例如，病毒抗原，细菌抗原，真菌 抗原，原生动物抗原，动物抗原，变应性抗原等。变应性抗原(变应抗原) 典型地是在人中引起变应症的抗原，并且可以来源于人或其它来源。另外， 由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子编码的抗原还可 以是在细胞、组织或身体内产生的抗原。所述抗原包括来源于宿主生物体 (例如，人)自身的抗原，例如，肿瘤抗原，自身抗原或自体抗原，诸如 自体免疫自身抗原等，以及本文定义的(非自身)抗原，其最初来源于宿 主生物体外的宿主细胞，但是其在身体、组织或细胞内分解或降解，例如， 通过(蛋白酶)降解、代谢机制等分解或降解。

由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子编码的一种 种类的抗原包括肿瘤抗原。“肿瘤抗原”优选地位于(肿瘤)细胞的表面。 肿瘤抗原还可以选自与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的蛋白。此外， 肿瘤抗原还包括在自身不(或最初自身不)退化但是与假定的肿瘤相关的 细胞中表达的抗原。此处还包括与供应肿瘤的血管或其(再)形成联系的 抗原，特别是与新血管形成相关的那些抗原，例如，生长因子，诸如VEGF、 bFGF等。与肿瘤相联系的抗原还包括来自细胞或组织的抗原，所述细胞 或组织典型地嵌在肿瘤中。此外，一些物质(通常是蛋白或肽)在(已知 或未知)患有癌症疾病的患者中表达，并且它们在所述患者的体液中以增 加的浓度存在。这些物质也称为“肿瘤抗原”，然而，在诱导免疫应答的 物质的严格意义上，它们不是抗原。这种种类的肿瘤抗原可以进一步分成 肿瘤特异性抗原(TSAs)和肿瘤相关抗原(TAAs)。TSAs仅可以由肿瘤细胞 呈递，并且从不被正常的“健康”细胞呈递。这典型地由肿瘤特异性突变 导致。更常见的TAAs通常由肿瘤和健康细胞二者呈递。这些抗原被识别 并且抗原呈递细胞可以被细胞毒性T细胞破坏。另外，肿瘤抗原还可以 以例如突变的受体的形式存在于肿瘤的表面。在这种情形中，它们可以被 抗体识别。

按照优选的方面，由本发明的聚合载体货物复合物的核酸编码的此 类肿瘤抗原选自由下列各项组成的组：5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIP  HPG1，α-5-β-1-整联蛋白，α-5-β-6-整联蛋白，α-辅肌动蛋白-4/m，α-甲基 酰基-辅酶A消旋酶，ART-4，ARTC1/m，B7H4，BAGE-1，BCL-2，bcr/abl， β-联蛋白/m，BING-4，BRCA1/m，BRCA2/m，CA 15-3/CA27-29，CA 19-9， CA72-4，CA125，钙网织蛋白，CAMEL，CASP-8/m，组织蛋白酶B，组 织蛋白酶L，CD19，CD20，CD22，CD25，CDE30，CD33，CD4，CD52， CD55，CD56，CD80，CDC27/m，CDK4/m，CDKN2A/m，CEA，CLCA2， CML28，CML66，COA-1/m，coactosin-样蛋白，collage XXIII，COX-2， CT-9/BRD6，Cten，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，cyp-B，CYPB1， DAM-10，DAM-6，DEK-CAN，EFTUD2/m，EGFR，ELF2/m，EMMPRIN， EpCam，EphA2，EphA3，ErbB3，ETV6-AML1，EZH2，FGF-5，FN， Frau-1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6， GAGE7b，GAGE-8，GDEP，GnT-V，gp100，GPC3，GPNMB/m，HAGE， HAST-2，hepsin，Her2/neu，HERV-K-MEL，HLA-A*0201-R17I， HLA-A11/m，HLA-A2/m，HNE，同源框NKX3.1，HOM-TES-14/SCP-1， HOM-TES-85，HPV-E6，HPV-E7，HSP70-2M，HST-2，hTERT，iCE，IGF-1R， IL-13Ra2，IL-2R，IL-5，不成熟的层粘连蛋白受体，激肽释放酶-2，激肽 释放酶-4，Ki67，KIAA0205，KIAA0205/m，KK-LC-1，K-Ras/m，LAGE-A1， LDLR-FUT，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6， MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3， MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17， MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D1，MAGE-D2，MAGE-D4， MAGE-E1，MAGE-E2，MAGE-F1，MAGE-H1，MAGEL2，乳球蛋白 (mammaglobin)A，MART-1/黑-A(melan-A)，MART-2，MART-2/m，基 质蛋白22，MC1R，M-CSF，ME1/m，间皮素(mesothelin)，MG50/PXDN， MMP11，MN/CA IX-抗原，MRP-3，MUC-1，MUC-2，MUM-1/m， MUM-2/m，MUM-3/m，I类肌球蛋白/m，NA88-A，N-乙酰葡糖氨基转移 酶-V，Neo-PAP，Neo-PAP/m，NFYC/m，NGEP，NMP22，NPM/ALK， N-Ras/m，NSE，NY-ESO-1，NY-ESO-B，OA1，OFA-iLRP，OGT，OGT/m， OS-9，OS-9/m，骨钙素，骨桥蛋白，p15，p190较小bcr-abl，p53，p53/m， PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PART-1，PATE，PDEF，Pim-1-激酶，Pin-1， Pml/PARα，POTE，PRAME，PRDX5/m，prostein，蛋白酶-3，PSA，PSCA， PSGR，PSM，PSMA，PTPRK/m，RAGE-1，RBAF600/m，RHAMM/CD 168， RU1，RU2，S-100，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SCC，SIRT2/m， Sp17，SSX-1，SSX-2/HOM-MEL-40，SSX-4，STAMP-1，STEAP，存活 蛋白，存活蛋白-2B，SYT-SSX-1，SYT-SSX-2，TA-90，TAG-72，TARP， TEL-AML1，TGFβ，TGFβRII，TGM-4，TPI/m，TRAG-3，TRG，TRP-1， TRP-2/6b，TRP/INT2，TRP-p8，酪氨酸酶，UPA，VEGF，VEGFR-2/FLK-1， 和WT1，或它们的片段、变体或表位。表位典型地包含所述抗原(优选 以其天然形式存在)的5-15个、优选5-12个、更优选6-9个氨基酸。

按照另一个备选方案，由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物 的核酸分子编码的另一类抗原包括变应原性抗原。所述变应原性抗原可以 选自由不同来源衍生的抗原，例如，来自动物、植物、真菌、细菌等的抗 原。在这种情形中，变应原包括，例如，草类(grasses)，花粉，霉菌， 药物，或多种环境引发剂等。变应原性抗原典型地属于不同种类的化合物， 诸如核酸及其片段，蛋白或肽及其片段，碳水化合物，多糖，糖，脂质， 磷脂等。在本发明的情形中特别感兴趣的是抗原，其可以由本发明的聚合 载体货物复合物的核酸分子编码，即，蛋白或肽抗原及其片段或表位，或 核酸及其片段，特别是编码所述蛋白或肽抗原及其片段或表位的核酸及其 片段。

c)抗体

按照另一个备选方案，本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的 核酸分子可以编码抗体或抗体片段。按照本发明，所述抗体可以选自本领 域已知的任何抗体，例如，任何重组生产或天然存在的抗体，特别是适用 于治疗、诊断或科学目的的抗体，或已经关于特定癌症疾病鉴定的抗体。 本文中，术语“抗体”以其最广泛意义使用，并且特别涵盖单克隆和多克 隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、和阻断或中和抗体)和具有多表位特异性 的抗体种类。按照本发明，术语“抗体”典型地包括本领域已知的任何抗 体(例如IgM，IgD，IgG，IgA和IgE抗体)，诸如天然存在的抗体，通过 免疫在宿主生物体中产生的抗体，由天然存在的抗体分离和鉴定的抗体或 通过免疫在宿主生物体中产生的抗体和通过本领域已知的生物分子方法 重组产生的抗体，以及嵌合抗体，人抗体，人源化抗体，双特异性抗体， 细胞内抗体，即在细胞中表达并且任选地定位在特定细胞区室中的抗体， 以及前述抗体的片段和变体。一般地，抗体由轻链和重链组成，所述轻链 和重链均具有可变结构域和恒定结构域。轻链由N-端可变结构域V_L和 C-端恒定结构域C_L组成。相反，IgG抗体的重链，例如，由N-端可变结 构域V_H和三个恒定结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。

在本发明的情形中，由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的 核酸分子编码的抗体可以优选地包括全长抗体，即由完全重链和完全轻链 组成的抗体，如前文所述。然而，抗体的衍生物，诸如抗体片段、变体或 加合物，也可以由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子编 码。抗体片段优选地选自前述(全长)抗体的Fab，Fab’，F(ab’)₂，Fc， Facb，pFc’，Fd和Fv片段。一般地，抗体片段在本领域中是已知的。例 如，Fab(“片段、抗原结合”)片段由每条重链和轻链的一个恒定结构域 和一个可变结构域组成。两个可变结构域结合特定抗原上的表位。两条链 通过二硫键连接。scFv(“单链可变片段”)片段，例如，典型地由轻链和 重链的可变结构域组成。所述结构域通过人工连接键连接，通常是多肽连 接，诸如由15-25个甘氨酸、脯氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽。

在所述情形中，优选的是抗体或抗体片段的不同链由多顺反子核酸 分子编码。备选地，抗体或抗体片段的不同链由数个单顺反子核酸(序列) 编码。

siRNA：

按照另一个备选方案，由核酸货物和通式(I)(或本文中任意其分式) 的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸可以采用 dsRNA的形式，优选是siRNA，dsRNA，或siRNA，特别感兴趣的是与 RNA干扰现象相关。体外RNA干扰(RNAi)技术基于双链RNA分子 (dsRNA)，其引发序列特异性的基因表达抑制(Zamore(2001)Nat.Struct. Biol.(自然结构生物学)9：746-750；Sharp(2001)Genes Dev.(基因发育) 5：485-490：Hannon(2002)Nature(自然)41：244-251)。在用长dsRNA转 染哺乳动物细胞时，蛋白激酶R和RNA酶L的激活导致非特异性作用， 诸如例如，干扰素反应(Stark等(1998)Annu.Rev.Biochem.(生物化学年 度综述)67：227-264；He和Katze(2002)Viral Immunol.(病毒免疫学)15： 95-119)。当使用较短的，例如21-至23-mer的所谓siRNA(小干扰RNA) 时，避免了这些非特异性作用，因为短于30bp的siRNA不引发非特异 性作用(Elbashir等(2001)Nature(自然)411：494-498)。

本发明的聚合载体货物复合物的核酸因此可以是长度为17-29、优选 19-25的双链RNA(dsRNA)，并且(dsRNA的核苷酸)优选与前述(治疗 相关)蛋白或抗原(作为活性成分)的核酸序列的一部分(编码部分或非 编码部分，优选编码部分)有至少90％、更优选95％、特别是100％的互 补性。90％的互补性意指，对于本文所述的dsRNA的长度，例如20个核 苷酸，这包含不多于2个不具有与相对应的mRNA部分的相对应互补性 的核苷酸。然而，按照本发明用作本发明的聚合载体货物复合物的核酸的 双链RNA的序列优选地在其通用结构上与前述治疗相关蛋白或抗原的核 酸的一部分完全互补。在这一情形中，由核酸货物和通式(I)的聚合载体分 子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸可以是具有通用结构 5′-(N_17-29)-3′的dsRNA，优选具有通用结构5′-(N_19-25)-3′，更优选具有通用 结构5′-(N_19-24)-3′，或更优选具有通用结构5′-(N_21-23)-3′，其中对于每个通 用结构，每个N是前述治疗相关蛋白或抗原的mRNA的一部分的(优选 不同的)核苷酸，优选选自治疗相关蛋白或抗原的mRNA的连续17-29 个数目的核苷酸，并且以其天然顺序存在于通用结构5′-(N_17-29)-3′中。原 则上，所有具有17-29、优选19-25个存在于mRNA编码区的碱基对的长 度的部分可以作为关于本文的dsRNA的靶序列。同等地，用作本发明的 聚合载体货物复合物的核酸的dsRNAs还可以针对前述(治疗相关)蛋白 或抗原(作为活性成分)的不位于编码区、特别是位于mRNA的5′非编 码区的核苷酸序列，例如，因此，针对mRNA具有调节功能的非编码区。 因此，用作本发明的聚合载体货物复合物的核酸的dsRNA的靶序列可以 位于mRNA的翻译区和不翻译区和/或位于前述蛋白或抗原的控制元件 区。用作本发明的聚合载体货物复合物的核酸的dsRNA的靶序列还可以 位于不翻译和翻译序列的重叠区；特别地，所述靶序列可以包含mRNA 编码区起始三联体上游的至少一个核苷酸。

免疫刺激性核酸：

a)免疫刺激性CpG核酸：

按照另一个备选方案，由核酸货物和通式(I)(或本文中任意其分式) 的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸可以采用(免 疫刺激性)CpG核酸的形式，特别是CpG-RNA或CpG-DNA，其优选诱 导先天免疫应答。按照本发明使用的CpG-RNA或CpG-DNA可以是单链 CpG-DNA(ss CpG-DNA)，双链CpG-DNA(dsDNA)，单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。按照本发明使用的CpG核酸 优选采用CpG-RNA的形式，更优选采用单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)的 形式。还优选地，所述CpG核酸具有上述长度。优选地，所述CpG基序 未甲基化。

b)免疫刺激性RNA(isRNA)：

同样地，按照另一个备选方案，由核酸货物和通式(I)(或本文中任 意其分式)的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸可 以采用免疫刺激性RNA(isRNA)的形式，其优选地引发先天性免疫应答。 所述免疫刺激性RNA可以是任意(双链或单链)RNA，例如编码RNA， 如本文定义。优选地，所述免疫刺激性RNA可以是单链的、双链的或部 分双链的RNA，更优选是单链RNA，和/或环形或线性RNA，更优选线 性RNA。更优选地，所述免疫刺激性RNA可以是(线性)单链RNA。甚 至更优选地，所述免疫刺激性RNA可以是(长)(线性)单链非编码RNA。 在这种情形中，特别优选的是，所述isRNA在其5’-端携带三磷酸，对于 体外转录的RNA是这种情形。免疫刺激性RNA还可以作为本文定义的 短RNA寡核苷酸存在。本文所用的免疫刺激性RNA还可以选自任何种 类的RNA分子，天然存在的或合成制备的，并且其可以诱导先天性免疫 应答并且可以支持由抗原诱导的适应性免疫应答。在这种情形中，免疫应 答可以以多种方式发生。关于适当的(适应性)免疫应答的基本因素是不 同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞典型地分成两个亚群，T辅助1(Th1)细 胞和T辅助2(Th2)细胞，利用其免疫系统能够破坏细胞内(Th1)和细胞外 (Th2)病原体(例如，抗原)。这两种Th细胞群在它们所产生的效应子蛋 白(细胞因子)的模式方面不同。因此，Th1细胞通过激活巨噬细胞和细 胞毒性T细胞而辅助细胞免疫应答。在另一方面，Th2细胞通过刺激B 细胞转化为浆细胞和通过形成抗体(例如，针对抗原的抗体)而促进体液 免疫应答。因此，在诱导和维持适应性免疫应答方面，Th1/Th2比率非常 重要。与本发明相联系的，(适应性)免疫应答的Th1/Th2比率优选向细 胞应答(Th1应答)方向转变，并且由此诱导细胞免疫应答。按照一个实 例，可以通过Toll样受体(TLRs)的配体激活可能支持适应性免疫应答的 先天性免疫系统。TLRs是高度保守的模式识别受体(PRR)多肽家族，其 识别病原体相关的分子模式(PAMPs)并且在哺乳动物的先天性免疫性中 起关键作用。目前，已经鉴定了至少十三个家族成员，称为TLR1-TLR13 (Toll-样受体：TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8， TLR9，TLR10，TLR11，TLR12或TLR13)。此外，已经鉴定了多个特异 性TLR配体。例如，发现未甲基化的细菌DNA及其合成的类似物(CpG  DNA)是关于TLR9的配体(Hemmi H等(2000)Nature(自然)408：740-5； Bauer S等(2001)Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)98， 9237-42)。此外，已经报道，关于某些TLRs的配体包括某些核酸分子， 并且某些类型的RNA以序列不依赖性或序列依赖性方式是免疫刺激性 的，其中这些不同的免疫刺激性RNAs可以，例如，刺激TLR3，TLR7， 或TLR8，或细胞内受体，诸如RIG-I，MDA-5等。例如，Lipford等确 定某些含有G，U的寡核糖核苷酸通过TLR7和TLR8作用是免疫刺激性的 (参见WO 03/086280)。相信由Lipford等所述的免疫刺激性含有G，U的寡 核糖核苷酸可来源于包括核糖体RNA、转运RNA、信使RNA、和病毒 RNA的RNA来源。

用作由核酸货物和通式(I)(或本文中任意其分式)的聚合载体分子 形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子的免疫刺激性RNA (isRNA)因此可以包括已知是免疫刺激性的任何RNA序列，包括但不限 于，呈递(representing)和/或编码TLRs的配体的RNA序列，优选选自 人家族成员TLR1-TLR10或鼠家族成员TLR1-TLR13，更优选选自(人) 家族成员TLR1-TLR10，甚至更优选选自TLR7和TLR8，关于RNA的 细胞内受体的配体(诸如RIG-I或MDA-5等)(参见例如.Meylan，E.， Tschopp，J.(2006).Toll-like receptors and RNA helicases：two parallel ways  to trigger antiviral responses(Toll样受体和RNA解旋酶：引发抗病毒反应 的两种平行方式).Mol.Cell(分子细胞)22，561-569)，或任意其它免疫 刺激性RNA序列。此外，用作本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子 的免疫刺激性RNA分子(种类)可以包括能够引发免疫应答的任何其它 RNA。不限于此，所述免疫刺激性RNA可以包括核糖体RNA(rRNA)， 转运RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)，和病毒RNA(vRNA)。所述免疫 刺激性RNA可以包括1000-5000，500-5000，5-5000，或5-1000，5-500， 5-250，5-100，5-50或5-30个核苷酸的长度。

按照本发明这一实施方案的一个特别优选的方面，所述免疫刺激性 核酸序列，特别是isRNA，由式(III)或(IV)的核酸组成或包括式(III)或(IV) 的核酸：

G_lX_mG_n    ，(式(III))

其中：

G是鸟苷、尿嘧啶或是鸟苷或尿嘧啶的类似物；

X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；

l是1-40的整数，

其中

当l＝1时，G是鸟苷或其类似物，

当l＞1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物；

m是整数且至少为3；

其中

当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，

当m＞3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；

n是1-40的整数，

其中

当n＝1时，G是鸟苷或其类似物，

当n＞1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物。

C_lX_mC_n    ，(式(IV))

其中：

C是胞嘧啶、尿嘧啶或是胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；

X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；

l是1-40的整数，

其中

当l＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，

当l＞1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；

m是整数且至少为3；

其中

当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，

当m＞3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；

n是1-40的整数，

其中

当n＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，

当n＞1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。

可以用作本发明的聚合载体货物复合物的核酸货物的式(III)或(IV)的 核酸，可以是相对短的核酸分子，典型的长度约为5-100(但是，对于特 定的实施方案，也可以长于100个核苷酸，例如，至多200个核苷酸)、 5-90或5-80个核苷酸，优选长度约为5-70，更优选长度约为8-60，更优 选长度约为15-60个核苷酸，更优选20-60，最优选30-60个核苷酸。如 果本发明的核酸货物复合物的核酸具有例如100个核苷酸的最大长度，则 m典型地＜＝98。式(III)的核酸中核苷酸G的数目由l或n确定。l和n， 彼此独立，分别是1-40的整数，其中当l或n＝1时，G是鸟苷或其类似 物，当l或n＞1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物。例如，不暗 示任何限制，当l或n＝4时，G_l或G_n可以是，例如，GUGU，GGUU， UGUG，UUGG，GUUG，GGGU，GGUG，GUGG，UGGG或GGGG等； 当l或n＝5时，G_l或G_n可以是，例如，GGGUU，GGUGU，GUGGU， UGGGU，UGGUG，UGUGG，UUGGG，GUGUG，GGGGU， GGGUG，GGUGG，GUGGG，UGGGG，或GGGGG等；等等。在本发 明式(III)的核酸中与X_m相邻的核苷酸优选不是尿嘧啶。类似地，在本发 明式(IV)的核酸中核苷酸C的数目由l或n确定。l和n，彼此独立，分别 是1-40的整数，其中当l或n＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，当l或n＞1 时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。例如，不暗示任何限制， 当l或n＝4时，C_l或C_n可以是，例如，CUCU，CCUU，UCUC，UUCC， CUUC，CCCU，CCUC，CUCC，UCCC或CCCC等；当l或n＝5时， C_l或C_n可以是，例如，CCCUU，CCUCU，CUCCU，UCCCU，UCCUC， UCUCC，UUCCC，CUCUC，CCCCU，CCCUC，CCUCC，CUCCC， UCCCC，或CCCCC等；等等。在本发明式(IV)的核酸中与X_m相邻的核 苷酸优选不是尿嘧啶。优选地，对于式(III)，当l或n＞1时，至少60％， 70％，80％，90％或甚至100％的核苷酸是鸟苷或其类似物，如上文定 义。在侧连序列G_l和/或G_n中至100％的其余的核苷酸(当鸟苷组成少于 100％的核苷酸)是尿嘧啶或其类似物，如前文定义。还优选地，l和n， 彼此独立，分别是2-30的整数，更优选是2-20的整数，更优选是2-15 的整数。如果有必要，l或n的下限可以变化，并且至少为1，优选至少 为2，更优选至少为3，4，5，6，7，8，9或10。这一定义相应地应用于 式(IV)。

按照本实施方案的另一个特别优选的方面，所述免疫刺激性核酸序 列，特别是isRNA，由式(V)或(VI)的核酸组成或包含式(V)或(VI)的核酸：

(N_uG_lX_mG_nN_v)_a，(式(V))

其中：

G是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或是鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的 类似物，优选是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；

X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、 胞苷(胞嘧啶)，或这些核苷酸(核苷)的类似物，优选尿苷(尿嘧啶) 或其类似物；

N是具有约4-50、优选约4-40、更优选约4-30或4-20个核酸的长度 的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺 苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷) 的类似物；

a是1-20的整数，优选1-15，最优选1-10；

l是1-40的整数，

其中，当l＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，

当l＞1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤) 或其类似物；

m是整数且至少为3；

其中，当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，和

当m＞3时，存在至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿 嘧啶)类似物；

n是1-40的整数，

其中，当n＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物

当n＞1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤) 或其类似物；

u，v可以彼此独立为0-50的整数，

优选地其中，当u＝0时，v≥1，或

当v＝0时，u≥1；

其中式(V)的核酸分子的长度至少为50个核苷酸，优选至少100个核苷酸， 更优选至少150个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且最优选至少 250个核苷酸。

(N_uC_lX_mC_nN_v)_a (式(VI))

其中：

C是胞苷(胞嘧啶)、尿苷(尿嘧啶)或是胞苷(胞嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的 类似物，优选是胞苷(胞嘧啶)或其类似物；

X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、 胞苷(胞嘧啶)，或前述核苷酸(核苷)的类似物，优选尿苷(尿嘧啶) 或其类似物；

N分别是彼此独立具有约4-50、优选约4-40、更优选约4-30或4-20 个核酸的长度的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿 嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷 酸(核苷)的类似物；

a是1-20的整数，优选1-15，最优选1-10；

l是1-40的整数，

其中，当l＝1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，

当l＞1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶) 或其类似物；

m是整数且至少为3；

其中，当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，

当m＞3时，存在至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿 嘧啶)类似物；

n是1-40的整数，

其中，当n＝1时，C是胞苷(胞嘧啶)或其类似物，

当n＞1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是胞苷(胞嘧啶) 或其类似物；

u，v可以彼此独立为0-50的整数，

优选地其中，当u＝0时，v≥1，或

当v＝0时，u≥1；

其中本发明式(VI)的核酸分子的长度至少为50个核苷酸，优选至少100 个核苷酸，更优选至少150个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且 最优选至少250个核苷酸。

对于式(VI)，上述关于元件N(即N_u和N_v)和X(X_m)，特别是上文定 义的核心结构，以及关于整数a，l，m，n，u和v给出的任一定义，类似 地相应地适用于式(V)的元件，其中式(VI)中，核心结构由C_lX_mC_n限定。 边缘元件N_u和N_v的定义与上文关于N_u和N_v给出的定义相同。

按照这一实施方案的一个更特别优选的方面，本发明式(V)的核酸分 子可以选自，例如，任一下述序列：

UAGCGAAGCUCUUGGACCUAGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAGAA

GUACACG(SEQ ID NO：359)

UAGCGAAGCUCUUGGACCUAGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUGCGUUCCUAGAA

GUACACGAUCGCUUCGAGAACCUGGAUCCAAAAAAAAAAAAAAACCCACGCAAGGA

UCUUCAUGUGC(SEQ ID NO：360)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAU

AUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAU

UCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGUC

AGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUUAGAUGUUACACU

CUAUUAGAUC(SEQ ID NO：361)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAU

AUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAU

UCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGUC

AGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUUAGAUGUUACACU

CUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUAGUGUUCUUGCUCUAA

GUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUA

GACUGCAGCGUAAGUGCGGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACUGCCUGGAUUAC

CCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGUUGCUGUAUAGGUGACCAACGCCCAC

UCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUAC

UUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUA

G(SEQ ID NO：362)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUGGAGCAAUGCCCGCACAUUGAGGAAACCGAGUUGCAU

AUCUCAGAGUAUUGGCCCCCGUGUAGGUUAUUCUUGACAGACAGUGGAGCUUAU

UCACUCCCAGGAUCCGAGUCGCAUACUACGGUACUGGUGACAGACCUAGGUCGUC

AGUUGACCAGUCCGCCACUAGACGUGAGUCCGUCAAAGCAGUUAGAUGUUACACU

CUAUUAGAUCUCGGAUUACAGCUGGAAGGAGCAGGAGUAGUGUUCUUGCUCUAA

GUACCGAGUGUGCCCAAUACCCGAUCAGCUUAUUAACGAACGGCUCCUCCUCUUA

GACUGCAGCGUAAGUGCGGAAUCUGGGGAUCAAAUUACUGACUGCCUGGAUUAC

CCUCGGACAUAUAACCUUGUAGCACGCUGUUGCUGUAUAGGUGACCAACGCCCAC

UCGAGUAGACCAGCUCUCUUAGUCCGGACAAUGAUAGGAGGCGCGGUCAAUCUAC

UUCUGGCUAGUUAAGAAUAGGCUGCACCGACCUCUAUAAGUAGCGUGUCCUCUA

GAGCUACGCAGGUUCGCAAUAAAAGCGUUGAUUAGUGUGCAUAGAACAGACCUCU

UAUUCGGUGAAACGCCAGAAUGCUAAAUUCCAAUAACUCUUCCCAAAACGCGUAC

GGCCGAAGACGCGCGCUUAUCUUGUGUACGUUCUCGCACAUGGAAGAAUCAGCG

GGCAUGGUGGUAGGGCAAUAGGGGAGCUGGGUAGCAGCGAAAAAGGGCCCCUGC

GCACGUAGCUUCGCUGUUCGUCUGAAACAACCCGGCAUCCGUUGUAGCGAUCCCG

UUAUCAGUGUUAUUCUUGUGCGCACUAAGAUUCAUGGUGUAGUCGACAAUAACA

GCGUCUUGGCAGAUUCUGGUCACGUGCCCUAUGCCCGGGCUUGUGCCUCUCAGG

UGCACAGCGAUACUUAAAGCCUUCAAGGUACUCGACGUGGGUACCGAUUCGUGAC

ACUUCCUAAGAUUAUUCCACUGUGUUAGCCCCGCACCGCCGACCUAAACUGGUCC

AAUGUAUACGCAUUCGCUGAGCGGAUCGAUAAUAAAAGCUUGAAUU(SEQ ID NO：

363)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGU

AUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCU

AUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCC

CCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGA

UGCUGGCCCAGAUC(SEQ ID NO：364)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGU

AUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCU

AUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCC

CCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGA

UGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUAC

AGUUACAGCUGCAGUAG UAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGU

CACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG

GUCUGCUCUA(R 722 SEQ ID NO：365)

GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGU

AUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCU

AUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCC

CCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGA

UGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUAC

AGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGU

CACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAG

GUCUGCUCUAGAACGAACUGACCUGACGCCUGAACUUAUGAGCGUGCGUAUUUU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCUCCCAACAAAUGUCGAUCAAUAGCUGGGCUGU

UGGAGACGCGUCAGCAAAUGCCGUGGCUCCAUAGGACGUGUAGACUUCUAUUUU

UUUUUUUUUUUUUUUUUCCCGGGACCACAAAUAAUAUUCUUGCUUGGUUGGGC

GCAAGGGCCCCGUAUCAGGUCAUAAACGGGUACAUGUUGCACAGGCUCCUUUUU

UUUUUUUUUUUUUUUUUUCGCUGAGUUAUUCCGGUCUCAAAAGACGGCAGACG

UCAGUCGACAACACGGUCUAAAGCAGUGCUACAAUCUGCCGUGUUCGUGUUUUU

UUUUUUUUUUUUUUUGUGAACCUACACGGCGUGCACUGUAGUUCGCAAUUCAU

AGGGUACCGGCUCAGAGUUAUGCCUUGGUUGAAAACUGCCCAGCAUACUUUUUU

UUUUUUUUUUUUUUCAUAUUCCCAUGCUAAGCAAGGGAUGCCGCGAGUCAUGU

UAAGCUUGAAUU(SEQ ID NO：366)

按照另一个更特别优选的实施方案，式(VI)的核酸分子可以选自，例 如，任一下述序列：

UAGCGAAGCUCUUGGACCUACCUUUUUUUUUUUUUUCCCUGCGUUCCUAGAAGU

ACACG(SEQ ID NO：367)

或

UAGCGAAGCUCUUGGACCUACCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUGCGUUCCUAGAAG

UACACGAUCGCUUCGAGAACCUGGAUGGAAAAAAAAAAAAAAAGGGACGCAAGGAU

CUUCAUGUGC(SEQ ID NO：368)

在进一步优选的实施方案中，本文定义的本发明的聚合载体货物复 合物的核酸分子还可以以修饰的核酸的形式存在。

按照另一个方面，本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸 分子可以作为“稳定的核酸”提供，优选作为稳定的RNA或DNA提供， 更优选作为基本上耐受体内降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶) 的RNA提供。

在这一情形中，本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸分 子可以包含主链修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相联系的主链修饰是 这样的修饰，其中本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子中包含的核苷 酸主链的磷酸被化学修饰。与本发明相联系的糖修饰是对本发明的聚合载 体货物复合物的核酸分子的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明相联 系的碱基修饰是对本发明的聚合载体货物复合物的核酸分子的核苷酸碱 基结构部分的化学修饰。

按照另一个方面，本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸 分子可以包含脂质修饰。

本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸还可以采用修饰的 核酸的形式，其中可以将本文定义的任何修饰引入到核酸中。本文定义的 修饰优选地导致进一步稳定的核酸。

按照一个方面，本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸因 此可以作为“稳定的核酸”提供，优选作为稳定的mRNA提供，更优选 作为基本上耐受体内降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶)的RNA 提供。例如，这样的稳定可以通过修饰的磷酸执行，其中所述核酸中包含 的核苷酸的骨架的磷酸被化学修饰。本发明的聚合载体货物复合物的核酸 可以另外或备选地还含有糖或碱基修饰。本发明的聚合载体货物复合物的 核酸，特别是如果作为mRNA提供时，还可以通过添加所谓的“5′帽”结构 而针对RNA酶的降解进行稳定。在这种联系下，特别的偏好性为 m7G(5′)ppp(5′(A，G(5′)ppp(5′)A或G(5′)ppp(5′)G作为“5′帽”结构。按照另 一个方面，本发明的聚合载体货物复合物的核酸可以包含，特别是所述核 酸采用mRNA形式时，在3’端典型包含约10-200个腺苷核苷酸、优选约 10-100个腺苷核苷酸、更优选约20-100个腺苷核苷酸或甚至更优选约 40-80个腺苷核苷酸的多A尾。按照另一个方面，本发明的聚合载体货物 复合物的核酸可以包含，特别是所述核酸采用mRNA形式时，在3’端典 型包含约10-200个胞嘧啶核苷酸、优选约10-100个胞嘧啶核苷酸、更优 选约20-70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选约20-60个或甚至10-40个胞嘧 啶核苷酸的多C尾。按照另一个方面，本发明的聚合载体货物复合物的 核酸可以进行修饰，并且因此被稳定，特别是当所述核酸采用mRNA形 式时，通过改变所述核酸(特别是mRNA，优选其编码区)的G/C含量 进行修饰。

在本发明的特别优选的方面中，本发明的聚合载体货物复合物的核 酸的编码区的G/C含量，特别是当所述核酸采取mRNA的形式时，与其 特定的野生型mRNA(即未修饰的mRNA)编码区的G/C含量相比，被 改变，特别是增加。与特定野生型mRNA的编码氨基酸序列相比，所述 至少一种mRNA的编码氨基酸序列优选不被改变。优选地，与编码本文 定义的抗原、抗原性蛋白或抗原性肽或其片段或其变体的野生型mRNA 编码区的G/C含量相比，本发明的聚合载体货物复合物的核酸的编码区 的G/C含量，特别是当所述核酸采取mRNA的形式时，增加至少7％， 更优选增加至少15％，特别优选增加至少20％。按照特定的实施方案， 在编码本文定义的蛋白或肽或其片段或其变体的区域中至少5％，10％， 20％，30％，40％，50％，60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％ 且最优选至少90％，95％或甚至100％的可取代的密码子或野生型mRNA 的完整序列被取代，由此增加所述序列的GC/含量。在这一情形中，与野 生型序列相比，特别优选的是增加本发明的聚合载体货物复合物的核酸的 G/C含量，特别是当所述核酸采取mRNA的形式时，增加至最大(即， 100％可取代的密码子)，特别是在编码蛋白的区域中。按照本发明，本 发明的聚合载体货物复合物的核酸的更优选的修饰，特别是当所述核酸采 取mRNA的形式时，编码辅助蛋白的区域与野生型mRNA相对应区域相 比被修饰，以使野生型序列编码在细胞中相对稀少的tRNA的至少一个密 码子交换为编码在细胞中相对常见且携带与相对稀少的tRNA相同的氨 基酸的tRNA的密码子。通过这种修饰，所述核酸序列，特别是当所述核 酸采取mRNA的形式时，被改变，以插入关于常见的tRNAs是可用的密 码子。换言之，按照本发明，通过这种修饰，在各种情形中，编码在细胞 中相对稀少的tRNA的野生型序列的所有密码子可以交换为编码在细胞 中相对常见且在每种情形中携带与所述相对稀少的tRNA相同的氨基酸 的tRNA的密码子。

哪些tRNAs在细胞中相对常见，相反，哪些tRNAs相对稀少，对于 本领域技术人员是已知的；例如，参考Akashi，Curr.Opin.Genet.Dev. (现代遗传发育观点)2001，11(6)：660-666。特别优选用于其tRNA是最 常见的特定氨基酸的密码子，例如，Gly密码子，其利用在(人)细胞中 最常见的tRNA。

按照本发明使用的本文定义的核酸分子可以使用本领域已知的任何 方法制备，包括合成方法，诸如例如固相合成，以及体外方法，诸如体外 转录反应或体内反应，诸如DNA质粒在细菌中的体内繁殖。

按照另一个特别优选的实施方案，本发明的聚合载体货物复合物的 核酸，特别是当所述核酸采取编码核酸(优选mRNA)的形式时，可以 另外地或备选地编码分泌信号肽。所述信号肽是这样的序列，其典型地具 有约15-30个氨基酸的长度，且优选位于所编码的肽的N端，但并不限 于此。本文定义的信号肽优选允许将本发明的核酸(特别是当所述核酸采 取mRNA的形式时)编码的蛋白或肽转运到确定的细胞区室中，优选细 胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体区室中。

任一上述修饰可以应用于本发明的聚合载体货物复合物的核酸，特 别是当所述核酸采取mRNA的形式时，并且进一步应用于用在本发明的 情形中的任意核酸，并且如果适当或需要，可以彼此以任何组合来组合， 条件是这些修饰的组合在各自的核酸中彼此不妨碍。本领域技术人员能够 相应地进行选择。

由本文定义的本发明的聚合载体货物复合物的核酸编码的蛋白或 肽，可以包括这些序列的片段或变体。另外，本发明的聚合载体货物复合 物的核酸可以包括这些编码序列的片段或变体。所述片段或变体可以典型 地包括这样的序列，所述序列在核酸水平或在氨基酸水平上与上述蛋白或 肽或它们的编码核酸序列的序列之一具有至少5％，10％，20％，30％， 40％，50％，60％，优选至少70％，更优选至少80％，同样更优选至少 85％，甚至更优选至少90％且最优选至少95％或甚至97％的序列同一 性，或是完整的野生型序列。

在本发明的情形中，蛋白或肽的“片段”可以包括本文定义的蛋白 或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码核酸序列)，与原始(天然) 蛋白的氨基酸序列(或其编码核酸序列)相比，其在N端、C端和/或序 列内部被截短。这样的截短因此可以发生在氨基酸水平或相应地发生在核 酸水平上。关于本文定义的所述片段的序列同一性因此可以优选地涉及本 文定义的完整的蛋白或肽或涉及所述蛋白或肽的完整(编码)核酸序列。 相应地，这适用于核酸。

在本发明的情形中，所述蛋白或肽的片段还可以包括本文定义的蛋 白或肽的序列，其具有约6-约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如， 通过I类MHC分子加工和呈递的片段，优选具有约8-约10个氨基酸的 长度，例如，8，9，或10，(或甚至6，7，11，或12个氨基酸)，或通过 II类MHC分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度， 例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其中 这些片段可以选自氨基酸序列的任意部分。这些片段典型地以由肽片段和 MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以 其天然形式被识别。

本文定义的蛋白或肽的片段还可以包括那些蛋白或肽的表位。在本 发明的情形中，表位(还称为“抗原决定簇”)典型地是位于本文定义的 (天然)蛋白或肽的外表面的片段，优选具有5-15个氨基酸，更优选具 有5-12个氨基酸，甚至更优选具有6-9个氨基酸，其可以被抗体或B细 胞受体识别，即，以其天然形式被识别。所述蛋白或肽的表位还可以选自 本文提及的所述蛋白或肽的任意变体。在这种情形中，抗原决定簇可以是 构象或不连续表位，其由本文定义的蛋白或肽在所述本文定义的蛋白或肽 的氨基酸序列中是不连续的但是在三维结构上聚集在一起的区段组成，或 是连续的或线性表位，其由单一多肽链组成。

本文定义的蛋白或肽的“变体”可以由本发明的聚合载体货物复合 物的核酸编码，其中编码本文定义的蛋白或肽的所述核酸的核苷酸被交 换。由此，可以产生具有在一个或多个突变处不同于原始序列的氨基酸序 列的蛋白或肽，所述一个或多个突变诸如一个或多个置换的、插入的和/ 或缺失的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白相比，这些片段和/或变体具 有相同的生物学功能或特异性活性，例如其特异性抗原性特性。

本发明还提供制备本文定义的式(I)L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L或本文定 义的任意其分式(例如.(Ia)等)的本发明的聚合载体分子的方法。还提供通 过所述本发明的方法获得的或可通过所述本发明的方法获得的产品(通过 方法获得产品)。所述方法优选地包括下述步骤：

a)提供至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽作为本文定义的组分P²和/或至少一种阳离子或聚阳离子聚合物作为本文定义的组分P²，和任选 地至少一种其它组分(例如(AA)_x，[(AA_x)]_z等)，优选地以上述式(I)所示 的比率提供，混合这些组分，优选在本文定义的碱性环境中混合，优选在 存在氧或本文定义的产生轻度氧化条件的其它起始剂的条件下，优选在本 文定义的pH、温度下和时间，并且由此缩合并且因此通过二硫键彼此聚 合这些组分(以聚合缩合或缩聚进行)，从而获得重复组分H-[S-P²-S]_n-H 或H{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}H等；

b)提供本文定义的亲水性聚合物P¹和/或P³，任选地用本文定义的 配体L和/或氨基酸组分(AA)_x修饰；

c)将步骤b)的亲水性聚合物P¹和/或P³与步骤a)获得的重复组分 H-[S-P²-S]_n-H或H{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}H等以约2∶1的比例混合，(并 且由此典型地终止聚合缩合或缩聚反应)并且获得本发明的聚合载体，优 选是本文定义的式(I)或本文定义的任意其分式的本发明的聚合载体；

d)任选地纯化步骤c)获得的本发明的聚合载体，优选使用本文定义 的方法；

e)任选地，将本文定义的核酸添加到步骤c)或d)获得的本发明的聚 合载体中，优选地以上文提及的比例添加，并且将所述核酸与步骤c)或 d)获得的聚合载体复合，从而获得本文定义的本发明的聚合载体货物复 合物。

本文定义的本发明制备本发明式(I)的聚合载体的方法表示通过离析 物的-SH结构部分进行的多步骤的缩合聚合或缩聚反应，所述离析物例 如本文定义的组分P²，其它组分P¹和/或P³和任选地其它组分(AA)_x。缩 合聚合或缩聚反应优选地使得本发明的聚合载体成为缩合聚合物，其中单 一组分通过二硫键连接。这种缩合聚合使得在缩合反应第一步骤a)中制 备的式(I)的本发明的聚合载体、本发明的重复组分H-[S-P²-S]_n-H或其变 体成为本发明的聚合载体的一类“核心”或“中心基序”。在第二步骤 b)中，提供组分P¹和/或P³，其允许通过加入本文定义的组分P¹和/或P³(任选地用本文定义的配体L和/或氨基酸组分(AA)_x修饰)在第三步骤 c)中终止或以某种方式将本发明的重复组分H-[S-P²-S]_n-H或其变体“包 被”到步骤a)获得的缩合产物上。在接着的步骤d)中，可以纯化这种产 物并且进一步用于复合本文定义的核酸货物，从而获得本发明的复合物。

重要的是要理解本发明的方法是基于在步骤a)，b)和c)中的轻微氧 化条件下的平衡反应(equibrility reaction)，当平衡该平衡状态时，所述 方法允许获得上述式(I)或其任意分式的本发明的聚合载体，所述聚合载体 包含需要摩尔比例的所选的组分。为了这一目的，考虑长的反应时间在步 骤a)，b)和c)中获得平衡状态。例如，如果在步骤a)中使用摩尔比率为5 的组分P²进行缩合聚合，在足够的时间后，优选地例如＞12小时，平衡 令人吃惊地在约5的聚合长度时稳定。然而，由于平衡，聚合物长度(如 由n确定)不固定在特定的值，例如5，但是可以在平衡反应内相应地变 化。因此，约5可能意指约4-6，或甚至约3-7。优选地，聚合物长度并 且因此整数n(并且因此a，b和a+b)在约±1，或±2的界限内变化。

如在本发明制备式(I)的本发明的聚合载体的方法的步骤a)中定义， 提供至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽作为本文定义的组分P²和/或 至少一种阳离子或聚阳离子聚合物作为本文定义的组分P²，优选地以上 式(I)所示的比率提供。将这些组分混合，优选在本文定义的碱性环境中混 合，优选在存在氧或本文定义的产生轻度氧化条件的其它起始剂的条件 下，优选在本文定义的pH、温度下和时间，并且由此缩合并且因此通过 二硫键彼此聚合这些组分(以聚合缩合或缩聚进行)，从而获得重复组分 H-[S-P²-S]_n-H。

按照一个备选方案，在本发明制备本发明的聚合载体的方法的步骤 a)中，提供至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽和/或至少一种阳离子或 聚阳离子聚合物并且用作本文定义的组分P²，另外提供本文定义的至少 一种氨基酸组分(AA)_x，并且组分P²和(AA)_x用于步骤a)的聚合缩合或缩 聚。优选地，所述组分均以上述式(Ia)所示的比例提供，混合，优选在本 文定义的碱性环境中混合，优选在存在氧或本文定义的产生轻度氧化条件 的其它起始剂的条件下，优选在本文定义的pH、温度下和时间。当混合 并且起始反应时，所述组分缩合，并且因此彼此通过二硫键聚合(在聚合 缩合或缩聚中)，从而获得重复组分H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H。

在上述两个备选方案中，在上文所示的缩合聚合作用中，可以选择 不同的组分P²，特别是不同的肽和/或不同的聚合物作为组分P²。在这种 情形中，不同组分P²的选择典型地取决于最终的本发明聚合载体的需要 的特性和最终的本发明聚合载体或其中央核心基序的需要的阳离子长度。 因此，在上述步骤a)的备选方案中，重复组分[S-P²-S]_n可以进一步被“稀 释”或修饰，例如，通过引入本文定义的氨基酸组分(AA)_x，优选以上文 定义的比例引入。由此，可以获得修饰的中央核心基序 {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}，其中(未修饰的)重复组分[S-P²-S]_n的阳离子特 征典型地保持在本文定义的限度之内。最终的本发明聚合载体的特性因此 可以按需要通过在步骤a)，b)和/或c)中插入本文定义的氨基酸组分(AA)_x而用组分(AA)_x的特性进行调整。

在所有情形中，步骤a)是基于在轻微氧化条件下的平衡反应，当平 衡该平衡状态时，所述方法允许获得处于所需要的摩尔比例的本发明的重 复组分H-[S-P²-S]_n-H或本发明的重复组分H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H。 在该平衡状态，n优选为1，2，3，4，或5-10，更优选为4-9，且a+b＝ n如上文定义，优选地a+b＝1，2，3，4，或5-10，更优选4-9。为了这 一目的，考虑长的反应时间在步骤a)中获得平衡状态，最优选地，例如＞ 12小时。因此，本发明制备聚合载体的方法的步骤a)典型地需要至少约 5小时，甚至更优选至少约7.5小时或甚至10小时，最优选至少约12小 时，例如，约12-60小时的反应时间，约12-48小时的反应时间，约12-36 小时的反应时间，或约12-24小时的反应时间等，其中后面范围的下限 12小时也可以调整至10、7.5、或甚至5小时。有利地，该平衡状态可以 利用本发明的方法来平衡。

在步骤a)中，作为本文定义的组分P²的至少一种阳离子或聚阳离子 蛋白或肽和/或作为本文定义的组分P²的至少一种阳离子或聚阳离子聚合 物，以及任选地至少一种本文定义的氨基酸组分(AA)_x，在本发明制备式 (I)(或其任意分式，例如(Ia))的本发明的聚合载体的方法的步骤a)中， 优选地包含在碱性环境中。所述碱性环境典型地具有约6至约12的pH 范围，优选约7至约10的pH范围，更优选约8至约10的pH范围，例 如，约8、8.5、9、9.5或10，或选自这些或前述数值中的任意两个数值 的范围。

此外，步骤a)中溶液的温度优选在约5℃至约60℃的范围内，更优 选在约15℃至约40℃的范围内，甚至更优选在约20℃至约30℃的范 围内，并且最优选在约20℃至约25℃的范围内，例如约25℃。

在本发明制备本文定义的式(I)(或其任意分式，例如(Ia))的本发明 的聚合载体的方法的步骤a)中，可以适当使用缓冲液。优选的缓冲液可 以包括，但不限于，碳酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，N-二[羟乙基]甘氨酸 缓冲液，CHES缓冲液，CAPS缓冲液，含乙醇胺的缓冲液，HEPES， MOPS缓冲液，磷酸盐缓冲液，PIPES缓冲液，Tris缓冲液，三(羟甲基) 甲基甘氨酸缓冲液，TAPS缓冲液，和/或TES缓冲液作为缓冲剂。特别 优选的是碳酸盐缓冲液。

当混合所述组分时，优选在存在氧的条件下，优选在存在本文定义 的碱性环境中混合，开始缩合聚合或缩聚反应。为了这一目的，步骤a) 中的混合物优选暴露于氧或可以使用其它起始剂起始，所述起始剂例如催 化量的氧化剂，如DMSO等。为了确定所需要的聚合物链长度，必须在 轻微氧化条件下进行缩合反应，优选在存在少于30％DMSO的条件下， 更优选在存在少于20％DMSO的条件下，最优选在存在少于10％DMSO 的条件下进行。当起始缩合聚合或缩聚反应时，缩合作为组分P²的至少 一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽和/或至少一种阳离子或聚阳离子聚合 物，和任选地至少一种本文定义的氨基酸组分(AA)_x，并且由此通过二硫 键彼此聚合(聚合缩合或缩聚)。在该反应步骤a)中，使用具有至少两 个活性-SH结构部分的单体产生优选为直链的聚合物，所述单体即作为本 文定义的组分P²的至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽和/或至少一种阳 离子或聚阳离子聚合物，每个组分P²例如在其末端具有至少两个本文定 义的游离的-SH结构部分。然而，可以使用具有多于两个游离的-SH结构 部分的组分P²，其可以产生支化的聚合物。

按照另一个具体实施方案，步骤a)获得的缩合产物可以通过添加本 文定义的氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z，例如添加到 步骤a)缩合产物的末端而进行修饰(例如，在步骤a1)中修饰)。这可以 通过本文定义的任意官能性而发生，例如，-SH结构部分或本文所述的 任意其它官能性，优选-SH结构部分。为了这一目的，氨基酸组分(AA)_x 或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以提供有两个(或甚至多个)-SH-结构 部分，例如采用式“H(S-AA-S)_xH”或“H[S-(AA)_x-S]_zH”所示的形式。然后， 可以使用步骤a)的产物，即本发明的重复组分H-[S-P²-S]_n-H或本发明的 重复组分H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H，进行缩聚反应，产生中间组分：

H(S-AA-S)_x-[S-P²-S]_n-(S-AA-S)_xH，或

H[S-(AA)_x-S]_z-[S-P²-S]_n-[S-(AA)_x-S]_zH，或

H(S-AA-S)_x-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-(S-AA-S)_xH，或

H[S-(AA)_x-S]_z-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-[S-(AA)_x-S]_zH。

步骤a)获得的任意单个或所有这些中间组分或本发明的重复组分

H-[S-P²-S]_n-H

或本发明的重复组分

H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H，

可以用于偶联到在本发明方法的步骤b)中提供的聚合物上。

在本发明制备本文定义的式(I)(或其任意分式)的本发明的聚合载 体的方法的第二步骤b)中，向步骤a)中获得的缩合产物中加入本文定义 的亲水聚合物P¹和/或P³。在这一情形中，本发明定义的亲水性聚合物P¹和/或P³优选具有至少一个-SH-结构部分，更优选每个本文定义的亲水性 聚合物P¹和/或P³仅具有一个-SH-结构部分，由此最终在步骤c)中终止步 骤a)的聚合缩合或缩聚反应。本文定义的亲水性聚合物P¹和/或P³可以是 相同的或不同的，其中这些聚合物可以按照所需要的特性进行选择。典型 地，亲水性聚合物P¹和/或P³可以作为整体以约2∶1亲水性聚合物P¹和/或P³∶步骤a)获得的缩合产物的比例添加到步骤a)获得的缩合产物 中。

按照一个备选方案，亲水性聚合物P¹和/或P³另外可以用本文定义 的组分L(配体)或本文定义的组分(AA)_x或[(AA)_x]_z修饰或用本文定义的 组分L(配体)和本文定义的组分(AA)_x或[(AA)_x]_z二者修饰。

按照第一实施例，在步骤b)中提供组分P¹和/或P³前，通过本文定 义的任意官能性，例如-SH结构部分，将配体作为组分L连接到组分P¹和/或P³上。该配体优选在这些聚合物的一个末端连接到亲水性聚合物 P¹和/或P³上。如果所述连接通过-SH键进行，则所述亲水性聚合物P¹ 和/或P³优选提供有两个(或甚至多个)-SH-结构部分，例如，采用由式 HS-P¹-SH或HS-P³-SH表示的形式。配体L优选仅携带一个-SH结构部 分。在这种情形中，在第一步骤中，亲水性聚合物P¹和/或P³的一个-SH 结构部分优选用本领域已知的保护基进行保护。然后，亲水性聚合物P¹和/或P³可以结合到组分L上，从而通过未保护的-SH结构部分形成第一 个二硫键。然后，亲水性聚合物P¹和/或P³的被保护的SH-结构部分典型 地被去保护，用于进一步的反应。这优选地产生下述中间组分：

L-S-S-P¹-SH，或

HS-P³-S-S-L。

备选地，可以在不必要封闭游离的-SH-结构部分而类似地提供上述 中间组分。这些中间组分可以用在步骤c)中，与上述步骤a)获得的缩合 产物偶联，例如用于与步骤a)获得的本发明的重复组分H-[S-P²-S]_n-H或 本发明的混合重复组分H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H或任意其修饰(例如 按照步骤a1))形成第二个二硫键。如果连接是通过其他结构部分进行的， 则可以相应地应用本文定义的任意反应。

按照另一个实施例，本文定义的氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基 酸组分[(AA)_x]_z可以在提供组分P¹和/或P³之前通过本文定义的任意官能 性，例如-SH结构部分，连接到组分P¹和/或P³上。所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以在这些聚合物内的任意位置或在这 些聚合物的一个末端或两个末端连接到亲水性聚合物P¹和/或P³上。在一 个特定的情形中，所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z可以提供为组分P¹和/或P³与上述步骤a)获得的缩合产物之间的接头或 组分P¹和/或P³与其他组分(例如接头L)之间的接头，或按照另一个备 选方案，作为在组分P¹和/或P³的一个末端的终止组分。在任意这些情形 中，连接优选可以通过-SH键进行，其中亲水性聚合物P¹和/或P³优选提 供有两个(或者甚至多个)-SH-结构部分，例如，采用式“HS-P¹-SH”或 “HS-P³-SH”表示的形式，其中优选地，这些-SH结构部分中的一个被保 护，例如，采用式“HS-P¹-S-保护基”或“保护基-S-P³-SH”表示的形式。此 外，氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z还优选地提供有 两个(或者甚至多个)-SH-结构部分，例如，采用式“H(S-AA-S)_x-H”或 “H[S-(AA)_x-S]_zH”表示的形式，其中优选地，这些-SH结构部分中的一个 被保护，例如，采用式“保护基团-(S-AA-S)_x-SH”或“H[S-(AA)_x-S]_z-保护基 团”表示的形式。然后，可以用聚合物“HS-P¹-S-保护基团”或“保护基团 -S-P³-SH”进行缩聚反应，形成中间组分：

“保护基团-S-P¹-S-(S-AA-S)_x-S-保护基团”，

“保护基团-(S-AA-S)_x-S-S-P³-S-保护基团”，

“保护基团-S-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_z-保护基团”，或

“保护基团-[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-S-保护基团”。

然后，任意单一或所有这些中间组分可以用在本发明方法的步骤c) 中，与步骤a)的缩合产物偶联。

为了这一目的，每个中间化合物的至少一个或两个保护基团(基于 最终载体中该组分所需要的方向选择)可以在将它们提供在步骤b)中之 前去保护，形成下述中间组分：

“HS-P¹-S-(S-AA-S)_x-SH”，

“H(S-AA-S)_x-S-S-P³-SH”，

“HS-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_zH”，或

“H[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-SH”。

备选地，可以在不必要封闭游离-SH-结构部分的条件下类似地提供 上述中间组分。然后，任意单一的或所有这些中间组分可以提供在本发明 方法的步骤b)中，与步骤a)的缩合产物偶联。

如果任意前文提及的中间组分提供在步骤b)中，在步骤c)中，该缩 合反应可以通过加入本文定义的具有一个-SH-结构部分的接头组分(例如 L-SH)或任意其他具有单个-SH-结构部分的组分(例如，如本文定义)而 终止。在另一个特定的情形中，所述氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基 酸组分[(AA)_x]_z可以用作在组分P¹和/或P³一个末端的末端组分，而不向 氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基酸组分[(AA)_x]_z添加其他组分。

按照另一个实施例，本文定义的氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基 酸组分[(AA)_x]_z可以在步骤c)之前连接到组分P¹和/或P³上，其中组分P¹和/或P³已经用接头修饰。为了这一目的，组分P¹和/或P³优选携带(至 少)两个本文定义的-SH结构部分，其中缩聚用携带例如一个-SH结构 部分的接头进行。该反应可以通过使用本文定义的保护基团或优选不用保 护基团进行。备选地，除-SH结构部分外的本发明定义的任意其他官能 性可以用于偶联。然后，组分P¹和/或P³的第二-SH结构部分可以用于 通过-SH-结构部分偶联本文定义的氨基酸组分(AA)_x或混合的重复氨基 酸组分[(AA)_x]_z，例如采用式“H(S-AA-S)_x-H”或“H[S-(AA)_x-S]_zH”表示的形 式。该反应优选地形成下述中间化合物：

“L-S-S-P¹-S-(S-AA-S)_x-SH”，

“L-S-S-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_zH”，或

“HS-(S-AA-S)_x-S-S-P³-S-S-L”，或

“HS-[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-S-S-L”；

或者，如果组分L已经不用二硫键连接到下述中间产物上：

“L-P¹-S-(S-AA-S)_x-SH”，

“L-P¹-S-[S-(AA)_x-S]_zH”，或

“HS-(S-AA-S)_x-S-S-P³-L”，或

“HS-[S-(AA)_x-S]_z-S-P³-L”；

在步骤c)中，提供本文定义的亲水性聚合物P¹和/或P³(或步骤b)提供的 任意中间组分)并且与步骤a)获得的重复组分H-[S-P²-S]_n-H、混合的重复 组分H-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-H、或任意中间组分混合，典型地以约2∶1 的比例混合。该反应典型地在上述已经关于a)所述的条件(pH、温度、反 应时间、缓冲液等)下起始和进行。步骤c)允许终止聚合缩合或缩聚反应， 并且获得式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本发明的聚合载体，优选 式(I)的本发明的聚合载体：

L-P¹-S-[S-P²-S]_n-S-P³-L

或式(Ia)的本发明的聚合载体：

L-P¹-S-{[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}-S-P³-L。

按照本发明制备本文定义的式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本 发明的聚合载体的方法的进一步的步骤d)，任选地纯化按照步骤c)获得 的本发明的聚合载体。纯化可以使用层析方法进行，诸如HPLC，FPLC， GPS，透析等。

按照本发明制备本文定义的式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本 发明的聚合载体的方法的最后步骤e)，任选地，将本文定义的核酸添加 到步骤c)或d)获得的本发明的聚合载体上，优选以上文提及的比例添加。 典型地，在本发明的复合物中，如本文定义，通式(I)或(Ia)或本文定义的 任意其分式的聚合载体分子和核酸以聚合载体：核酸约5至10000的摩尔 比率、优选以约5至5000的摩尔比率、更优选地以约5至2500的摩尔比 率、甚至更优选地以约5至1000的摩尔比率而提供，例如，以聚合载体： 核酸约10至10000的摩尔比率、约10至5000的摩尔比率、约25至2500 的摩尔比率、或以约50至1000的摩尔比率提供。N/P比率优选地如上文 所示。

本发明制备式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本发明的聚合载体 的方法特别适于采用所需要的本发明的聚合载体的化学特性，这是由于对 其组分P²，L，(AA)_x，或[(AA)_x]_z的特异性选择，由此避免在体内凝聚和 有毒性。

此外，专业技术人员将不会预计利用上述本发明的方法获得本发明 的聚合载体，因为，由于平衡反应的一般原则，专业技术人员总是预计按 照本发明获得的聚合物导致由单体组分P¹和/或P³侧连的组分P²的单体 内容物，其中连接通过二硫键形成。相反，本发明人令人惊讶地能够表明， 当使用本发明定义的特定比例的聚合物和方法步骤时，特别是在聚合反应 过程中的轻微氧化条件，聚合缩合可以定向发生，在不必要封闭游离-SH- 结构部分的条件下，特异性获得理想的聚合物分布和所需要的平均长度以 及本文定义的通式(I)或(Ia)或任意其分式的所需要的本发明的聚合载体。 这是专业技术人员不能预测到的。

按照另一个实施方案，本发明还提供药物组合物，其包括由本文定 义的核酸货物和通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的聚合载体分子形 成的本发明的聚合载体货物复合物，以及可选的药用载体和/或赋形剂。

作为第一成分，本发明的药物组合物包括由核酸货物和通式(I)或(Ia) 或本文定义的其任意分式的聚合载体分子形成的聚合载体货物复合物。

作为第二成分，本发明的药物组合物可以包括至少一种另外的药物 活性成分。在这种关系中的药物活性成分是具有治愈、改善或预防特定的 适应证、优选癌症疾病、自体免疫疾病、变态反应或传染病的治疗作用的 化合物。所述化合物包括，但不意味限于，肽或蛋白，优选如本文关于编 码核酸所定义的，核酸，优选如本文定义的，(治疗活性的)低分子量有 机或无机化合物(分子量小于5000，优选小于1000)，糖，抗原或抗体， 优选如本文定义，现有技术已知的治疗剂，抗原性细胞，抗原性细胞片段， 细胞级分；细胞壁成分(例如多糖)，修饰的、减毒的或灭活的(例如， 化学或辐照)病原体(病毒、细菌等)，佐剂，优选如本文定义，等等。

此外，本发明的药物组合物可以包括药用载体和/或赋形剂。在本发 明的情形中，药用载体典型地包括本发明的药物组合物的液体或非液体基 础。如果本发明的药物组合物以液体形式提供，则所述载体典型地是无致 热原的水；等渗盐水或缓冲的(水性)溶液，例如，磷酸盐、柠檬酸盐等 缓冲的溶液。特别对于注射本发明的药物组合物，可以使用水或优选缓冲 剂，更优选水性缓冲剂，其含有钠盐，优选至少50mM钠盐，含有钙盐， 优选至少0.01mM钙盐，任选地含有钾盐，优选至少3mM钾盐。按照 优选的实施方案，钠盐、钙盐、和任选的钾盐可以以它们的卤化物形式(例 如氯化物、碘化物或溴化物)、以它们的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、 或硫酸盐等形式存在。不限于此，钠盐的实例包括，例如，NaCl，NaI， NaBr，Na₂CO₃，NaHCO₃，Na₂SO₄，任选的钾盐的实例包括，例如，KCl， KI，KBr，K₂CO₃，KHCO₃，K₂SO₄，钙盐的实例包括，例如，CaCl₂，CaI₂， CaBr₂，CaCO₃，CaSO₄，Ca(OH)₂。此外，缓冲剂中可以包含前文提及的 阳离子的有机阴离子。按照更优选的实施方案，本文定义的适用于注射目 的的缓冲剂可以包含选自下列的盐：氯化钠(NaCl)，氯化钙(CaCl₂)以及 任选的氯化钾(KCl)，其中可以存在除氯化物之外的其他阴离子。CaCl₂也可以被另一种盐替换，如用KCl替换。典型地，注射缓冲剂中的盐以 至少50mM氯化钠(NaCl)，至少3mM氯化钾(KCl)和至少0,01mM氯化 钙(CaCl₂)的浓度存在。与特定的参照介质有关，注射缓冲剂可以是高渗 的、等渗的或低渗的，即，与特定的参照介质有关，所述缓冲剂可以具有 较高、相同或较低的盐含量，其中优选地可以使用前文提及的盐的所述浓 度，其不会由于渗透或其它浓度效应导致细胞的损坏。参照介质例如“体 内”方法中存在的液体，诸如血液、淋巴、细胞溶质液、或其它体液，或 例如在“体外”方法中可以用作参照介质的液体，诸如常见的缓冲液或液 体。所述常见的缓冲液或液体是专业技术人员已知的。特别优选Ringer- 乳酸盐溶液作为液体基础。

按照另一个方面，本发明的药物组合物可以包括佐剂。在这种情形 中，佐剂可以理解为适于起始或增加先天性免疫系统的免疫应答(即非特 异性免疫应答)的任何化合物。换言之，当施用时，本发明的药物组合物 典型地由于任选地其中所包含的佐剂引发先天性免疫应答。所述佐剂可以 选自专业技术人员已知的且适用于本情形的任何佐剂，即所述佐剂支持在 哺乳动物中诱发先天性免疫应答。

本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、 鼻、含服、阴道或通过植入的储器施用。术语肠胃外用在本文中包括皮下、 静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内的、肝内、损伤内、颅内、 经皮、皮内、肺内、腹膜内、贲门内、动脉内、和舌下注射或输注技 术。

本发明的药物组合物可以用于人，并且还可以用于兽医用目的，优 选用于人医学目的，通常作为药物组合物或作为疫苗应用。

按照一个特别优选的方面，本发明的药物组合物(或本发明的聚合载 体货物复合物)可以提供为或用作免疫刺激剂。在这种情形中，本发明的 药物组合物优选如上文定义。更优选地，本发明的聚合载体货物复合物的 核酸，其优选包含在所述药物组合物中，典型地是本文定义的免疫刺激性 核酸，例如，CpG-DNA或免疫刺激性RNA(isRNA)。备选地或另外地， 本发明的聚合载体货物复合物的核酸，其优选包含在所述药物组合物中， 是本文定义的编码核酸，优选cDNA或mRNA，更优选编码优选如本文 定义的辅助蛋白。

在这种情形中，在这一实施方案的特定方面，优选所述辅助蛋白是 聚合载体的组分，优选为(AA)_x组分。

按照甚至更优选的方面，本发明的药物组合物(或本发明的聚合载 体货物复合物)可以提供为或用作佐剂。在这种情形中，所述佐剂优选定 义为上述本发明的药物组合物。更优选地，本发明的聚合载体货物复合物 的核酸，其优选地包含在所述佐剂中，典型地是本文定义的免疫刺激性核 酸，例如，CpG-DNA或免疫刺激性RNA(isRNA)。备选地或另外地，本 发明的聚合载体货物复合物的核酸，其优选包含在所述佐剂中，是本文定 义的编码核酸，优选cDNA或mRNA，更优选编码辅助蛋白，优选如本 文定义。本发明的聚合载体货物复合物，其优选包含在所述佐剂中，典型 地在待治疗的患者中起始先天性免疫应答。所述佐剂可以用在任何附随治 疗中，使用任何已知的疫苗和任意其它(已知的)治疗剂，优选在实施主 治疗之前、同时或随后施用，在施用其它(已知的)疫苗或(已知的)其 它治疗剂之前、同时或随后施用。

本文定义的提供为或用作佐剂的本发明的聚合载体货物复合物或本 发明的药物组合物优选能够引发非抗原特异性的、(先天性)免疫反应(如 由先天性免疫系统提供)，优选以免疫刺激性方式引发。免疫反应通常可 以以多种方式产生。对于适当的免疫应答的重要因素是刺激不同T细胞 亚群。T-淋巴细胞典型地分化为两个亚群，即T-辅助1(Th1)细胞和T- 辅助2(Th2)细胞，通过其免疫系统能够破坏细胞内(Th1)和细胞外(Th2) 病原体(例如抗原)。两种Th细胞群体在它们所产生的效应蛋白(细胞因 子)的模式方面不同。因此，Th1细胞通过激活巨噬细胞和细胞毒性T 细胞而辅助细胞免疫应答。在另一方面，Th2细胞通过刺激B细胞转化 为浆细胞和通过形成抗体(例如，针对抗原的抗体)而促进体液免疫应 答。因此，Th1/Th2比率在免疫应答方面非常重要。与本发明相联系 的，免疫应答的Th1/Th2比率优选被免疫刺激剂替换，即被涉及细胞应答 的本发明的聚合载体货物复合物替换，也就是说，Th1应答，并且由此 主要是细胞应答被诱导。如上文定义，本发明的聚合载体货物复合物本身 发挥非特异性先天性免疫应答的作用，其允许本发明的聚合载体货物复合 物因此用作免疫刺激剂(无需加入另外的药物活性成分)。如果与另一种 药物活性成分(优选特异性免疫原性成分，优选抗原)一起施用，则本发 明的核酸作为支持由所述另一种药物活性成分(例如抗原)引起的特异性 适应性免疫应答的佐剂。

按照另一个特别优选的实施方案，本发明的药物组合物(或本发明的 聚合载体货物复合物)可以提供为或用作疫苗。

如果将RNA或mRNA用作由核酸货物和通式(I)或(Ia)或本文定义的 任意其分式的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物的核酸 分子，则所述本发明的疫苗典型地由本发明的药物组合物组成，并且优选 地支持或引发待治疗的患者的免疫系统的免疫应答，例如，先天性免疫应 答。此外或备选地，本发明的疫苗可以引发适应性免疫应答，优选地，当 由核酸货物和通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的聚合载体分子形成 的本发明的聚合载体货物复合物的核酸编码任意前文提及的抗原或蛋白 时，所述抗原或蛋白引发适应性免疫应答。

在这种情形中，疫苗优选地定义为佐剂或作为上述公开的本发明的 药物组合物。更优选地，本发明的聚合载体货物复合物的核酸，其包含在 所述疫苗中，可以是上述定义的任意核酸，优选是本文定义的免疫刺激性 核酸，例如，CpG-DNA或免疫刺激性RNA(isRNA)。备选地或另外地， 本发明的聚合载体货物复合物的核酸，其优选包含在所述疫苗中，是本文 定义的编码核酸，优选cDNA或mRNA，更优选编码辅助蛋白，优选如 本文定义。备选地或另外地，本发明的聚合载体货物复合物的核酸，其优 选包含在所述疫苗中，是本文定义的编码核酸，优选cDNA或mRNA， 更优选编码抗原，优选如本文定义。此外，特别地，如果本发明的聚合载 体货物复合物的核酸不编码抗原，则本发明的疫苗可以包含抗原，优选如 上文定义，作为由核酸编码的蛋白或肽，或包含抗原性细胞，抗原性细胞 片段，细胞级分；细胞壁成分(例如，多糖)，修饰的、减毒的或灭活的 (例如化学或辐照)病原体(病毒、细菌等)。

按照另一个方面，本发明的疫苗可以包含作为本文定义的本发明的 聚合载体的(AA)_x组分的肽或蛋白抗原，其优选作为重复组分[S-P²-S]_n的 一部分。

本发明的疫苗还可以包括药用载体、佐剂、和/或本文定义用于本发 明的药物组合物的赋形剂。

如果需要，本发明的疫苗可以另外包含一种或多种辅助性物质，从 而增加其免疫原性。由此优选地获得由核酸货物和通式(I)或(Ia)或本文定 义的任意其分式的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物与 辅助性物质的协同作用，所述辅助性物质可以任选地包含在本文定义的本 发明的疫苗中。取决于辅助性物质的各种类型，在这一方面可以考虑多种 机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖，TNF-α或 CD40配体，形成第一类的适合的辅助性物质。通常，可以使用以“危险 信号”形式影响免疫系统的任何试剂(LPS，GP96等)或允许以靶向方式增 强和/或影响免疫应答的细胞因子如GM-CFS作为辅助性物质。特别优选 的辅助性物质是细胞因子，诸如单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子， 其进一步促进先天性免疫应答，诸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6， IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17， IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，IL-22，IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-27， IL-28，IL-29，IL-30，IL-31，IL-32，IL-33，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF， G-CSF，M-CSF，LT-β或TNF-α，生长因子，诸如hGH。

可以包括在本发明的疫苗中的其它添加剂是乳化剂，诸如例如，吐 温；湿润剂，诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；味道赋予剂，药物载 体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。

本发明的疫苗还可以另外或备选地包含任意其它的化合物，其由于 其针对人Toll-样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6， TLR7，TLR8，TLR9，TLR10的结合亲和性(作为配体)或由于其对鼠 Toll-样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7， TLR8，TLR9，TLR10，TLR11，TLR12或TLR13的结合亲和性(作为 配体)而已知是免疫刺激性的。

在这种情形中，可以添加到本发明的疫苗中的另一种类的化合物可 以是CpG核酸，特别是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA 可以是单链CpG-DNA(ss CpG-DNA)，双链CpG-DNA(dsDNA)，单链 CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选 采用CpG-RNA的形式，更优选采用单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)的形式。 CpG核酸优选地包含至少一种或多种(促有丝分裂的)胞嘧啶/鸟嘌呤二 核苷酸序列(CpG基序)。按照第一个优选的备选方案，这些序列中包含的 至少一种CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)，未被甲基 化。这些序列中任选地包含的所有其它胞嘧啶或鸟嘌呤可以被甲基化或未 被甲基化。然而，按照进一步优选的备选方案，CpG基序的C(胞嘧啶) 和G(鸟嘌呤)也可以以甲基化形式存在。

本发明的疫苗还可以另外或备选地包含免疫刺激性RNA，即来源于 免疫刺激性RNA的RNA，其引发或增加(先天性)免疫应答。优选地， 所述RNA可以通常如本文关于RNA所定义的。在这种情形中，这些种 类的可以诱发先天性免疫应答的RNA分子，可以选自例如Toll-样受体 (TLRs)的配体，特别选自呈递和/或编码TLRs的配体的RNA序列，优选 选自人家族成员TLR1-TLR10或鼠家族成员TLR1-TLR13，更优选选 自TLR7和TLR8，关于RNA胞内受体的配体(诸如RIG-I或MDA-5等) (参见例如.Meylan，E.，Tschopp，J.(2006).Toll-like receptors and RNA  helicases：two parallel ways to trigger antiviral responses(Toll样受体和RNA 解旋酶：引发抗病毒反应的两种平行方式).Mol.Cell(分子细胞)22， 561-569)，或任意其它免疫刺激性RNA序列。所述免疫刺激性RNA可 以包括1000-5000，500-5000，5-5000，或5-1000，5-500，5-250， 5-100，5-50或5-30个核苷酸的长度。

本发明还提供通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本发明的聚合 载体分子、由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体 货物复合物、包含其的药物组合物或包含其的试剂盒的一些应用和用途。

按照一个实施方案，本发明涉及通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分 式的本发明的聚合载体分子、由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的 本发明的聚合载体货物复合物、包含其的试剂盒作为药物的第一医学用 途，优选用于基因治疗或治疗本文定义的疾病。药物可以采用药物组合物 的形式或采用作为特定形式的药物组合物的佐剂或疫苗的形式。在本发明 情形中的药物组合物典型地包含通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的 本发明的聚合载体分子或由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本 发明的聚合载体货物复合物，任选地其它成分，例如，如本文关于本发明 的核酸所定义，和任选地药用载体和/或赋形剂，优选如本文定义。

按照一个进一步的实施方案，本发明涉及通式(I)或(Ia)或本文定义的 任意其分式的本发明的聚合载体分子(优选地携带本文定义的核酸货物)、 或由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复 合物用于预防、治疗和/或改善本文定义的疾病的用途。优选地，本文提 及的疾病选自癌症或肿瘤疾病，传染病，优选(病毒、细菌或原生动物) 传染病，自体免疫疾病，变态反应或变应性疾病，单基因疾病(monogenetic  diseases)，即(遗传性)疾病，或一般的遗传病，具有基因遗传背景和典 型地由确定的基因缺陷引起并且按照孟德尔法则遗传的疾病，心血管疾 病，神经元疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病，皮肤疾病，肌骨骼病症， 结缔组织病症，瘤，免疫缺陷，内分泌、营养和代谢疾病，眼病，耳病和 可以受本发明影响的任意疾病。

按照另一个实施方案，本发明涉及通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其 分式的本发明的聚合载体分子、或由核酸货物和本发明的聚合载体分子形 成的本发明的聚合载体货物复合物用于治疗本文定义的疾病的药物的第 二医学用途，优选涉及本发明通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本 发明的聚合载体分子、或由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本发 明的聚合载体货物复合物、包含其的药物组合物或包含其的试剂盒用于制 备用于预防、治疗和/或改善本文定义的多种疾病的药物的用途。

按照一个进一步的实施方案，本发明涉及通式(I)或(Ia)或本文定义的 任意其分式的本发明的聚合载体分子(优选地具有本文定义的核酸货物)、 或由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本发明的聚合载体货物复 合物用于免疫治疗、基因治疗、接种的用途，或其作为佐剂的用途。

按照另一个实施方案，本发明涉及本文定义的疾病的治疗，特别是本 文定义的多种疾病的预防、治疗和/或改善，优选对需要其的患者使用或 施用由核酸货物和通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本发明的聚合 载体分子形成的本发明的聚合载体货物复合物、或本文定义的本发明的药 物组合物或疫苗。

本发明还允许治疗疾病，所述疾病不是遗传的或可以总结在上述种类 中。所述疾病可以包括，例如，对需要特定蛋白因子，例如，上文提及的 特定治疗活性蛋白的患者的治疗。例如，这可以包括透析患者，例如，进 行(常规)肾脏或肾透析的患者，并且所述患者可能需要本文定义的特定 治疗活性蛋白，例如红细胞生成素(EPO)等。

按照最后的实施方案，本发明还提供试剂盒，特别是成套试剂盒，所 述试剂盒包含至少一种通式(I)或(Ia)或本文定义的任意其分式的本发明的 聚合载体分子、至少一种由核酸货物和本发明的聚合载体分子形成的本发 明的聚合载体货物复合物、至少一种本文定义的核酸、至少一种包含其的 药物组合物和/或包含其的试剂盒作为单独的组分或与其它成分组合，以 及任选的具有关于本发明的聚合载体分子、核酸、本发明的聚合载体复合 物、和/或本发明的药物组合物的施用和剂量信息的技术说明书。所述试 剂盒，优选成套试剂盒，可以用于例如任意上文提及的应用或用途。所述 试剂盒，当以成套试剂盒存在时，可以进一步包含在该试剂盒不同部分的 每种组分。

附图

下述附图意欲进一步举例说明本发明。它们不应该由此解释为限制本 发明的主题。

图1：通过非还原条件下的SDS PAGE凝胶电泳图示在反应过程中 形成的产物。凝胶的左侧部分按照染色肽内容物的考马斯方 案染色，右侧部分用染色PEG内容物的氯化钡/碘溶液染色。 如可以容易地观察到的，仅一种包含PEG和肽的产物在目的 质量范围内形成。

图2：显示在用以摩尔比率1∶500与本发明的聚合载体PB19复合 的荧光标记的RNA转染后5分钟L929细胞共聚焦显微镜的 结果。结果，在转染后5分钟，在细胞中一些复合物已经是 可检测的，这表明良好的转染率。

图3：显示在用以摩尔比率1∶500与本发明的聚合载体PB19复合 的荧光标记的RNA转染后1小时L929细胞共聚焦显微镜的 结果。结果，在转染后1小时，大部分颗粒被摄入到细胞中， 这表明良好的转染率。

图4：图示关于所结合的核酸从所述复合物的静电置换的稳定性实 验。可以看出，加入阴离子聚合物肝素不能将RNA从所述复 合物上置换下来，原因在于其仍然在凝胶中迁移。这表明复 合物结合非常强，以致竞争性复合物配偶体不能将RNA从所 述复合物上置换下来。

图5：显示检验复合物结合强度的凝胶移动测定。可以表明，加入 单独的阴离子聚合物肝素或还原剂DTT不能将RNA从具有 本发明的聚合物(PB19)的复合物上置换下来。只有它们一起时 能够将RNA从所述复合物上置换下来(泳道7)。这表示复合 物结合非常强，以致竞争性复合物配偶体和还原剂都不能将 RNA从所述复合物上置换下来。

图6：显示检验复合物结合强度的凝胶移动测定。可以看出，加入 单独的阴离子聚合物肝素不能将RNA从具有本发明的聚合物 (PB22)的复合物上置换下来。相反，mRNA可以容易地被肝 素从PEI复合物上置换下来。

图7：显示在HeLa细胞中萤光素酶编码mRNA SEQ ID NO：369的 表达实验结果。可以看出，编码萤光素酶的mRNA (luc-RNActive)SEQ ID NO：369与PB19聚合物的制剂 (RNA∶PB19摩尔比率为1∶1000，1∶500，1∶100)导致萤光素酶 不依赖于含有血清的培养基的存在的表达。这些结果是出人 意料的，因为含有血清的培养基通常导致转染效率的损失。

图8：显示在HeLa细胞中萤光素酶编码mRNA SEQ ID NO：369的 表达实验结果。可以看出，与以摩尔比率1∶50与RNA组合 的游离肽相比(例如，模板辅助的原位聚合，Rice等)，与摩尔 比率1∶50的非聚乙二醇化的聚合产物PB83w/o PEG(例如， RPC conform)，没有肽组分的PB83聚合(例如二聚体化的 PEG-SS-PEG)和通过聚合反应的含有马来酰亚胺(malimide) 的PEG的终止而合成的PB83衍生物的不可逆PEG化相比， 编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与 PB83聚合物的制剂(RNA∶PB83摩尔比率为1∶50)导致萤光素 酶显著更高的表达。

图9A：显示在皮内注射后在BALB/c小鼠中萤光素酶编码mRNA SEQ ID NO：369的表达实验结果。结果，编码萤光素酶的 mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与PB19聚合物的制剂 导致萤光素酶在雌性BALB/c小鼠真皮中的表达。本领域已知 的其它转染试剂(PEI和Lipofectamine 2000)不表现出萤光素 酶蛋白的任何表达。

图9B：显示在肌内注射后在BALB/c小鼠中萤光素酶编码mRNA  SEQ ID NO：369的表达实验结果。结果，编码萤光素酶的 mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与PB19聚合物的制剂 导致萤光素酶在雌性BALB/c小鼠m.胫骨(m.tibialis)中的表 达。本领域已知的其它转染试剂(PEI和Lipofectamine 2000) 不表现出萤光素酶蛋白的任何表达。

图10：显示在皮内注射编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ  ID NO：369与本发明两种不同的聚合物[PB19和PB48]的不 同制剂后在BALB/c小鼠中萤光素酶的表达。这些编码萤光素 酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与本发明两种不 同的聚合物[PB19和PB48]的制剂导致萤光素酶在雌性 BALB/c小鼠真皮中的表达。由肽RPC CH6R4H6C(未PEG化) 和编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369以 摩尔比率2500∶1形成的聚合载体货物复合物在皮内注射所复 合的mRNA后没有显示出萤光素酶表达。

图11：显示在皮内注射编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ  ID NO：369与本发明三种不同的聚合物[PB124，PB117和 PB83]的不同制剂后在BALB/c小鼠中萤光素酶的表达。这些 制剂全部导致萤光素酶在雌性BALB/c小鼠真皮中的表达。

图12：显示在CHO细胞中萤光素酶编码mRNA SEQ ID NO：369的 表达实验的结果。可以看出，编码萤光素酶的 mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与本发明不同的聚合 物的制剂(RNA∶PB摩尔比率为1∶250)全部在含有血清的培养 基中导致高水平的萤光素酶表达。也可以容易地看出聚合物 中亲水性组分AA_x(在这种情形中，肽CAS₃PS₃AC)的有利 作用。

图13：显示hIL-6细胞因子在hPBMCs中的分泌。可以显示，与由编 码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369和阳离 子肽(H3R9H3)或阳离子肽(H3R9H3)和PEG化阳离子肽组合 (其通常赋予随后对预先形成的核酸缩合物的亲水性包被) 组成的复合物相反，由本发明的聚合物(PB19和PB22)与编码 萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369组成的复 合物不诱导细胞因子在hPBMCs中的分泌。所用的聚合物为：

E9-PEG5k：HO-PEG₅₀₀₀-EEEEEEEEE

E9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-EEEEEEEEE

R9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-RRRRRRRRR

PB19：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB22：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

图14：图示hTNFa细胞因子在hPBMCs中的分泌。可以表明，与由 编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369和阳 离子肽(H3R9H3)组成的复合物或包被有PEG化肽(其通常赋 予随后对预先形成的核酸缩合物的亲水性包被)的所述复合 物相反，由本发明的聚合物(PB19和PB22)与编码萤光素酶的 mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369组成的复合物不诱导细 胞因子在hPBMCs中的分泌。所用的聚合物为：

E9-PEG5k：HO-PEG₅₀₀₀-EEEEEEEEE

E9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-EEEEEEEEE

R9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-RRRRRRRRR

PB19：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB22：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

图15：显示hTNFa细胞因子在hPBMCs中的分泌。可以表明，与由 编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369和本 领域转染试剂如Lipofectamin 2000组成的复合物相反，由编 码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)SEQ ID NO：369与本发 明的聚合物(PB19)组成的复合物不诱导hTNFa在hPBMCs中 的分泌。

图16：显示在mRNA构建体pCV19-Pp luc(GC)-muag-A70-C30中编 码萤火虫(Photinuspyralis)萤光素酶的mRNA序列(SEQ ID  NO：369)；其具有1857个核苷酸的长度。所述mRNA序列含 有下述序列元件：

●编码萤火虫萤光素酶的编码序列；

●来源于α-珠蛋白-3’-UTR的稳定序列(muag(突变的α-珠 蛋白-3’-UTR))；

●在3’-末端的70×腺苷(多-A-尾)；

●在3’-末端的30×胞嘧啶(多-C-尾)。

ORF以斜体字母表示，muag(突变的α-珠蛋白-3’-UTR以虚线表示， 多-A-尾以单下划线表示，多-C-尾以双下划线表示。

实施例

下述实施例意欲进一步举例说明本发明。因此，它们不将限制本发 明的主题。

1.制备编码Pp萤光素酶(萤火虫(Photinus pyralis))的DNA和mRNA构建体

对于本实施例，制备编码萤火虫萤光素酶的DNA序列，并且用于后 续的体外转录反应。

按照第一制备方案，制备称为pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30序列 的DNA序列，其对应于萤火虫萤光素酶编码序列。通过修饰野生型萤火 虫萤光素酶编码DNA序列而制备构建体：通过引入GC-最优化的序列用 于更好的密码子应用和稳定，引入来源于α-珠蛋白-3’-UTR的稳定序列 (muag(突变的α-珠蛋白-3’-UTR))，在3’-末端引入70×腺苷的片段(多 -A-尾)并且在3’-末端引入30×胞嘧啶的片段(多-C-尾)，产生SEQ ID  NO：369(参见图16)。最终的DNA构建体的序列具有1857个核苷酸的长 度，并且称为“pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30”。在SEQ ID NO：369(参 见图16)中，显示了相对应的mRNA序列。

该序列包含下述序列元件：

●编码萤火虫萤光素酶的编码序列；

●来源于α-珠蛋白-3’-UTR的稳定序列(muag(突变的α-珠 蛋白-3’-UTR))；

●在3’-末端的70×腺苷(多-A-尾)；

●在3’-末端的30×胞嘧啶(多-C-尾)。

2.体外转录：

在体外用T7-聚合酶转录实施例1制备的各个DNA质粒。随后，使 用PureMessenger(CureVac，Tübingen，德国)纯化mRNA。

3.试剂：

肽：本实验中所用的肽如下：

PB19：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH (聚乙二醇化的CH₃R₄H₃C肽聚合物)

PB22：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH (聚乙二醇化的CH₆R₄H₆C肽聚合物)

PB48：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₃-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB83：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)₇-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB86：

HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)₅(S-CAS3PS3AC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB117 HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHKKKKKKHC-S-)₇-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB124 HO-PEG₂₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)₇-S-PEG₂₀₀₀-OH

PB83在配制前新鲜溶解在水中的游离的肽HS-(CHHHHHHRRRRHHHHHHC)-SH

PB83 w/o肽PEG-SS-PEG

PB83 w/o PEG HS-(CHHHHHHRRRRHHHHHHC)_n-SH

PB83malPEG PEG-mal-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)_x-mal-PEG

H3R9H3：HHHRRRRRRRRRHHH

CH6R4H6C：H-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-H

所用的其它转染试剂为：

Lipofectamine 2000(Invitrogen)

PEI 25kDa(支化的)(Aldrich)

4.合成本发明的聚合载体：

缩合反应进行如下：使用计算量的肽(组分P²)，其溶解在pH 8,5的 缓冲的水性溶液的混合物中，其中任选地添加5％(v/v)二甲亚砜(DMSO) (其是轻微的氧化条件，并且因此允许建立平衡)，并且在环境温度下搅 动18小时。然后，加入计算量的含有硫醇基团的PEG衍生物(α-甲氧基-ω- 巯基聚(乙二醇))(组分P¹)(溶解在水中)，并且将得到的溶液再搅动18小 时。随后冷冻干燥并纯化产生所需要的聚合物。PEG组分P¹与肽组分P²之间的比率限定了P²聚合物的链长度。

在这种反应环境下的缩合反应是可逆的，因此聚合物的链长度由终 止聚合反应的单硫醇化合物的量所决定。总之，聚合物链的长度由寡肽和 单硫醇组分的比率决定。该反应得到所选的轻微氧化条件的支持。使用更 严格的氧化条件(30％DMSO)，诱导产生高分子(长链)聚合物。

4.1.1.步骤：示例性的聚合反应：

n HS-CHHHRRRHHHC-SH→H-(S-CHHHRRRRHHHC-S)_n-H

4.2.2.步骤：示例性的终止反应：

H-(S-CHHHRRRRHH HC-S)_n-H+2PEG-SH→PEG-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)_n-S-PEG

4.3.示例性的合成反应：

步骤1)

5×HS-CHHHRRRHHHC-SH→H-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-H

步骤2)

H-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-H+2×PEG₅₀₀₀-SH→PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀

为了获得聚合物长度5(n＝5)，使用肽∶PEG为5∶2的摩尔比率。

进行合成反应的一些变化，以显示PEG链的作用和PEG链的可逆连 接的作用。

4.4.对于无PEG链的聚合载体的合成反应：

反应条件与上述相同，但是不进行/省略添加含有巯基的PEG衍生物 的步骤。

4.5.关于可逆连接的PEG链的合成反应：

反应条件与上述相同，但是使用含有马来酰亚胺的PEG衍生物替代 含有巯基的PEG衍生物。马来酰亚胺结构部分迅速与游离的巯基基团反 应形成共价键。因此，聚合的终止不是在如同关于含有巯基的PEG衍生 物的动力学平衡条件下，而是在不可逆的条件下，其导致高多样性的“冷 冻”聚合模式，并且不是动力学平衡反应的确定的反应产物。

5.RNA的复合：

将上述实施例1中定义并且按照实施例2制备的mRNA构建体与聚 合物(优选如实施例4中所定义的)复合用于本发明的目的。因此，将4 μg SEQ ID NO：85的编码萤光素酶的RNA  pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30(Luc-RNActive)以所示的摩尔比率与本 发明的聚合载体(式I)或对照混合，由此形成复合物。然后，用水将得 到的溶液调整至50μl终体积，并且在室温下温育30分钟。

本实验中所用的不同的本发明的聚合载体和聚合载体/RNA的不同 比例显示在表1中。

比率＝RNA∶肽的摩尔比率

阳离子AS＝阳离子氨基酸，其在生理pH下带正电荷(即，不是组 氨酸(H)，而是例如精氨酸(R))

然而，PB83和PB86具有在尺寸上是PB19两倍的阳 离子插入物，因此具有两倍多的阳离子氨基酸残基。 与PB19相比，PB48具有较短的阳离子插入物，因此 每分子聚合物具有较少的阳离子氨基酸残基。

N/P＝是聚合载体中碱性氮原子与核酸中磷酸残基的比率， 认为氮原子赋予正电荷，核酸的磷酸骨架的磷酸赋予 负电荷。组氨酸残基计算为中性，因为复合物形式在 生理pH下进行，因此咪唑残基不带电荷。

N/P通过下式计算：

为了计算编码萤光素酶的RNA，使用SEQ ID NO：369 的pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30(Luc-RNActive)， 其具有660kDa的分子量。因此，1μg SEQ ID NO：369 的pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30RNA等于1.67 pmol SEQ ID NO：369的 pCV19-Ppluc(GC)-muag-A70-C30 RNA。

6.大小和ζ电位测量：

使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments，Malvern，UK)，按照Malvern 分布的SOPs，通过动态光散射测量上述制备的人工合成多聚体 (polyplexes)的流体动力学直径。测量在25℃在通过累积量方法 (cumulant method)分析的专门的缓冲剂中进行，从而获得该人工合成多 聚体的流体动力学直径和多样性指数。

该人工合成多聚体的ζ电位使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments， Malvern，UK)用激光多普勒电泳法进行评估。测量在25℃进行，并且使 用173°的散射角。

7.凝胶移动测定

此外，用所示的聚合物配制编码萤光素酶的mRNA(Luc-RNActive) SEQ ID NO：369，并且将等分试样用肝素(100μg)或二硫苏糖醇(DTT)在 37℃温育15分钟。然后在琼脂糖凝胶上进行电泳，通过溴化乙锭染色显 现核酸。

8.共聚焦激光扫描显微镜检

在倒置的LSM510激光扫描显微镜(Carl Zeiss，德国)上使用 Plan-Apochromat 63x/1.4 N.A.透镜进行共聚焦激光扫描显微镜检。所有的 分析使用在8孔分室盖玻片(Nunc，德国)中生长的活的、未固定的细胞进 行。为了检测Alexa Fluor 647标记的mRNA，仅使用633-nm氦氖激光器 的光，其被导向与LP 650长通滤波器(LP 650 long pass filter)结合的 UV/488/543/633分光器。活细胞显微镜检在室温下进行。

为了这一目的，在转染前1天，将L929细胞(25x10³/孔)接种在24 孔微量滴定板中，产生70％汇合，此时进行转染。在8室孔载玻片中用 含有2μg Alexa Fluor 647标记的mRNA的制剂转染细胞，然后直接进行 显微镜检实验。

8.在hPBMC中进行细胞因子刺激

用Ficoll梯度分离来自健康供体外周血的HPBMC细胞，并随后用 1×PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤。然后，将细胞接种在96-孔微量滴定板中 (200x10³/孔)。将hPBMC细胞在X-VIVO 15培养基(Bio Whittaker)中用10 μl RNA/载体复合物温育24小时。使用SEQ ID NO：369作为RNA。载体 如上文通式(I)所示。对hPBMC细胞的免疫刺激性作用通过检测细胞因子 的产生(白介素-6；肿瘤坏死因子α，干扰素α)而测量。因此，将ELISA 微量滴定板(Nunc Maxisorb)用结合缓冲液(0,02％ NaN₃，15mM Na₂CO₃， 15mM NaHCO₃，pH 9,7)温育过夜(o/n)，所述结合缓冲液另外含有特定的 细胞因子抗体。然后，将细胞用含有1％BSA(牛血清白蛋白)的1×PBS 封闭。加入细胞上清，并且在37℃温育4小时。随后，将该微量滴定板 用含有0.05％吐温-20的1×PBS洗涤，并且然后用生物素标记的二级抗体 (BD Pharmingen，Heidelberg，德国)温育。向该板中加入链霉抗生物素蛋 白-偶联的辣根过氧化物酶。然后，将板再次用含有0,05％吐温-20的1×PBS 洗涤，并且加入ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸 (2，2′-azino-bis(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid))作为底物。使用 Tecan的Sunrise ELISA-读数仪(Crailsheim，德国)，利用用重组细胞因子 获得的标准曲线(BD Pharmingen，Heidelberg，德国)，通过测量在405nm (OD 405)的吸光度而测量细胞因子的量。

9.转染HeLa细胞：

将4μg SEQ ID NO：85的RNA稳定的萤光素酶mRNA (Luc-RNActive)按所示的摩尔比率与各种聚合物(式I)混合，由此形成 复合物。然后，用水将得到的溶液调整至50μl的终体积，并且在室温下 温育30分钟。所用的比率显示在上述表1中。

在转染前1天，将Hela-细胞(150x10³/孔)接种在24孔微量滴定板中， 产生70％汇合，此时进行转染。对于转染，将50μl RNA/载体复合物溶 液与250μl不含血清或含有FCS的培养基混合(如在所提供的表格中所 示)，并且添加到细胞中(最终RNA浓度：13μg/ml)。在加入不含血清 的转染溶液之前，将HeLa-细胞每孔用1ml Optimen(Invitrogen)轻轻仔细 洗涤两次。然后，向细胞中加入转染溶液(每孔300μl)，然后将细胞在37℃ 温育4小时。随后，每孔加入300μl含有10％FCS的RPMI-培养基 (Camprex)，并且将细胞在37℃再温育20小时。转染后24小时，将转染 溶液吸出，并且将细胞在300μl裂解缓冲液(25mM Tris-PO₄，2mM  EDTA，10％甘油，1％Triton-X 100，2mM DTT)中裂解。然后，将上清 与萤光素缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，15mM MgSO₄，5mM ATP，62,5 μM萤光素)混合，并且使用光度计(Lumat LB 9507(Berthold Technologies， Bad Wildbad，德国))检测发光。

10.萤光素酶的体内表达：

将10μg SEQ ID NO：369的编码萤光素酶的mRNA(Luc-RNActive) 以1∶250的摩尔比率(RNA∶聚合载体)与各种载体(式I)混合，由此形成 复合物。然后，用Ringer乳酸盐溶液将得到的溶液调整至100μl的终体 积，并且在室温下温育30分钟，产生复合的RNA浓度为0,1g/l的溶液。

对7周龄的BALB/c小鼠皮内(耳翼或背部)或肌内(m.胫骨)施用 100μl(20μl)的该溶液。24小时后，将小鼠处死，并且收集样品(耳、背 部皮肤或肌肉)，冷冻在-78℃，并且在组织裂解器(Qiagen，Hilden，德国) 中全速裂解3分钟。然后，加入600μl裂解缓冲液，并且将得到的溶液 在组织裂解器中再全速进行6分钟。在4℃以13500rpm离心10分钟后， 将上清与萤光素缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，15mM MgSO4，5mM  ATP，62,5μM萤光素)混合，并且用光度计(Lumat LB 9507(Berthold  Technologies，Bad Wildbad，德国))检测发光。

11.结果：

11.1.DLS/Zetasizer确定：

本发明的聚合载体货物复合物的大小和ζ-电位通过动态光散射(DLS) 和激光-多普勒电泳一式三份进行评估，并且与本领域中已知的不同的聚 合载体货物复合物进行比较。表1总结了聚合载体货物复合物的累积量直 径和ζ-电位。

由本发明的聚合物和编码萤光素酶的mRNA(Luc-RNActive)SEQ ID  NO：369形成的聚合载体货物复合物的累积量直径表明，形成小的、均一 的复合物。这些复合物在含盐缓冲液中对凝聚是稳定的，并且在大小上小 于100nm。相反，按照RPC方法的聚合载体货物复合物在含盐缓冲液中 不稳定，形成大的聚集物。本发明的聚合载体货物复合物还形成低ζ-电位 的复合物，其与低的结合血清成分的倾向性相关，并且因此具有低的调理 作用的倾向性。

11.2.共聚焦显微镜检：

用与本发明的聚合物PB19复合的AlexaFlour647氨基烯丙基-标记的 RNA转染L929细胞在5分钟后已经在细胞中产生可检测的复合物。结果 显示在图2和3中。从图2可以看出，在用以1∶500的摩尔比率与本发 明的聚合物PB19复合的荧光标记的RNA(SEQ ID NO：369)转染后5分 钟，L929细胞的共聚焦显微镜检表明，在转染后5分钟，一些复合物在 细胞中已经是可检测的。1小时后，在用以1∶500的摩尔比率与本发明 的聚合物PB19复合的荧光标记的RNA转染后1小时，L929细胞的共聚 焦显微镜检揭示，在转染后，大部分颗粒被摄入到细胞中(见图3)。

11.3.对静电置换的稳定性：

由于本发明的复合物，特别是式(I)的聚合物关于它们的组成和它们 的表面电荷是独特的，在凝胶移动测定中可以观察到出人意料的结果。通 常，确定聚合物是否缩合所述核酸，并且因此防止所述核酸在电场中移动。 如果加入复合物配偶体，所述配偶体表现出较所述核酸对所述阳离子聚合 物更强的亲和性，则核酸被从复合物上置换下来，并且又可以在电场中迁 移。为了这一目的，可以使用PEI，已知其表现出与核酸极强的复合物。

在检验复合物结合强度的凝胶移动测定中(见图4)，可以显示，加 入阴离子聚合物肝素不能将RNA从本发明的聚合载体货物复合物上置换 下来，原因在于其仍然在凝胶中迁移。这表明，复合物结合非常强，以致 竞争性复合物配偶体不能将RNA从本发明的聚合载体货物复合物上置换 下来。

在检验复合物结合强度的另一个凝胶移动测定中(见图5)，可以显 示，加入单独的阴离子聚合物肝素或还原剂DTT不能将RNA从具有本 发明的聚合物(PB19)的本发明的聚合载体货物复合物上置换下来。只有它 们一起时能够将RNA从所述复合物上置换下来(泳道7)。这表示复合物 结合非常强，以致竞争性复合物配偶体和还原剂都不能将RNA从本发明 的聚合载体货物复合物上置换下来。

与PEI复合物相反，当加入肝素时，RNA不从本发明的聚合载体货 物复合物释放。只有肝素和DTT的组合释放RNA。注意到，DTT还原二 硫键，并且因此破坏缀合物。这模拟体内条件，其中细胞中的还原条件将 RNA从复合物释放出来。

与其相比较，使用PEI复合物的凝胶移动测定来检验复合物结合强 度，表明加入单独的阴离子聚合物肝素不能将RNA从具有按照本发明所 用的聚合物(PB22)的复合物上置换下来。相反，mRNA可以容易地被肝 素从PEI复合物上置换下来(见图6)。

11.4.在HeLa细胞中萤光素酶的表达：

使用本文式(I)的聚合物和SEQ ID NO：369的mRNA的复合物(编码 萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)与PB19载体(RNA∶PB19的摩尔比率为 1∶1000，1∶500，1∶100))确定萤光素酶在HeLa细胞中的表达。这些编码 萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)与PB19载体的制剂(RNA∶PB19的摩尔 比例为1∶1000，1∶500，1∶100)导致不依赖于含血清的培养基的存在的萤光 素酶表达。这些结果是出人意料的，因为含有血清的培养基通常导致转染 效率的损失。

11.5.体内萤光素酶表达：

在皮内注射后，确定萤光素酶在BALB/c小鼠中的表达。从图9a中 可以看出，编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)(SEQ ID NO：369)与 PB19聚合物的制剂导致萤光素酶在雌性BALB/c小鼠真皮中的表达。本 领域已知的其它转染试剂(PEI和Lipofectamine 2000)不表现出萤光素酶蛋 白的任何表达。

此外，确定在肌内注射后在BALB/c小鼠中萤光素酶的表达。结果(见 图9b)，编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)(SEQ ID NO：369)与PB19 聚合物的制剂导致萤光素酶在雌性BALB/c小鼠m.胫骨(m.tibialis)中的表 达。本领域已知的其它转染试剂(PEI和Lipofectamine 2000)不表现出萤光 素酶蛋白的任何表达。

另外，确定皮内注射不同制剂后萤光素酶在BALB/c小鼠中的表达。 结果(见图10)，编码萤光素酶的mRNA(luc-RNActive)(SEQ ID NO：369) 与本发明两种不同的聚合物(聚合物PB19和PB48)的制剂导致萤光素 酶在雌性BALB/c小鼠真皮中的表达。由肽RPC CH6R4H6C(未PEG化) 和RNA以摩尔比率2500∶1形成的聚合载体货物复合物在皮内注射所复合 的RNA后没有显示出萤光素酶表达。

11.6在hPBMC中的细胞因子刺激

测量细胞因子刺激，特别是hPBMCs中的hIL-6细胞因子的分泌。结 果(见图13)，可以显示，与由RNA(SEQ ID NO：369)和阳离子肽(H₃R₉H₃) 或阳离子肽(H₃R₉H₃)和PEG化肽(E9或R9)组合(其通常赋予随后对预 先形成的核酸缩合物的亲水性包被)组成的复合物相反，由RNA(SEQ ID  NO：369)和本发明的聚合物(PB19和PB22)组成的本发明的复合物不诱导 hIL-6在hPBMCs中的分泌。

E9-PEG5k：HO-PEG₅₀₀₀-EEEEEEEEE

E9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-EEEEEEEEE

R9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-RRRRRRRRR

PB19：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB22：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

此外，测量hTNFα细胞因子在hPBMCs中的分泌。结果表明(见图 14)，与由RNA(SEQ ID NO：369)和阳离子肽(H₃R₉H₃)组成的复合物或包 被有PEG化肽(E9或R9)(其通常赋予随后对预先形成的核酸缩合物的 亲水性包被)的所述复合物相反，由RNA(SEQ ID NO：369)与本发明的 聚合物(PB19和PB22)组成的本发明的复合物不诱导hTNFα在hPBMCs 中的分泌。

E9-PEG5k：HO-PEG₅₀₀₀-EEEEEEEEE

E9-PEG3K：HO-PEG₃₀₀₀-EEEEEEEEE

R9-PEG3k：HO-PEG₃₀₀₀-RRRRRRRRR

PB19：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHRRRRHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

PB22：HO-PEG₅₀₀₀-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S)₅-S-PEG₅₀₀₀-OH

此外，通过将由RNA(SEQ ID NO：369)和本发明的聚合物(PB19)组 成的本发明的复合物的细胞因子刺激特性与本领域的转染试剂如 Lipofectamin 2000或PEI比较，确定hPBMCs中的hIFNa细胞因子分泌。 结果，与Lipofectamin 2000和PEI的两种复合导致大量的hIFNa分泌， 而由RNA(SEQ ID NO：369)和本发明的聚合物(PB19 500)组成的本发明 的复合物没有导致这样的hIFNa分泌。

此外，通过将由RNA(SEQ ID NO：369)和本发明的聚合物(PB19)组 成的本发明的复合物的细胞因子刺激特性与本领域的转染试剂如 Lipofectamin 2000或PEI比较，测量hPBMCs中的hTNFα细胞因子分泌。 结果(见图15)，与Lipofectamin 2000的复合导致大量的hTNFα分泌，而 与PEI或本发明的聚合物(PB19 500)复合没有导致这样的hTNFα分泌。