一种通过微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法

摘要

本发明公开了一种利用微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法，其包括步骤：将细菌、霉菌和酵母菌制成菌悬液或孢子悬浮液，接种于种子培养基中制成种子液，再将种子液接种于发酵培养基中培养，生长好后投入黄芪总皂苷进行转化，TLC扫描分析其他黄芪皂苷转化为黄芪甲苷，使黄芪甲苷的量提高3倍以上，转化液通过有机溶剂萃取和大孔树脂分离纯化得到黄芪甲苷纯品。本发明方法能克服化学法水解黄芪总皂苷存在的对皂苷破坏达、污染严重、目的性差等缺点，以及酶法水解黄芪总皂苷过程中酶不稳定性问题。具有无污染、专一性强、转化率高的优点，制备的黄芪甲苷纯度可达99.9%以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物转化制备黄芪甲苷的方法，尤其是一种利用含有去乙酰酶和糖苷酶的微生物水解黄芪总皂苷中的乙酰基和糖基，以提高黄芪甲苷含量的微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法。

背景技术

黄芪（Radix Astragali）是常用中药之一，是豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge和蒙古黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bunge var. mongholicus (Bunge)P. K. Hsiao的干燥根。黄芪甲苷（Astragalosides Ⅳ，ASI）是从黄芪中分离得到的一种具有多种药理活性的皂苷类化合物，为黄芪制剂质量鉴定的指标成分。研究显示了黄芪甲苷在心血管、免疫、神经、消化、泌尿、循环和内分泌系统等均具有广泛的药理作用，据报道，黄芪甲苷能减轻脑缺血再灌注引起的血脑屏障渗透性增加；对缺血性脑损伤具有保护作用；通过调节癌基因的表达发挥抗癌活性；对糖尿病小鼠具有降血糖作用；具有强的抗乙肝病毒活性；能有效的抑制或逆转PS诱导的小鼠模型的肝纤维化；其中药制剂被开发为心肌保护剂用于冠心病心绞痛的治疗。但实践显示，黄芪甲苷在黄芪中含量极低，并且受产地和季节影响较大，一般约为0.04%，提取分离困难。

黄芪总皂苷（Astragalosides, AST）是黄芪的主要有效成分，占黄芪干重的2-3%。AST为一系列环阿尔庭烷型三萜苷，其化学结构如下图：

 R1R2R3astragaloside IVβ-D-xylpβ-D-glcpHastragaloside Iβ-D-xylp(2’3’-di-OAc)β-D-glcpHastragaloside IIβ-D-xylp(2’-OAc)β-D-glcpHastragaloside VIβ-D-xylp-2’-β-D-glcp β-D-glcpHastragaloside VIIβ-D-xylpβ-D-glcpβ-D-glcpAcetylastragaloside Iβ-D-xylp(2’3’4'-tri-OAc) β-D-glcpHisoastragaloside Iβ-D-xylp(2'4'-di-OAc) β-D-glcpHisoastragaloside IIβ-D-xylp(3’-OAc)β-D-glcpHagroastragaloside IIIβ-D-xylp(2’3’-di-OAc)β-D-glcpHagroastragaloside IVβ-D-xylp(2’-OAc) β-D-glcpβ-D-glcpCycloglobiceposide Aβ-D-xylp(2’-OAc) β-D-glcp(6’-OAc)H

不同黄芪皂苷结构差别主要在于3-，6-和25-位的糖基种类和数量的不同，黄芪甲苷即其中的黄芪皂苷Ⅳ。从结构上分析其他黄芪皂苷水解去掉多余的乙酰基或糖基均可转化为黄芪甲苷。目前主要采用化学法和酶法对黄芪总皂苷进行水解以提高黄芪甲苷的含量，增加从中药材中提取黄芪甲苷的提取率。

如何提高黄芪甲苷的含量正引起有关研究者的关注。

发明内容

    本发明的目的是为解决现有技术中存在的黄芪甲苷含量低、分离提取困难的技术问题，提供一种通过微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法，尤其是利用微生物转化黄芪总皂苷中其他皂苷为黄芪甲苷，并且从微生物发酵液中分离纯化黄芪甲苷的方法。

本发明方法能提高黄芪甲苷含量，为解决黄芪甲苷的来源，进一步开发利用中药黄芪奠定基础。

具体而言，本发明的通过微生物转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷的方法，其特征在于，其包括步骤：

将微生物菌种制成菌悬液或孢子悬浮液，接种于种子培养基中，28℃、220 rpm培养24~48 h即得种子液，再将种子液接种于发酵培养基中，28℃、220 rpm培养24~48 h，投入黄芪总皂苷，相同条件下转化48~96 h，得转化液；TLC扫描分析其他黄芪皂苷转化为黄芪甲苷，使黄芪甲苷的量提高3倍以上。

本发明中，获得的转化液，可以通过有机溶剂萃取和大孔树脂分离纯化黄芪甲苷，最优的纯化手段是先采用乙醇浸泡，再用正丁醇提取，所得浸膏再采用D101大孔树脂分离纯化，经乙酸乙酯萃取后得到黄芪甲苷纯品。本发明的实施例中，将上述发酵液用95%工业乙醇浸泡过夜，离心过滤除去菌体和沉淀，旋转蒸发至无乙醇味，用正丁醇萃取两次。合并有机层，旋干，正丁醇回收。所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀。滤液旋干后，用D101大孔树脂分离纯化，首先用蒸馏水预洗除糖，再用2%KOH水溶液洗去大量色素，然后依次用19% 乙醇、23.75% 乙醇、47.5% 乙醇和 57% 乙醇洗脱，TLC跟踪检测，合并含黄芪甲苷组分并旋转蒸发，至无乙醇，剩余液体用乙酸乙酯萃取一次，旋干水层中残存的乙酸乙酯后即有白色沉淀析出，10000 r/min离心10 min，得黄芪甲苷纯品，回收率达82%以上，黄芪甲苷色谱纯度达99.9%。

本发明中，所述的微生物选自细菌、霉菌或酵母菌；本发明的实施例中优选伞枝犁头霉（Absidia corymbifera，购自上海市工业微生物研究所）。

    本发明中，所述的微生物转化黄芪甲苷主要通过利用含有去乙酰酶和糖苷酶的微生物水解黄芪总皂苷中的乙酰基和糖基，提高黄芪甲苷含量。

本发明中，所述的黄芪总皂苷，其成分包括全部或部分黄芪皂苷单体，如astragalosideⅠ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ，isoastragalosideⅠ、Ⅱ，acetylastragalosideⅠ，agroastragalosideⅢ、Ⅳ，Cycloglobiceposide A等。

本发明的特点是应用微生物转化方法，将黄芪总皂苷中其他黄芪皂苷转化为黄芪甲苷，所述的微生物转化中，利用微生物代谢过程中产生的酶催化底物进行化学反应，因其区域和立体选择性强、可同时进行多步酶促反应、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少而适于工业生产。本方法可以克服化学法水解黄芪总皂苷存在的对皂苷破坏达、污染严重、目的性差等缺点，以及酶法水解黄芪总皂苷过程中酶不稳定性问题。具有无污染、专一性强、转化率高的优点，制备的黄芪甲苷纯度可达99.9%以上。

本发明为了检验所制得的黄芪甲苷的实用性，采用乙醇和丙二醇作为非水溶剂和助溶剂将所述的的黄芪甲苷制成1 mg/mL规格为2 mL的黄芪甲苷注射液。    

所述的注射液中优选组分为：由乙醇和丙二醇作为非水溶剂和助溶剂，黄芪甲苷1 g、乙醇200 mL、丙二醇200 mL、葡萄糖100 g、补足注射用水至1000 mL。  

本发明制得的黄芪甲苷，还可以制成药学上可接受的制剂，如片剂、注射用、栓剂、外用制剂等。可以用于心血管疾病、脑血管疾病、抗癌、抗病毒、糖尿病等的治疗。

本发明提供了所述的的黄芪甲苷注射液在心脑血管疾病、抗病毒及糖尿病等方面的治疗用途。尤其用于病毒性心肌炎的治疗。

附图说明

图1是本发明中发酵液TLC分析图，

其中，1是黄芪总皂苷，2是发酵液，3是对照（未投料菌液），4是黄芪甲苷标准品；

图2是本发明中黄芪甲苷分离纯化各步骤TLC分析图，

其中，1是原料黄芪总皂苷，2是发酵液正丁醇提取物，3是大孔树脂分离后，4是获得的黄芪甲苷纯品，5是黄芪甲苷标准品；

图3是本发明中黄芪甲苷分离纯化各步骤HPLC色谱纯度分析图，

其中， A是正丁醇提取物（色谱纯度35.9%），B是D101大孔树脂分离（色谱纯度61.98%），C是黄芪甲苷纯品（色谱纯度99.9%）。

具体实施方式

实施例1：利用Absidia corymbifera转化黄芪总皂苷制备黄芪甲苷

两支伞枝犁头霉（Absidia corymbifera）试管斜面，加50 mL无菌水制成孢子悬浮液，接种于（每瓶1 mL）装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶中，液体培养基为马铃薯培养基（200 g马铃薯加水1 L，煮沸半小时，过滤除去残渣，滤液中加入20 g葡萄糖，自然pH）。28℃，220 rpm，培养24 h，得种子液。将250 mL种子液接种于装有1 L上述液体培养基的5 L发酵瓶中，28℃，220 rpm，培养24 h，投入粗品黄芪总皂苷（投料浓度10 g/L），相同条件下转化72 h。发酵液TLC分析结果见图1，Absidia corymbifera能将黄芪总皂苷中其他黄芪皂苷转化为黄芪甲苷。

发酵液加1 L 95%工业乙醇浸泡过夜，离心过滤除去菌体和一些沉淀，旋转蒸发至300 mL左右（无乙醇味），用100 mL正丁醇萃取一次，50 mL正丁醇再萃取一次。合并有机层，旋干，正丁醇回收。所得浸膏用甲醇复溶，过滤，除去沉淀，滤液旋干备用。TLC扫描分析滤液中黄芪甲苷含量为129.8 mg，HPLC分析色谱纯度为35.9%。原料黄芪总皂苷中黄芪甲苷含量为34.5 mg，经过微生物转化后，黄芪甲苷的量提高约3倍。

上述滤液用D101大孔树脂(j20 *250mm)分离纯化，上样流速0.6ml/min，首先用5 BV蒸馏水预洗除糖，再用5 BV 2%KOH水溶液洗去大量色素，然后依次用4BV 19% 乙醇、2BV 23.75% 乙醇、2BV 47.5% 乙醇和10BV 57% 乙醇洗脱，TLC跟踪检测，合并47.5%馏分和57%馏分旋转蒸发，至无乙醇，剩余液体约340ml，进行薄层扫描得黄芪甲苷126.6 mg，回收率97.5%，色谱纯度为61.98%。

上述液体用40ml乙酸乙酯萃取一次，旋干水层中残存的乙酸乙酯，水中有白色沉淀析出，10000 r/min离心10 min，得黄芪甲苷白色固体107.6 mg，回收率82.9%，色谱纯度99.9%。

分离纯化各步骤TLC分析见图2，HPLC色谱纯度分析见图3。

 

实施例2：黄芪甲苷注射液制备

    处方：黄芪甲苷        1.0 g

          乙醇            200 mL

          丙二醇          200 mL

          葡萄糖          100 g

          注射用水        补足至1000 mL

制备方法：取处方量的黄芪甲苷，40℃下溶于处方量的乙醇和丙二醇的混合溶液中，搅拌并加入部分注射用水，再加入处方量的葡萄糖，完全溶解后补足注射用水至1000 mL,0.22μm过滤器过滤，灌封，灭菌，即得2 mL规格黄芪甲苷注射液200支。

 

实施例3   黄芪甲苷注射液治疗心脑血管实例

1 实验目的  采用柯萨奇B₃病毒（CVB₃）感染引起的小鼠病毒性心肌炎模型，评价本发明制备的黄芪甲苷注射液对病毒性心肌炎的治疗作用，为治疗病毒性心肌炎新药开发及临床应用提供实验依据。

2 实验方法  将黄芪甲苷分成两个剂量组，Balb/c小鼠50只随机分成4组。正常对照组（5只）：不给黄芪甲苷，不接种病毒，只给等量溶媒；病毒对照组（15只）：每只腹腔接种0.1 mL CVB₃病毒液(TCID₅₀=10^-7.5，10⁵倍稀释)；给药组I——高剂量（15只）：同上法接种CVB₃病毒液，同日尾静脉注射黄芪甲苷注射液3 mg/kg，连续给药7 d，观察15 d；给药组II——低剂量（15只）：同给药组I方法，尾静脉注射黄芪甲苷注射液，剂量为1 mg/kg。

采用上述试验的剂量分组，连续给药7 d，观察15 d后，比较各组病毒性心肌炎小鼠的发病率和死亡率，并解剖小鼠，计算心指数，记录心脏病变程度，做病理切片，倒置相差显微镜观察心脏病变。

3 实验结果

3.1 对病毒性心肌炎小鼠发病率和死亡率的影响

观察记录各组动物在给药（饲养）期间的精神状态、饮食、毛色及死亡情况。结果表明本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B₃病毒（CVB₃）感染引起的病毒性心肌炎小鼠的发病率和死亡率，见表1。

 

表1 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠发病率和死亡率的影响

组别动物数（只）发病率（例数）死亡率（例数）正常对照组50（0）0（0）病毒对照组1586.67%（13）33.33%（5）高剂量给药组1540.0%（6）6.67%（1）低剂量给药组1553.33%(8)13.33%（2）

注：采用卡方检验，给药组与病毒组比较。

 

3.2 对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响

在试验第15天，将小鼠全部解剖。解剖前称取小鼠体重，解剖后再称取其心脏重量，按下式计算心指数：

              心指数 = 心重/体重

动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大、发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。

结果表明本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B₃病毒（CVB₃）感染引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数，见表2。

 

表2 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响

组别心指数（×10^-3）正常对照组4.66±0.72病毒对照组6.53±1.21高剂量给药组5.47±0.83**低剂量给药组6.24±0.94

注：给药组与病毒组比较，**P<0.01。

 

3.3 对病毒性心肌炎小鼠心脏表观病变程度的影响

在试验第15天，将小鼠全部解剖。记录观察到的心脏病变程度，主要从斑块状病变的大小和心脏膨大程度来确定，分为0，+，++，+++，++++五级，病变程度依次加重。

结果表明本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B₃病毒（CVB₃）感染引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏表观病变程度，如表3所示。

 

表3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏表观病变程度的影响

 0++++++++++ 平均值对照组500000病毒组026432.4高剂量给药组932100.7**低剂量给药组437101.3**

注：给药组与病毒组比较，**P<0.01。

 

3.4 对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞浸润和坏死程度的影响

在试验第15天，将小鼠全部解剖。取出心脏，置福尔马林溶液中，做病理切片后在倒置相差显微镜下观察，每个标本观察5个高倍视野，记录浸润和和坏死情况。每个视野，病变0~25%记为1，25%~50%记为2，50%~75%记为3，75%~100%记为4。

结果表明本发明药物两个剂量组均能显著改善由柯萨奇B₃病毒（CVB₃）感染引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏病变情况。

 

表4 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞浸润和坏死程度的影响

组别浸润坏死正常对照组00病毒对照组1.9±0.612.2±0.43高剂量给药组0.7±0.55**1.3±0.58**低剂量给药组1.1±0.72**1.6±0.41**

注：给药组与病毒组比较，**P<0.01。