曙红及其衍生物在琼脂糖凝胶上DNA负染检测中的应用

摘要

本发明涉及DNA检测技术，具体地说是曙红(Eosin Y)及其衍生物在DNA检测中的应用。本发明还提供了应用曙红进行琼脂糖上DNA负染检测的方法，包括步骤：将DNA样品电泳后的凝胶在固定液中固定；染色；显影。本发明具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景低、线性范围广、可逆性强、使用安全、成本低廉等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA检测技术，具体地说涉及DNA检测的一种新型染料。

背景技术

在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，DNA是研究生命现象与本质的物质基础，特别随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，主要包括：对特定基因功能的识别、新药筛选、疾病诊断、药物作用机理、生物各个时期的发育变化等方面的研究，它几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，对DNA的研究具有重要的意义。目前，琼脂糖凝胶电泳是高效分离和分析DNA分子的一种常用方法，使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用。

测定DNA含量的方法有多种，目前用于琼脂糖上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、染料染色法、负染法、银染法等。DNA负染检测法因具有快速便捷、价格低廉、低毒等优点而成为DNA检测研究领域的热点之一。

曙红为砖红色粉术状或酱红色结晶，属于萤光黄的四溴衍生物，是最常用的胞浆染料。到目前为止，还没有将其用于DNA负染检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供曙红及其衍生物在DNA负染检测中的应用。

本发明所述的曙红相关化合物是指以曙红为母核的钠盐、钾盐、铵盐等。

曙红母核为：

下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：

1)将经琼脂糖电泳后的DNA样品凝胶置于固定液中固定5-15min，其中所述固定液为含按重量体积比0.1-5％的乙酸锌水溶液，弃固定液；优选的固定时间为10min，优选的乙酸锌浓度为2.5％；

2)加入染色液染色1-60min，其中所述染色液为含按重量体积比0.1-0.5％的曙红或其衍生物及按体积比为30-60％甲醇的水溶液，弃染色液；优选的染色时间为25min，优选的曙红或其衍生物的浓度为0.4％，甲醇浓度为50％；

3)加入显影液显影1-30min，其中所述显影液为含按重量体积比为0.2-10％乙酸锌及0.5-5％柠檬酸的水溶液，优选的显影时间为20min，优选的乙酸锌浓度为2％，柠檬酸浓度为1％，弃显影液。

用曙红作为DNA检测染料具有如下优点：

1)灵敏度高：比普通染料染色的灵敏度高很多倍；

2)操作简单迅速：操作简便，可在50min内完成；

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)染色背景低；

5)线性范围广：能在较大范围内对DNA进行半定量测定；

6)可逆性强；

7)使用安全：采用低毒性的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；

8)成本低廉。

附图说明

图1.曙红的化学结构；

图2.(A)曙红染色法中，染色前固定10min和不固定对染色结果的影响，其中(a)是不固定的凝胶，(b)是固定10min的凝胶；(B)固定液中乙酸锌浓度对染色结果的影响，乙酸锌浓度分别为：(a)0.5％，(b)1.5％，(c)2.5％，(d)3.5％，(e)4.5％；DNA载样量(每条带)如下：带1，72ng；带2，36ng；带3，18ng；带4，9ng；带5，4.5ng；带6，2.2ng；带7，1.1ng；带8，0.5ng；

图3.(A)曙红浓度对染色效果的影响，曙红的浓度分别为：(a)0.1％，(b)0.2％，(c)0.3％，(d)0.4％，(e)0.5％；(B)染色时间对染色效果的影响，染色时间分别为：(a)10min，(b)20min，(c)30min，(d)40min，(e)50min；DNA载样量(每条带)如下：带1，72ng；带2，36ng；带3，18ng；带4，9ng；带5，4.5ng；带6，2.2ng；带7，1.1ng；带8，0.5ng；

图4.显影液对染色灵敏度及对比度的影响，(A)显影液中乙酸锌浓度对染色结果的影响，乙酸锌的浓度分别为：(a)0.5％，(b)1.0％，(c)2.0％，(d)3.0％，(e)4.0％；(B)显影液中柠檬酸浓度对染色结果的影响，柠檬酸的浓度分别为：(a)0.1％，(b)0.5％，(c)1％，(d)2％，(e)3％；

图5.曙红染色法与其他DNA检测方法灵敏度的比较。DNA载样量(每条带)如下：带1，72ng；带2，36ng；带3，18ng；带4，9ng；带5，4.5ng；带6，2.2ng；带7，1.1ng；带8，0.5ng。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1曙红DNA负染

图1是曙红的化学结构式。曙红的DNA染色实验采用下述步骤进行：

1)将经琼脂糖电泳后的DNA样品凝胶置于固定液中固定10min，固定液为含按重量体积比2.5％的乙酸锌水溶液；

2)在染色液中染色25min，染色液为含重量体积比0.4％的曙红及体积比为50％甲醇的水溶液；

3)加入显影液显影20min，显影液为含重量体积比为2.0％乙酸锌及1％柠檬酸的水溶液，弃显影液；

按照上述方法分别用曙红的钠盐、钾盐、铵盐进行DNA染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于曙红的检测结果。

琼脂糖凝胶参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。

实验例1凝胶染色前固定液对灵敏度、对比度的影响

按照实施例1的方法进行染色，图2(A)中(a)是未经固定的凝胶，(b)是固定10min的凝胶，DNA载样量(每条带)如下：带1，72ng；带2，36ng；带3，18ng；带4，9ng；带5，4.5ng；带6，2.2ng；带7，1.1ng；带8，0.5ng。说明固定步骤是必要的，其能显著提高染色效果。固定液中使用不同浓度的乙酸锌进行固定，乙酸锌的浓度分别为：(a)0.5％，(b)1.5％，(c)2.5％，(d)3.5％，(e)4.5％。结果如图2(B)所示，实验表明1.5％仍能获得较高的灵敏度，但以2.5％效果最佳。

实验例2曙红浓度对染色效果的影响

按照实施例1的方法，用不同浓度的曙红进行染色，曙红的浓度分别为：(a)0.1％，(b)0.2％，(c)0.3％，(d)0.4％，(e)0.5％。结果如图3(A)所示，实验表明曙红浓度为0.4％时染色效果较好。说明步骤2)中0.4％的曙红浓度能显著提高染色效果。

实验例3染色时间对染色效果的影响

按照实施例1的方法，采用不同的染色时间进行染色，染色时间分别为：(a)5min，(b)15min，(c)25min，(d)35min，(e)45min。结果如图3(B)所示，实验表明染色25min效果较佳，35min次之，时间过长或过短染色效果均会降低。说明步骤2)中25min的染色时间能显著提高染色效果。

实验例4显影液对灵敏度、对比度的影响

显影液中使用不同浓度的乙酸锌和柠檬酸混合液进行显影，乙酸锌的浓度分别为：(a)0.5％，(b)1.0％，(c)2.0％，(d)3.0％，(e)4.0％。结果如图4(A)所示，实验表明乙酸锌浓度为2％时染色效果较好。说明步骤3)中2％的乙酸锌浓度能显著提高染色效果。柠檬酸的浓度分别为：(a)0.1％，(b)0.5％，(c)1％，(d)2％，(e)3％。结果如图4(B)所示，实验表明柠檬酸浓度为1％时染色效果较好。说明步骤3)中1％的柠檬酸浓度能显著提高染色效果。

实验例5曙红染色法与其他DNA检测方法灵敏度的比较

采用不同染色法进行染色，(A)锌咪唑负染法；(B)EB荧光染色法，(C)曙红染色法。DNA载样量(每条带)如下：带1，72ng；带2，36ng；带3，18ng；带4，9ng；带5，4.5ng；带6，2.2ng；带7，1.1ng；带8，0.5ng。结果如图5所示，锌咪唑负染法在带6之后的DNA就已不能被检测到，而对于曙红染色法，在带8处清晰可见DNA条带，同时可见曙红染色法灵敏度与EB荧光染色法相近。

其中曙红染色采用实施例1的方法进行，锌咪唑负染及EB荧光染色分别按下述方式进行：

锌咪唑负染法^[1]：

将经琼脂糖电泳分离的DNA样品凝胶水洗三次后，每次15min，放入40mM硫酸锌溶液中15min，接着置于0.2M咪唑溶液中染色5min，再接着置于2M的咪唑溶液中染色45min，最后水洗，其灵敏度为5-6ng。

EB荧光染色法^[2]：

电泳之后用0.5mg/mL的EB溶液对琼脂糖进行染色15min，去离子水中水洗2min后，置于紫外透射仪下进行观察、拍照。

参考文献：

[1]Eugenio Hardy Elder PupO Racmar Casalvilla Angela E.Sosa Luis E.Trujillo Eduardo LdpezLila Castellanos-Serra，Negative staining with zinc-imidazole of gel electrophoresis-separatednucleic acids.Electrophoresis 1996，17，1537-1541.

[2]Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edn.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989.