水稻隐性抗白叶枯病主效基因xa25和它在水稻抗病改良中的应用

摘要

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含水稻隐性抗白叶枯病主效基因xa25以及xa25的等位显性基因Xa25的两条DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。利用基于人工微小RNA(artificial microRNA，amiRNA)干扰技术原理的转基因技术，将隐性基因xa25的部分DNA片段与外源调节序列连接并转入水稻，抑制水稻中隐性基因xa25的表达，可进一步增强水稻对白叶枯病的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗白叶枯病隐性基因xa25的分离 克隆、功能验证和应用研究。抗病隐性基因xa25能够赋予水稻抵抗由白叶枯病菌引起的病害。 抑制xa25基因的表达能够进一步增强水稻对白叶枯病的抗性。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细 菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖， 引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资 源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两大类 (Kou和Wang，2010)。第一类是受体(receptor)基因，包括抗病(disease resistance)主效 基因，又称R基因和宿主模式识别受体(host pattern recognition receptor)基因。第二类是抗 病相关(defense-related或defesne-responsive)基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，抗病基因的产物主要是作为受体，直接或间接与 病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Chisholm等，2006)。抗病基因介导 的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但是农作物中抗病基因的资源有限。

水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害之一(过崇俭，1995)。 受侵染的水稻一般减产20-30％，严重时能够达到50％(Ou，1985)。白叶枯病造成米质松 脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。 水稻中抗病主效基因的资源非常有限。如目前命名的抗白叶枯病主效基因只有大约30多个， 其中只有6个被分离克隆了(储昭晖和王石平，2007)。每一个抗白叶枯病主效基因只对部分 白叶枯病菌生理小种有抗性，即不同的抗病主效基因具有不同的抗谱。

控制白叶枯病害流行的最好的方法是利用抗性基因资源改良水稻品种的抗性。转基因技 术为品种改良提供了高效途径。但利用这一途径的前提是必须具有优良抗性基因克隆。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中的隐性抗白叶枯病主效基因xa25，并采用RNA干扰技 术(RNA interference，RNAi)、利用人工微小RNA(artificial microRNA)，通过使xa25基因 沉默，高效利用这个基因改良水稻品种抵御病害的能力。

本发明涉及分离和应用包含xa25基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第201-252、1201-1237、 1352-1562、1804-1965、2095-2214和2330-2635位所示。该基因(片段)赋予水稻对 由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一 发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。除上述所 述的如SEQ ID NO：1所示的DNA片段外，本发明所定义的基因还包括基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对序列 表SEQ ID NO：1所示序列进行生物信息学分析表明，该DNA序列编码的蛋白质属于 MtN3/saliva家族。

可以采用已经克隆的xa25基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因 或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA 和cDNA中扩增得到本发明的xa25基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段 DNA。采用以上技术，可以分离得到包含xa25基因的序列或者包含一段xa25基因的序列， 将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞抑制其自身的xa25基因的表达，产生高 抗白叶枯病的转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到 的。

本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将xa25基因 的部分片段和与能够表达人工微小RNA(artificial microRNA，amiRNA)的载体连接、转入水 稻，通过抑制其自身xa25基因的表达进一步提高水稻对白叶枯病的抗性。

在本发明的实施例部分，我们阐述了隐性抗病主效基因xa25的分离、功能验证和应用过 程以及该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的核苷酸序列， 该基因来源于抗病水稻品种明恢63。

序列表SEQ ID NO：2.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25编码的氨基酸序 列。

序列表SEQ ID NO：3.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的显性等位基因 Xa25的核苷酸序列，该基因来源于感病水稻品种珍汕97。

序列表SEQ ID NO：4.本发明分离的隐性水稻抗白叶枯病主效基因xa25的显性等位基因 Xa25编码的氨基酸序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗白叶枯病隐性基因xa25和它的等位显性基因Xa25、 以及xa25和Xa25基因功能验证的流程图。

图2.从珍汕97/明恢63F₃群体中随机选择255个F₃单株分析对白叶枯病菌菌株PXO339 的病斑分布。

图3.利用4个分子标记初步将隐性抗白叶枯病主效基因xa25定位在水稻12染色体的着 丝粒区。分子标记间的数值表示遗传距离，实心黑色圆圈示着丝粒区。

图4.精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25。分子标记间的数值表示遗传距离。括号 中的数字代表xa25位点与相应的分子标记间检测到的重组事件数量。

图5.用于遗传转化的感病品种珍汕97中的包含显性基因Xa25候选基因(Os12g29220) 的DNA片段和Xa25候选基因(Os12g29220)的结构。图中长粗横线条代表长5213个核苷 酸(nt)的遗传转化片段。横柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列，白色部分代表5’ 端和3’端的非翻译区；横线条代表内含子；数字表示各个结构的碱基数；“ATG”和“TAG”分 别是翻译起始密码和终止密码。

图6.遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。

图7.对明恢63遗传背景(D175OMH7)和中花11遗传背景(D175OZH1)的遗传转化 T₁代家系进行基因型和表型共分离分析。说明与Xa25候选基因与感病表型共分离。病斑面 积为苗期接种白叶枯病菌菌株PXO339两周后的数据。

图8.抗病水稻品种明恢63中隐性抗白叶枯病主效基因xa25的结构。图中横柱条表示外 显子，其中黑色部分代表编码序列，斜线部分是5’-和3’-UTR；横线条代表内含子；数字表 示各个结构的碱基数；“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。

图9.在苗期和成株期(孕穗期)，抗病水稻品种明恢63的隐性基因xa25和感病水稻品 种珍汕97的显性基因Xa25在接种病原菌菌株PXO339之后的表达模式。看家基因actin的表 达量作为样品量一致性的参照。ck：未接种；1、2、3：接种PXO339后1、2、3天。

具体实施方式

本发明的前期研究结果显示籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)品种明恢63特异性抗白叶 枯病菌菌株PXO339，而明恢63所具有的这一特异性抗性可能是由它携带的、位于12号染 色体着丝粒区段的一个抗白叶枯病主效基因Xa25(t)(临时命名)调控的(Chen等，2002)。这 个基因就是本发明中的隐性抗白叶枯病主效基因xa25。

以下实施例中进一步定义本发明。图1描叙了遗传定位和分离克隆隐性抗白叶枯病主效 基因xa25和它的等位显性基因Xa25、验证xa25和Xa25基因功能和高效利用隐性基因xa25 改良水稻抗性的流程。根据以下实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且 在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种 用途和条件。

实施例1：精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25

1.实验材料和接种方法

用携带隐性抗白叶枯病主效基因xa25的抗病水稻品种明恢63为父本、携带这个隐性基 因的等位显性基因Xa25的感病水稻品种珍汕97(Oryza sativa L.ssp.indica)为母本，构建 F₂群体。明恢63还携带抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26(Sun等，2004)。为了排除Xa3/Xa26 基因对精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25的影响，本发明研究人员利用Xa3/Xa26基因 的特异性PCR引物Xa26P3F(5’-AACTCCAACAGTATGTCCACCTTT-3’)和Xa26PR(5’- GCATTGGCAGCAAGAGTAT-3’)检测这个F₂群体中的单株，选取了60个在Xa3/Xa26位点为 珍汕97纯合带型(不携带Xa3/Xa26基因)，在xa25位点两侧的分子标记RM179和RM28172 为杂合带型的单株。这60个F₂单株后代组成珍汕97/明恢63F₃群体，由5816个F₃单株组 成。在该群体中随机选取255个F₃单株，用于初步定位隐性抗病主效基因xa25。进一步利用 该群体中的795个极端抗病F₃单株精细定位xa25。

白叶枯病菌接种采用剪叶法对苗(4-6叶)期和成株(孕穗)期的水稻进行接种(Sun 等，2004)。白叶枯病菌株由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004；Wu等，2008)。白 叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种14天后调查病斑长度(厘 米)或病斑面积(病斑长度/病叶长度×100％)。

2.初步定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25

为初步定位隐性基因xa25，对5816个单株组成的珍汕97/明恢63F₃群体在苗期接种白叶枯 病菌菌株PXO339，从中随机选择255个单株组成随机群体，分析病斑长度。在该随机群体中 病斑长度呈现一个明显的双峰分布，两峰的峰谷处于3.3cm的位置(图2)。以这个峰谷为抗 病和感病单株的分界线，将病斑长度≤3.3cm视为抗病单株，将病斑长度≥9.5cm的视为感病 单株。按照这一分类标准，这个随机群体中的抗病个体有55株，感病个体有200株。抗病单株 数和感病单株数之比符合1∶3(χ²＝1.698，P＞0.05)分离比，证明明恢63对PXO339的抗性由 单一隐性抗病主效基因调控。根据本发明研究人员的前期工作基础，明恢63中调控对PXO339 抗性的主效基因位于水稻12号染色体的两个分子标记R887和G1314之间(Chen等，2002)。本 发明研究人员选取了R887和G1314这两个分子标记附近的3个SSR(simple sequence repeat)分 子标记RM179、RM511、RM28172和一个Indel(insertion/deletion)分子标记MZ2对这个由255 个F₃单株组成的随机群体进行分析。其中的SSR标记为国际上的通用分子标记(http://www. Gramene.org；International Rice Genome Sequencing Project 2005)；Indel标记则根据水稻品种 明恢63和珍汕97的基因组序列(Xie等，2010)设计。Indel标记MZ2是PCR标记，用引物MZ2F (5’-CCTAATGCAACGCTGAAGTG-3’)和MZ2R(5’-AATGAGTTCTCCGTGGGTTG-3’)扩增 检测。利用这4个分子标记将该隐性基因定位到12号染色体着丝粒区，同本发明研究人员前期 定位的Xa25(t)基因位置在同一区段(Chen等，2002)。因为该隐性抗病主效基因与Xa25(t)基 因可能为同一个基因，我们将其命名为xa25。xa25基因与分子标记RM511共分离，距分子标 记MZ2为1.2cM，距分子标记RM28172为0.4cM(图3)。

3.精细定位隐性抗白叶枯病主效基因xa25

对5816个单株组成的珍汕97/明恢63F₃群体在苗期接种白叶枯病菌菌株PXO339，从中 选取795个极端抗病单株(平均病斑长度＜2cm)用于精细定位隐性基因xa25。先用位于该 基因两侧Indel标记MZ2和SSR标记RM28172来筛选其中的重组单株。在基因的一侧，用 MZ2检测到6个重组单株(图4)。在基因的另一侧，用RM28172检测到另外6个重组单株 (图4)。为更进一步精细定位xa25，利用位于MZ2和RM28172之间的两个Indel标记MZ4、 MZ7和一个SSR标记RM511来检测这12个重组单株。Indel标记MZ4和MZ7根据水稻品 种明恢63和珍汕97的基因组序列(Xie等，2010)设计。MZ4和MZ7都是PCR标记，分 别用引物MZ4F(5’-GCGAATGATGTGAGAGGTGA-3’)和MZ4R(5’- CGGAGATCAATCTGCAACCT-3’)以及引物MZ7F(5’-GGAACCCATCCACCTAATCC-3’)和 MZ7R(5’-GAATGGTGCCCTAACGTTCT-3’)扩增检测。用MZ7检测在RM28172一侧的6 个重组单株中发现一个重组事件(图4)。MZ4和RM511在这个12个重组单株中没有检测到 重组事件(图4)。为确认该定位结果，对这12个重组单株进行了后代(F₄)验证。来源于每 个F₃重组单株分别种植20个F₄单株个体，苗期接种PXO339，所有后代均表现出抗病。进 一步验证了xa25定位的准确性。因此xa25被定位到分子标记MZ2和MZ7之间。

实施例2：显性基因Xa25的分离和功能验证

1.显性Xa25候选基因的确定

根据Gramene数据库的信息 (http://www.gramene.org/Oryza sativa japonica/mapview？chr＝12)，分子标记MZ2和MZ7间 的物理距离大约为1,233kb。根据水稻基因组注释数据库[Rice Genome Annotation Project (RGAP)；http://rice.plantbiology.msu.edu/]的信息，该1233-kb区段包含一个MtN3/saliva基 因家族的成员(RGAP位点编号为Os12g29220)。Os12g29220基因与水稻中已经报道的隐 性抗白叶枯病主效基因xa13同属一个基因家族(Chu等，2006；Yuan等，2010)。采用PCR 引物seF3(5’-TCACTAAATTGGCTATGGCTAG-3’)、seF5(5’-CTTGTGGAGCAAACATTCG -3’)、seF8(5’-CTCCCTCGGCTGGGTCTGC-3’)、seF13(5’-GGAGGAGACAAGCTACCA-3’)、 美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)，根据试剂盒说明书以双脱氧核苷酸末端 终止法分别对感病品种珍汕97和抗病品种明恢63中的Os12g29220基因进行测序，发行这两 个水稻品种中的Os12g29220基因的编码区有3％的变异(序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ IDNO：2)。故将感病品种珍汕97中的Os12g29220基因视为显性基因Xa25的候选基因。

2.Xa25候选基因的分离和功能验证

本发明研究人员采用长链PCR的方法，利用PCR引物Xa25F3 (5’-CGCGGATCCAAACGTATGGCAGAGGTTCAGGTAGCC-3’)和Xa25R3 (5’-CGGGGTACCCAGTCATGGAAGTACGAAATCAGGAAA-3’)从感病水稻品种珍汕97中 扩增了包含显性基因Xa25的候选基因(Os12g29220)、长大约5.2kb的DNA片段(图5)。 该片段包含了候选基因的自身启动子区(1569个核苷酸)、候选基因(3102个核苷酸)和候 选基因下游序列(542个核苷酸)。

本发明所遗传转化载体是pCAMBIA1301(图6)，它是常用的水稻遗传转化载体(Sum 等，2004)。将上述DNA片段经BamHI、KpnI双酶切处理，与同样用BamHI、KpnI双酶切 处理的农杆菌介导的遗传转化载体pCAMBIA1301连接。通过酶切验证阳性克隆，获得的重 组质粒被命名为D175O。采用农杆菌介导的遗传转化方法，将D175O分别转入携带隐性抗白 叶枯病主效基因xa25的抗病水稻品种明恢63和中花11中。分别获得20株和19株遗传转化 植株。将在明恢63、中花11背景中获得的转化植株分别命名为D175OMH和D175OZH。

在苗期对所有T₀代转化植株接种白叶枯病菌菌株PXO339，接种14天后调查病斑面积。 同时取样抽取DNA，采用遗传转化载体所携带的报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)的PCR 引物GusF    (5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’)和GusR (5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACC-3’)扩增检测阳性遗传转化植株。在明恢63背景中， 15株遗传转化阳性植株的病斑面积为30.6±7.4％至50.6±3.9％，抗病对照明恢63的病斑面 积为6.5±1.1％，感病对照珍汕97的病斑面积为49.9±7.6％(表1)。在中花11背景中，15 株遗传转化阳性植株的病斑面积为19.7±2.9％至31.3±7.4％，抗病对照中花11的病斑面积 为4.3±1.0％(表2)。

表1.T₀代遗传转化植株(D175OMH，明恢63背景)对白叶枯病菌菌株PXO339的反应

⁽¹⁾用Xa25候选基因特异CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记[用MZCF5(5’- AAATGGCTGGCCTGTCCC-3’)和MZCR5(5’-TAAATGTCGTCGCTAGCTATGCGAA-3’)进行PCR扩增， 然后用HinfI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切]，检测明恢63背景遗传转化植株中是否携带Xa25 候选基因。

⁽²⁾扩增报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)进行阳性检测。

表2.T₀代遗传转化植株(D175OZH，中花11背景)对白叶枯病菌菌株PXO339的反应

(1)用Xa25候选基因特异Indel(insertion/deletion)分子标记[用ZZF1(5’-CTCCCTCACGCTCACCCT-3’) 和ZZR1(5’-GAATGTGAAGCCCAGGATG-3’)进行PCR扩增]，检测中花背景遗传转化植株中是否携带 Xa25候选基因。

(2)扩增报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)进行阳性检测。

为了确认这些转化植株表型改变与转入的Xa25候选基因相关，本发明用基因特异分子标 记对两个遗传背景的转基因植株进行了检测。在明恢63背景中，本发明用Xa25候选基因特 异CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)标记引物MZCF5 (5’-AAATGGCTGGCCTGTCCC-3’)和MZCR5(5’-TAAATGTCGTCGCTAGCTATGCGAA-3’) 对遗传转化植株DNA进行扩增，PCR产物经限制性内切酶HinfI处理之后，在3％的琼脂糖 中电泳。在中花11背景中，本发明用Indel(insertion/deletion)标记引物ZZF1 (5’-CTCCCTCACGCTCACCCT-3’)和ZZR1(5’-GAATGTGAAGCCCAGGATG-3’)对中花11背 景转化植株的DNA进行扩增，PCR产物在3％的琼脂糖中电泳。检测结果显示所有感病转化 植株都含有转入的Xa25候选基因，而所有抗病转化植株都不携带Xa25候选基因。这些结果 证明转化植株的表型改变可能是因为转入基因的作用。

为了进一步验证遗传转化植株表型改变是因为转入的Xa25候选基因的作用，在苗期对来 源于感病T₀植株D175OMH7(明恢63背景)和D175OZH1(中花11背景)的T₁代家系接 种白叶枯病菌菌株PXO339，接种14天后调查病斑面积，同时取样抽取DNA检查阳性转化 植株。结果显示所有T₁代植株的感病表型都与Xa25候选基因的特异分子标记共分离(图7)。 这些结果说明用于遗传转化、来源于感病水稻品种珍汕97的候选基因(Os12g29220)就是显 性基因Xa25。

实施例3：隐性抗病主效基因xa25的分离

用实施例2中的PCR引物Xa25F3和Xa25R3从抗病水稻品种明恢63和中花11中扩增 包含xa25基因的大约5.2kb的DNA片段，然后用实施例2中的测序引物seF3、seF5、seF8、 seF13对该片段进行测序。序列分析显示明恢63和中花11中的隐性基因xa25的序列完全相 同；该基因由3208个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的1至3208bp处)， 包含6个外显子(分别位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的1-252、1201-1237、1352- 1562、1804-1965、2095-2214、2330-3208bp处)和5个内含子(分别位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的253-1200、1238-1351、1563-1803、1966-2094、2215-2329bp处) 组成。外显子1中包含200个碱基的5’-非翻译区(untranslated region，UTR)(序列表SEQ ID NO：1所示序列的1-200bp处)，外显子6中包含573个碱基的3’-UTR(序列表SEQ ID NO： 1所示序列的2636-3208bp处)(图8)。

隐性基因xa25的编码的xa25蛋白由296个氨基酸组成，来源于珍汕97的显性基因Xa25 编码的XA25蛋白由293个氨基酸组成。这两种蛋白存在8个氨基酸的差异(表3)。

表3.xa25和XA25蛋白质的氨基酸差异位点

⁽¹⁾氨基酸残基缩写和符号：V，缬氨酸；A，丙氨酸；T，苏氨酸；P，脯氨酸；I，异亮氨酸；L，亮氨酸； G，甘氨酸；S，丝氨酸；-，缺失。

实施例4：隐性基因xa25和显性基因Xa25表达模式分析

为了验证接种白叶枯病菌是否会影响隐性抗病主效基因xa25和它的显性等位基因Xa25 的表达，本发明的研究人员在在苗期和成株期对携带隐性基因xa25的抗病水稻品种明恢63 和携带显性基因Xa25的感病水稻品种珍汕97接种白叶枯病菌菌株PXO339。在接种前(ck) 和接种1、2、3天后取水稻叶片组织抽提RNA(Zhou等，2002)。采用RT-PCR方法(Zhou 等，2002)，利用基因特异引物Xa25RTF(5’-CTTCTCCGTCAGCGTCTT-3’)和Xa25RTR(5’- GCAGTTGGGATTGATTGATA-3’)检测了隐性基因xa25和显性基因Xa25的表达量。PCR反 应体系如下：5μl cDNA反应产物，0.2μM基因特异性引物，1×PCR buffer，1.5μl 2mM dNTP， 1u rTaq(购白宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa公司)，最后添加无菌水至总体积20μl。 PCR过程为：先94℃变性2分钟；然后进入循环，每个循环设定为94℃30秒，58℃30秒， 72℃1分钟，循环数为36；最后在72℃延伸10分钟，结束反应。分析结果显示，在苗期和 成株期，白叶枯病菌菌株PXO339能够诱导感病品种珍汕97中显性基因Xa25的表达，但不 能诱导抗病品种明恢63中隐性基因xa25的表达(图9)。这些结果提示，激活显性基因Xa25 的表达可能是导致水稻感病的原因。

实施例5：抑制隐性基因xa25的表达可进一步增强水稻的抗性

为了进一步验证白叶枯病菌侵染后水稻抗病或者感病是否与隐性xa25和显性Xa25基因 的表达量有关。本发明研究人员采用在水稻中已经成熟的人工微小RNA(artificial microRNA， amiRNA)干扰技术(Warthmann等，2008)、通过抑制抗病水稻品种中花11中隐性基因xa25 的表达，分析基因的表达量是否与水稻抗病相关。

将隐性基因xa25的部分片段和与能够表达amiRNA的载体连接、转入水稻的具体操作步 骤如下：

第一轮PCR反应：利用3对PCR引物组合分别进行3个独立PCR反应，所用模板为质 粒pNW55(Warthmann等，2008)。3对引物组合和扩增片段的长度如下：第一对引物G-4368 (5’-CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’)和Primer II miR-a (5’-tgTCGCAACCTTCCATTAATTAActgctgctgctacagcc-3’)扩增片段大小为256bp；第二引物 Primer I miR-s(5’-agTTAATTAATGGAAGGTTGCGAcaggagattcagtttga-3’)和primer IV miR*a (5’-aaTTAATTAATGGTAGGATGCGAagagaggcaaaagtgaa-3’)扩增片段大小为87bp；第三对引 物Primer III miR*s(5’-ctTCGCATCCTACCATTAATTAAttcctgctgctaggctg-3’)和G-4369 (5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’)扩增片段大小为259bp。

第二轮PCR反应：将第一轮PCR中3个独立PCR反应的产物等体积混合之后，将混合 物作为第二轮PCR反应的模板。所用引物为第一轮PCR反应中所使用到的引物G-4368和 G-4369。扩增产物的长度为554bp。

将第二轮PCR产物经测序验证后，用BamHI和KpnI双酶切处理，与同样用BamHI和 KpnI双酶切处理的农杆菌介导的遗传转化载体IRS154(Warthmann等，2008)连接。通过酶 切验证阳性克隆，获得的重组质粒被命名为D196A。

采用上述农杆菌介导的遗传转化方法将携带抑制xa25基因表达的载体D196A导入水稻 品种中花11。获得的遗传转化植株被命名为D196AZ。本发明共获得阳性独立转化植株18株。 对全部阳性转化植株在苗期接种白叶枯病菌菌株PXO339。与抗病对照中花11相比，15株转 化植株的病斑长度显著(P＜0.01)减短，即抗性显著增强(表4)。

表4.中花11amiRNA遗传转化植株(D196AZ)对白叶枯病菌PXO339的反应

为进一步验证转化植株的抗病能力增强是否与隐性基因xa25的表达量降低相关，本发明 研究人员对表4中所列15株转化植株抽提总RNA，利用7500Real Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、定量PCR分析试剂盒Green PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)、以及Applied Biosystems公司的定量PCR分析方法做定量反转录 (quantitative reverse transcript，qRT)-PCR分析(Qiu等，2007)，比较转化植株和对照材料 中xa25基因表达量。PCR反应引物是25realF(5’-CTACGCGCTGATCAAGTCCAA-3’)和 25realR(5’-GGGCGTAGGCGAGGTACAT-3’)。以水稻肌动蛋白的qRT-PCR产物作为样品量一 致性对照。肌动蛋白PCR引物序列是actinF(5’-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3’)和actinR (5’-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3’)。分析结果显示抗病水平进一步提高的15株转化植株 中xa25基因的表达量与抗病对照中花11相比降低至24-64％(表4)。这些结果说明抑制隐 性抗白叶枯病主效基因xa25的表达可以进一步增强水稻对白叶枯病菌的抗性；可以采用这一 途径培育高抗水稻。

参考文献

储昭晖，王石平，(2007)，抗性基因分离克隆、结构与功能和分子进化，见：章琦主编，水

稻白叶枯病抗性的遗传及改良。北京：科学出版社，pp.349-377。

过崇俭(1995)中国农作物病虫害。中国农业科学院植物保护研究所主编，中国农业出版社， pp.14-24。

Chen H，Wang S，Zhang Q(2002)New gene for bacterial blight resistance in rice located on chromosome 12 identified from Minghui 63，an elite restorer line.Phytopathology 92：750-754.

Chisholm ST，Coaker G，Day B，Staskawicz BJ(2006)Host-microbe interactions：shing the evolution ofthe plant immune response.Cell 124：803-814.

Chu Z，Fu B，Yang H，Xu C，Li Z，Sanchez A，Park YJ，Bennetzen JL，Zhang Q，Wang S(2006) Targeting xa13，a recessive gene for bacterial blight resistance in rice.Theor.Appl.Genet. 112：455-461.

International Rice Genome Sequencing Project(2005)The map-based sequence of the rice genome. Nature 436：793-800.

Kou Y，Wang S(2010)Broad-spectrum and durability：understanding of quantitative disease resistance.Curr.Opin.Plant Biol.13：181-185.

Lin Y，Zhang Q(2005)Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep.23：540-547.

Ou SH(1985)Rice disease，2nd edition，Commonwealth Mycology Institute，New England.

Qiu D，Xiao J，Ding X，Xiong M，Cai M，Cao Y，Li X，Xu C，Wang S(2007)OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate-dependent signaling.Mol.Plant Microbe Interact.20：492-499.

Sun X，Cao Y，Yang Z，Xu C，Li X，Wang S，Zhang Q(2004)Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J. 37：517-527.

Warthmann N，Chen H，Ossowski S，Weigel D，HervéP.(2008)Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in rice.Plos One 3：e1829.

Wu X，Li X，Xu C，Wang S(2008)Fine genetic mapping of xa24，a recessive gene for resistance against Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice.Theor.Appl.Genet.118：185-191.

Xie W，Feng Q，Yu H，Huang X，Zhao Q，Xing Y，Yu S，Han B，Zhang Q(2010) Parent-independent genotyping for constructing an ultrahigh-density linkage map based on population sequencing.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107：10578-10583.

Yuan M，Chu Z，Li X，Xu C，Wang S(2010)The bacterial pathogen Xanthomonas oryzae overcomes rice defenses by regulating host copper redistribution.Plant Cell 22：3164-3176.

Zhou B，Peng KM，Chu ZH，Wang SP，Zhang QF(2002)The defense-responsive genes showing enhanced and repressed expression after pathogen infection in rice(Oryza sativa L.).Sci. China Ser C 45：449-467.