构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法

摘要

本发明公开了一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法。本发明方法包括如下步骤：提取血红铆钉菇子实体周围土壤的宏基因组；以宏基因组为模板用ITS1和ITS4进行PCR扩增回收700bp的DNA片段；将每个DNA片段与pMD19-T载体连接，用RV-M和M13-47进行PCR扩增，分别用HinfI、Hae III、Msp I、Taq I和Mbo I酶切各PCR产物并电泳，得到分子图谱。应用本发明的方法可以构建得到血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库，对于明确血红铆钉菇子实体生长环境微生物真菌群落结构、遗传、功能多样性具有重要的意义，为深入探讨其在血红铆钉菇的人工驯化培养提供重要信息，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法。

背景技术

血红铆钉菇(Chroogomphis rutillus)，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，铆钉菇 科，红铆钉菇属，俗称红蘑、松树伞、松蘑、肉蘑，形状似铆钉，颜色为暗红色，名 贵野生菌根食用菌，是针叶树木重要的外生大型菌根真菌，夏、秋季群生或散生。该 菇肉厚、品质滑润、细腻，味道鲜美，营养价值高，富含蛋白质，含有人体所需的8种 必需氨基酸、钙、铁等矿物质和大量碳水化合物，也是膳食纤维和天然抗氧化物的重 要来源，深受人们喜爱。

血红铆钉菇为外生菌根菌，至今难以人工驯化。近年来随着旅游业的发展和高强 度的采收，血红铆钉菇与卫生资源与生存环境正在受到威胁和破坏。为了更好地保护 血红铆钉菇资源，许多研究者致力于血红铆钉菇的人工驯化研究，如利用生长环境中 的土壤或者松树的组织培养物作为血红铆钉菇菌丝体分离的培养基。到目前为止，虽 然纯培养的菌丝已经获得，但是血红铆钉菇的人工驯化仍未成功。一些研究者开始从 生态角度研究血红铆钉菇生长环境中的影响因子，如植被种类、光照、水分等条件。 但其生长环境中的微生物种群的研究未见报道。

迄今为止，仍然有99％的微生物是未知的，并且绝大多数的微生物种类是不可培 养的，基于分子生物学技术的对不可培养微生物种类的鉴定加速了对环境样品的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方 法。

本发明提供了一种构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落的分子图谱的方法， 包括如下步骤：

(1)取血红铆钉菇子实体周围土壤，作为土壤样本提取宏基因组DNA；

(2)以所述宏基因组DNA为模板，用上游引物ITS1和下游引物ITS4组成的引物 对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，即为DNA片段库(690-710bp)；所述上游引物 ITS1为序列表的序列1所示的DNA片段；所述下游引物ITS4为序列表的序列2所示 的DNA片段；

(3)将所述DNA片段库与pMD19-T载体连接，得到重组质粒库；

(4)分别以所述重组质粒库中的每个重组质粒为模板，用上游引物RV-M和下游 引物M13-47组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；将各个PCR扩增产物分 别用限制性内切酶Hinf I、Hae III、Msp I、Taq I和Mbo I进行酶切并电泳，得到分 子图谱；所述上游引物RV-M为序列表的序列3所示的DNA片段；所述下游引物M13-47 为序列表的序列4所示的DNA片段。

所述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系由溶剂和溶质组成；所述溶剂为1× Ex Taq Buffer；每50μl所述反应体系中含有如下溶质：20ng所述模板、80pmol所 述上游引物、80pmol所述下游引物、0.2mmol/l dNTP和1.5U Ex Taq DNA聚合酶。

所述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s、58℃1min、 72℃30s，30个循环；72℃10min。

所述步骤(4)中，所述PCR扩增的反应体系由溶剂和溶质组成；所述溶剂为1× Ex Taq Buffer；每50μl所述反应体系中含有如下溶质：20ng所述模板、80pmol所 述上游引物、80pmol所述下游引物、0.2mmol/l dNTP和1.5U Ex Taq DNA聚合酶；

所述步骤(4)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s、58℃1min、 72℃30s，30个循环；72℃10min。

所述步骤(4)中，所述电泳可为2％琼脂糖凝胶电泳。所述电泳的参数优选为： 100V电压、40mA电流、3-4小时(如3.5小时)。

所述步骤(1)中，所述提取宏基因组DNA的方法包括如下步骤：

(1)将所述土壤样本悬浮于缓冲液，12000rpm离心10min，取沉淀；

(2)洗涤步骤(1)的沉淀；

(3)将步骤(2)的沉淀进行宏基因组的提取。

所述提取宏基因组DNA的方法具体可为：

(1)将5g所述土壤样本悬浮于3ml TENP缓冲液后涡旋震荡10min，12000rpm 离心10min，取沉淀；

(2)将步骤(1)的沉淀用TENP缓冲液洗涤三次，然后用PBS缓冲液洗涤1次；

(3)将步骤(2)的沉淀采用Mega Preps PowerMax Soil DNA Isolation Kit 进行宏基因组的提取。

TENP缓冲液由溶质和水组成，pH10；溶质及其在TENP缓冲液中的浓度如下：50mM Tris-HCl、20mM EDTA-Na₂(乙二胺四乙酸钠)、100mM NaCl和0.01g/ml PVPP(交联聚 乙烯吡咯烷酮)。

PBS缓冲液由溶质和水组成，pH7.4；溶质及其在PBS缓冲液中的浓度如下：8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na₂HPO₄和0.24g/L KH₂PO₄。

以上任一所述方法得到的血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落的分子图谱也属于 本发明的保护范围。

本发明还保护以上任一所述方法在构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS 文库中的应用。所述应用的方法具体可为：根据所述分子图谱，选择酶切产物带型不 同(即5种所述限制性内切酶的酶切产物中至少有一种酶切产物带型不同)的所述重 组质粒分别进行测序，得到血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库。

所述应用可用于构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落的系统发育树。所述应 用的具体方法为：将所述测序获得的各个结果通过BLAST程序与GenBank中的ITS基 因序列进行同源性比较，用MEGA 4.1软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离， 用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

以上任一所述方法或所述应用可用于研究血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落。

以上任一所述方法或所述应用可用于人工驯化血红铆钉菇。

本发明还保护一种引物组合物，所述引物组合物由引物ITS1、引物ITS4、引物 RV-M和引物M13-47组成；所述引物ITS1为序列表的序列1所示的DNA片段；所述引 物ITS4为序列表的序列2所示的DNA片段；所述引物RV-M为序列表的序列3所示的 DNA片段；所述引物M13-47为序列表的序列4所示的DNA片段。

所述引物组合物可用于如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落的分子图谱；

(b)构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库；

(c)研究血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落；

(d)人工驯化血红铆钉菇。

所述土壤具体可为血红铆钉菇子实体周围5-15厘米范围内的土壤，优选为血红铆 钉菇子实体下方10cm处的土壤。

因此，本发明提供了构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库的方法。 应用本发明的方法可以构建得到血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库，对于 明确血红铆钉菇子实体生长环境微生物真菌群落结构、遗传、功能多样性具有重要的 意义，并为深入探讨其在血红铆钉菇的人工驯化培养提供重要的信息，具有重要的应 用价值。

附图说明

图1为宏基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；M：1 kb plus DNA ladder；1：宏基因 组DNA。

图2为以各个重组质粒为模板，用RV-M和M13-47组成的引物对进行PCR扩增得 到的各个PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：100 bp DNA ladder；1至93依次对 应93个重组质粒的PCR扩增产物。

图3为各个PCR扩增产物用限制性内切酶Hinf I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；M： 100 bp DNA ladder；1至93依次对应93个重组质粒为模板的PCR扩增产物的酶切产 物。

图4为各个PCR扩增产物用限制性内切酶Hae III酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；M： 100 bp DNA ladder；1至93依次对应93个重组质粒为模板的PCR扩增产物的酶切产 物。

图5为各个PCR扩增产物用限制性内切酶Msp I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；M： 100 bp DNA ladder；1至93依次对应93个重组质粒为模板的PCR扩增产物的酶切产 物。

图6为各个PCR扩增产物用限制性内切酶Taq I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；M： 100 bp DNA ladder；1至93依次对应93个重组质粒为模板的PCR扩增产物的酶切产 物。

图7为各个PCR扩增产物用限制性内切酶Mbo I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；M： 100 bp DNA ladder；1至93依次对应93个重组质粒为模板的PCR扩增产物的酶切产 物。

图8为木霉属的系统发育树。

图9为交链孢霉属和附球菌属的系统发育树。

图10为枝孢霉属、深黄被孢霉属、脉胞菌属、青霉属、毕赤酵母属、掷孢酵母属、 侧耳属的系统发育树。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。大肠杆菌DH10B：购自北京百泰克生物技术有限 公司；产品目录号：DP7501。

TENP缓冲液由溶质和水组成，pH10；溶质及其在TENP缓冲液中的浓度如下：50mM Tris-HCl、20mM EDTA-Na₂(乙二胺四乙酸钠)、100mM NaCl和0.01g/ml PVPP(交联聚 乙烯吡咯烷酮)。

PBS缓冲液由溶质和水组成，pH7.4；溶质及其在PBS缓冲液中的浓度如下：8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na₂HPO₄和0.24g/L KH₂PO₄。

实施例1、构建血红铆钉菇子实体周围土壤真菌群落ITS文库

1、样品的采集

在北京地区海拔790米处(GPS坐标为N4057.186 E11629.923)的血红铆钉菇子 实体下方10cm处采集土壤样本，置于无菌的牛皮纸袋中。

2、土壤样品宏基因组DNA的提取

(1)称取5g步骤1采集的土壤样品悬浮于3ml TENP缓冲液后涡旋震荡10min， 12000rpm离心10min，取沉淀。

(2)将步骤(1)的沉淀用TENP缓冲液洗涤三次，然后加入3ml PBS缓冲液洗涤 1次。

(3)将步骤(2)的沉淀进行宏基因组的提取，宏基因组的提取采用Mega Preps  PowerMax Soil DNA Isolation Kit(Mo Bio，Carlsbad，CA，USA)按说明书操作进行， 最后将宏基因组DNA溶解于2.5ml无菌水中。获得大约10μg的宏基因组DNA。

宏基因组DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳图见图1。

3、PCR扩增ITS区域

以步骤2提取的宏基因组DNA为模板，用ITS1和ITS4组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。

ITS1(上游引物)：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(序列表的序列1)；

ITS4(下游引物)：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(序列表的序列2)。

PCR体系(50μl)中含20ng模板、80pmol上游引物、80pmol下游引物、1×Ex  Taq Buffer(Mg²⁺Plus)、0.2mmol/l dNTP和1.5U Ex Taq DNA聚合酶(Takara，Japan)。

PCR扩增程序：95℃5min(预变性)；30个循环(95℃30s，58℃1min，72℃30s)； 72℃10min；降至4℃结束。

4、获得重组质粒

(1)将步骤3的PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，用购自中科瑞泰生物 技术有限公司的琼脂糖DNA回收试剂盒回收纯化PCR扩增产物(均为690-710bp)。

(2)分别将步骤(1)回收的PCR扩增产物与pMD19-T载体(Takara公司产品， 日本)连接，得到重组质粒库，通过转化大肠杆菌DH10B并挑取单克隆获得各个重组 质粒。获得93个重组质粒，即获得了93个插入pMD19-T载体的DNA片段(依次命名 为M1至M93)。

5、ITS-RFLP

(1)分别以步骤4的各个重组质粒为模板，用RV-M和M13-47组成的引物对(对 应pMD19-T载体)进行PCR扩增(PCR体系和PCR扩增程序同步骤3)，回收各个PCR 扩增产物。

各个PCR扩增产物的1.2％琼脂糖凝胶电泳图见图2。

RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(序列表的序列3)；

M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(序列表的序列4)。

(2)将步骤(1)的各个PCR扩增产物分别用限制性内切酶Hinf I、Hae III、 Msp I、Taq I和Mbo I进行酶切，并将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压为100V， 电流为40mA，电泳时间约3.5h)，见图3至图7。图3对应限制性内切酶Hinf I，显 示获得了147条带。图4对应限制性内切酶Hae III，显示获得了112条带。图5对 应限制性内切酶Msp I，显示获得了133条带。图6对应限制性内切酶Taq I，显示获 得了194条带。图7对应限制性内切酶Mbo I，显示获得了94条带。

6、系统发育分析

根据酶切产物的带型，选择不同的重组质粒(即上述5种限制性内切酶的酶切产 物中至少有一种酶切产物带型不同)。

根据图3至图7，从93个重组质粒中筛选出48个不同的重组质粒，分别对其插 入片段进行测序(委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行)。将各个测序结果提交 到GENBANK核酸序列数据库中与已知序列进行比对，并用MEGA4.1构建系统发育树。 所得序列通过BLAST程序与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比较，用MEGA 4.1 软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离，用Neighbor-Joining法构建系统发 育树，重复抽样1000次分析系统树各分枝的置信度。

测序结果表明，48个重组质粒的48个插入片段中，34个属于木霉属，3个属于枝孢 霉属，2个属于青霉属、2个属于毕赤酵母属、2个属于交链孢霉属、1个属于附球菌属、 1个深黄被孢霉属、1个属于脉孢菌属、1个属于侧耳属、1个属于掷孢酵母属，见表1。

表1各个插入片段的测序结果

  代号   种属  GENBANK登录   代号   种属  GENBANK登录号   M1   木霉  HQ875394   M49   枝孢霉  HQ875429   M3   木霉  HQ875396   M51   木霉  HQ875430   M4   木霉  HQ875397   M52   木霉  HQ875431   M6   木霉  HQ875398   M55   木霉  HQ875434   M8   附球菌  HQ875400   M56   木霉  JF690750   M10   青霉  HQ875402   M57   木霉  HQ875435   M13   枝孢霉  HQ875404   M59   木霉  HQ875436   M14   木霉  HQ875405   M61   木霉  HQ875437   M17   青霉  HQ875407   M65   木霉  HQ875438   M18   深黄被孢霉  JF690748   M66   交链孢霉  HQ875439   M21   木霉  HQ875410   M71   粗糙脉胞菌  HQ875442   M25   木霉  HQ875413   M72   木霉  HQ875443   M27   毕赤酵母  HQ875415   M73   木霉  HQ875444   M28   毕赤酵母  HQ875416   M75   木霉  JF690751   M29   木霉  HQ875417   M77   木霉  HQ875445   M35   木霉  HQ875420   M79   掷孢酵母  HQ875447   M36   木霉  JF690749   M80   木霉  HQ875448   M38   木霉  HQ875421   M81   木霉  JF690752   M39   木霉  HQ875422   M83   木霉  HQ875449

  M41   木霉   HQ875423   M85   枝孢霉   HQ875451   M42   木霉   HQ875424   M86   木霉   HQ875452   M45   侧耳属   HQ875426   M90   木霉   JF690753   M46   木霉   HQ875427   M91   木霉   HQ875455   M48   木霉   HQ875428   M93   交链孢霉   HQ875456

木霉属的系统发育树见图8。交链孢霉属和附球菌属的系统发育树见图9。枝孢霉 属、深黄被孢霉属、脉胞菌属、青霉属、毕赤酵母属、掷孢酵母属、侧耳属的系统发 育树见图10。