渥堆发酵普洱茶中微生物总DNA的提取方法

摘要

本发明涉及了渥堆发酵普洱茶中微生物总DNA的提取方法，该方法包括以下步骤：1)取不同发酵过程中的普洱茶样品；2)对提取的普洱茶样品进行预处理；3)提取预处理后样品中微生物的总DNA；4)将提取的微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测；5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；6)将PCR扩增好的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种渥堆发酵普洱茶中微生物总DNA的提取和检测方法，属于微生物生 态学领域。

背景技术：

普洱熟茶是以云南特有大叶茶[Camellia sinensis(Linn)var.assamica(Masters) Kitamura]的晒青毛茶为原料，在微生物的作用下，经快速的人工渥堆后发酵而成的后 发酵茶类。微生物在普洱茶的渥堆发酵生产过程中起着重要的作用，离开了微生物，普 洱茶的品质和风味将得不到保证，本发明研究了渥堆发酵普洱茶中的优势微生物菌群。

目前渥堆发酵普洱茶中微生物的研究，主要是应用传统微生物分离、纯化、鉴定等 方法。传统的研究方法是首先从特定样品中取样，采用模拟自然环境的各种培养基和条 件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质(形态学、生理 生化反应和细胞组成成分结构的观察)进行观察收集，同时进行一系列繁杂的形态特征和 生理生化实验，才能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。

应用传统方法可以分离培养的微生物不一定是优势菌群，只是它们适合并能够在人 工培养条件下被分离纯化，不能动态反映大曲微生物菌群的生长状态。在实验技术上， 普洱茶微生物研究仍停留在细胞水平，主要研究细菌、霉菌、酵母和放线菌单一的菌落 形态和纯种的生长特性。在实验结果上，不能反映分离物间的系统发育关系，不能获得 微生物多样性的真正概貌。因此传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观 认识，对于人们正确认识微生物群落结构与功能，正确认识微生物资源，正确开发并利 用这些资源造成了严重的障碍。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突 变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的 位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE) 中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性 剂(尿素和甲酞胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电 泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停 止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)自1993年以来被用于环境微生物领域来研究 环境样品中微生物的群落结构，它是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的 16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因区间的DNA片断的扩 增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同 一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将 它们分离开，这就为后续的进一步研究提出了新的问题。由于变性梯度凝胶电泳 (DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所以PCR-DGGE 可以对环境样品中的微生物群落进行研究。

然而渥堆发酵普洱茶与城市污水厂污泥和农田土壤的化学、物理性质高度异质，微 生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成 分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行渥堆发酵普洱茶微生物 群落构成研究的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是公开一种提取渥堆发酵普洱茶中微生物总DNA的方法。本发明根据 普洱茶渥堆发酵的特性，结合土壤、污泥样品微生物DNA提取方法，摸索出一种适用于 提取渥堆发酵普洱茶微生物总DNA的方法。得到的微生物总DNA能全面的包括在普洱茶 发酵过程中的微生物种类，能克服传统微生物分离技术不能得到不可培养微生物的缺陷。

本发明提供一种从渥堆发酵普洱茶中提取分离微生物总DNA的方法，该方法包括以 下步骤：

1)取不同发酵过程中的普洱茶样品；

2)对提取的普洱茶样品进行预处理；

3)提取预处理后样品中微生物的总DNA；

4)将提取的微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，得到扩增后的总 DNA；

其中，步骤1中所述不同发酵过程为：在普洱茶渥堆发酵过程中以每次翻堆为时间 点取堆中不同空间位置的茶叶样品。

步骤2中所述预处理包括：取茶叶样品，使用液氮冷冻研磨得到粉末。

步骤3中所述的提取方法如下：预处理的样品，使用Omega soil DNA提取试剂盒 进行提取，操作步骤根据试剂盒的说明进行。

步骤5中所述的专用引物为：

第一步扩增采用的引物为16s1：

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

第二步扩增采用的引物为338fGC：

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3’和R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

以上引物由上海英骏生物技术公司合成。PCR反应体系为37uLddH2O，5uL 10 *反应缓冲液，2uL PCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模 板。PCR扩增程序为：起始94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃引物复性 45s，72℃引物延伸90s，30个循环：72℃终延伸10min。得到大曲微生物PCR扩 增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓冲液为1xTAE缓冲液。

步骤4中所述的琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于确定总DNA的谱图，所用方法采 用常规技术，包括制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为30％～60％。使用的 电泳缓冲液为1xTAE，电压150V，60℃，电泳8h，sybrgreen染色20min。得琼脂 糖凝胶电泳图谱，通过该图可分析比较渥堆发酵普洱茶微生物种群多样性程度。

本发明具体的操作步骤见实施例。

本发明的优点如下：

1、本发明可以用于得到普洱茶渥堆发酵过程中的所有微生物种类的总DNA

2、实验耗时短，得到的微生物总DNA可排除茶叶中众多的复杂化合物的干扰，无需 纯化可直接用于后续的生产和研究。

附图说明：

图1提取的总DNA的琼脂糖凝胶电泳图

图2PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图3DGGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图

具体实施方式：

实施例1

对的渥堆发酵普洱茶进行取样，取不同翻堆次数和不同堆放位置的渥堆发酵普洱茶， 对细菌的种群结构分析和优势菌群的确定步骤如下

1)取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠。 使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液， 高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液， 混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min。上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍 异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution  buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均匀， 室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带 有深色物质重复加入HTR溶液处理。加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将 所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管。 加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收 集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出 液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集 管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一个新的离心管中， 加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min。将离心洗脱 液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测

2)PCR扩增及产物检测，第一步扩增采用的引物为16s1：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。第 二步扩增采用的引物为：338fGC：

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3’和R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

由上海英骏生物技术公司合成。PCR反应体系为37uLddH2O，5uL 10*反应缓冲液， 2uLPCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模板。PCR扩增程 序为：起始94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延 伸90s，30个循环：72℃终延伸10min。得到大曲微生物PCR扩增产物，用1％ 的琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓冲液为1xTAE缓冲液。

3)DGGE电泳分离：制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度提高为30％～60％。 使用的电泳缓冲液为1xTAE，电压150V，60℃，电泳8h，sybrgreen染色20min。 得DGGE图谱，见图3DGGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图。通过该图可分析比较渥堆发 酵普洱茶微生物种群多样性程度。