基因工程菌、用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用

摘要

基因工程菌、用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用.本发明公开一种基因工程菌，该基因工程菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；是通过PCR技术从环境基因组文库中筛选获得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7强启动子的PET28质粒中，化学转化导入大肠杆菌BL21中，获得高效表达AdoHcyase的基因工程菌。本发明还公开了利用上述基因工程菌制备水解酶的方法及水解酶的应用。本发明的水解酶具有Km值为0.009±0.0009mmol/L，远低于其他方式获得的AdoHcyase相应Km，而且该重组AdoHcyase生产方法简单，产量较高的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及的是一种基因工程菌及其表达制备重组S-腺苷同型 半胱氨酸水解酶的生产方法，以及该酶酶学性质的测定和在L-同型半胱氨酸检测试剂盒 中的应用，具体为基因工程菌、用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶 的应用。

背景技术

同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸-4-巯基丁酸，也称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸， 参与甲硫氨酸的代谢过程，可被甲基化生产蛋氨酸，或被转硫化作用生成半胱氨酸，是 蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，并可释放到血液中。它涉及亚甲基四氢 叶酸还原酶、胱氨醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶等多种代谢调节酶；也涉及调节酶的多 种辅助因子如叶酸、维生素B6和维生素B12。当上述酶基因突变或辅助因子缺乏，会 导致甲硫氨酸的代谢产物Hcy的转化受阻，使血浆中Hcy水平升高。目前研究认为， Hcy水平的升高与心、脑血管及周围血管动脉粥样硬化病变有关，并与老年痴呆、肾功 能衰竭、流产及糖尿病早亡有关，所以Hcy的体外检测具有重要的临床价值，可用于预 测脑血管疾病发生的危险性。

目前检测血浆中Hcy的方法很多，主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附 法(ELISA)。HPLC法操作复杂、耗时且费用较高；ELISA法操作方便、快捷、重复性 好，但是大部分操作仍需手工操作，不适合临床大批量标本同时测定。目前循环酶法测 定高半胱氨酸(Hcy)容易自动化，测定时间短，可以在自动生化分析仪上进行，测定 灵敏度高。该方法利用的主要技术原理利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(AdoHcyase) 在三乙羧乙基膦(TECP)作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型Hcy，游离型Hcy 与共价底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)催化反应形成蛋氨酸和S腺苷同型半胱氨酸 (AdoHcy)。AdoHcy被AdoHcyase水解成腺苷(Ado)和Hcy，生成物Ado立即水解 为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的Hcy 的浓度与NADH的变化成正比。

AdoHcyase在Hcy的循环酶法检测中具有重要的作用，然而目前现有的AdoHcyase 催化AdoHcy水解反应的Km值偏高，生产方法繁琐，导致在试剂盒配方中，所需酶量 偏多，试剂盒成本偏高，一定程度上限制了循环酶法在Hcy检测中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种基因工程菌。

该基因工程菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.5654，保藏日期：2011.12.26，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，该工程菌是通过PCR技术从环境基因组文库中筛选获得一高活性的S-腺苷高半胱 氨酸水解酶(AdoHcyase)基因，插入到含有T7强启动子的PET28质粒中，化学转化 导入大肠杆菌BL21中，获得高效表达AdoHcyase的基因工程菌。

上述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID.No.1所示核苷酸序列和由上述 核苷酸序列编码的如SEQ ID.No.2所示的氨基酸序列。

该基因工程菌菌株的典型培养特征为：形态特征：菌落乳白色，圆形，菌落边缘整 齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。

生理生化特征：具有大肠杆菌的生理生化特性，同时插入了AdoHcyase基因，具有 高效表达AdoHcyase特性。

本发明上述的基因工程菌是这样获得的：

(1)用提取试剂盒从环境中直接提取总DNA，并克隆到载体PUC18上，构建环境基 因组文库；

(2)根据AdoHcyase基因序列设计引物，两条引物分别为：

上游：5’-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3’

下游：5’-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3’

(3)应用如上所述引物，应用PCR方法从环境基因组DNA文库中大量筛选克隆， 扩增获得1.2kb的AdoHcyase基因片段，并通过测序，确定获得的片段具有如SEQ ID.No. 1所示核苷酸序列和SEQ ID.No.2所示氨基酸序列；通过BLAST比对，与报道的嗜酸 热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的AdoHcyase基因具有98％的同源性；

(4)步骤(3)扩增产物利用回收试剂盒纯化回收，回收片段，经amH I和Nco I 双酶切的PET28质粒，形成粘性末端，并于同样酶切的PET28质粒，T4连接，将 AdoHcyase基因片段插入到T7启动子的下游，获得含有AdoHcyase基因的质粒PET28；

(5)将步骤(4)获得的质粒通过化学转化，转入大肠杆菌BL21中，涂布含有50～ 100mg/L卡拉霉素(Kana)抗性的LB平板上，筛选含有转化子的阳性菌落；

(6)培养步骤(5)所得菌落，提取质粒，PCR扩增，电泳分析，确定阳性菌落含有 AdoHcyase编码基因的质粒PET28；

(7)通过如上步骤，即获得基因工程菌，该工程菌含有AdoHcyase编码基因，能 够表达高活性的AdoHcyase。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种上述基因工程菌培养诱导表达纯化获 得重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，制备步骤包括：

(1)将保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为大肠埃希 氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.5654，保藏日期：2011.12.26的基因 工程菌接入到含有50～200mg/L卡拉霉素(Kana)的2YT或LB液体培养基中，10～37 ℃培养至OD₆₀₀为0.4～0.8时，然后加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(终浓度即加入后 在液体培养基中的浓度)IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，10～37℃继 续培养18～32h；

或将基因工程菌直接接入到乳糖自诱导培养基中，乳糖含量为0.1～10％(质量体积 浓度即0.1～10g/100ml)，10～37℃培养24～72h；

(2)将步骤(1)所得培养液于5000～10000rpm离心20～40min，收集菌体，加入 菌体体积1～20倍、pH6.5～8.0的磷酸缓冲液，破碎菌体；破碎后在10000～18000rpm 离心20～50min，收集上清液，过阳离子交换树脂，用0～500mmol/L浓度不同梯度NaCl 盐溶液洗脱；或者过疏水层析，用0～400mmol/L浓度不同梯度NaCl盐溶液洗脱，分部 收集，回收含有酶活的部分；

(3)在收集含有酶活溶液中加入终浓度为0.1～5％(质量体积浓度即0.1～ 5g/100ml)的保护剂，然后置于-20℃预冷10～50h，再在-40～-60℃、30～100Pa下冷 冻干燥24～72h，得到酶制剂即含有重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的酶制剂。

本发明步骤(3)中的保护剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一种 或两种。

为了提高酶产量，简化纯化步骤，将该基因克隆到大肠杆菌中进行表达，从而应用 于同型半胱氨酸检测试剂盒，降低试剂盒的生产成本。

所获的重组AdoHcyase的酶学性质测定是通过以下方法实现的：

在反应体系中，加入0.01mmol/L的水解反应底物AdoHcy，加入一定量重组 AdoHcyase，测定酶催化底物水解生产腺苷(Ado)的量来确定酶活。一个酶活单位定 义为在最适pH、37℃条件下，催化1μmol AdoHcy水解生成腺苷(Ado)和L-同型半胱 氨酸(L-Hcy)。

腺苷的量是通过高效液相色谱法(HPLC)测定的，HPLC测定条件为：柱子：C18 反相柱，洗脱液：水∶甲醇＝95∶5(体积比)，含有1mol/L醋酸钠，pH为4.5，流速： 1ml/min，检测波长：260nm，以0.01～0.1mmol/L的腺苷作为外标，获得反应体系中生 产腺苷的量。

最适温度的测定为在pH 7.2的120mmol/L磷酸钾缓冲液中，加入2mM EDTA、 0.01mmol/L AdoHcy，分别孵育至30、35、40、45、50、55、60、65℃，加入一定量的 酶制剂，反应10min，立即加入50μl 5N HCLO₄，终止反应。取20μl反应液，HPLC分析 反应产物腺苷的量。得到最适温度为55℃。

最适pH值测定是在pH分别为6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8的100mmol/L 磷酸钾缓冲液加入2mM EDTA、0.01mmol/L AdoHcy，孵育至37℃，加入一定量的酶制剂， 37℃反应10min，立即加入50μl 5N HCLO₄，终止反应。取20μl反应液，HPLC分析反应 产物腺苷的量。得到最适pH值为7.2。

Km值测定是在100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，加入2mM EDTA，然后分成十份， 每份1ml，分别加入0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.004、0.003、0.002、 0.001mmol/L AdoHcy，孵育至37℃，加入一定量的酶制剂，反应10min，立即加入50μl 5N HCLO₄，终止反应。取20μl反应液，HPLC分析反应产物腺苷的量，测定反应速度，利 用origin8.0软件耦合曲线。获得Km值为0.009±0.0009mmol/L。

本发明通过PCR技术从环境中大量筛选获得一AdoHcyase基因片段，其中核苷酸 编码序列含有1248个碱基对，通过BlAST比对，发现它与报道的嗜酸热硫化叶菌 (Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的AdoHcyase基因具有98％的同源性，只有21 个碱基序列不同。编码的氨基酸与前者有13处不同，其中25位Met→Lys，58位Val →Asp，94位His→Arg，156位Lys→His，281位Met→Thr，309位Thr→Ser，314位 Gln→Asn，332位Asp→Glu，365位Lys→His，375位Tyr→Trp，378位Pro→Ser，392 位Ala→Gly，395位Ile→Leu。氨基酸序列的不同导致该酶空间结构和活性位点发生变 化，促使该酶催化水解反应具有不同的特性。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明的重组AdoHcyase催化S-AdoHcy水解反应的Km值为0.009± 0.0009mmol/L，远低于其他方式如从菠菜叶中的提取的AdoHcyase相应Km值为0.041 mM、黄花羽扇豆提取的AdoHcyase相应Km值为0.011mM获得的AdoHcyase相应Km， 而且该重组AdoHcyase生产方法简单，产量较高。

2.本发明获得的重组AdoHcyase催化水解反应活性强，特异性好，抗干扰能力强， 并且在大肠杆菌得到高效表达，纯化方式简单，可以大规模生产，可以减少在Hcy检测 试剂盒中的用量，缩短反应时间，降低了试剂盒生产成本，有利于同型半胱氨酸酶法检 测的推广。

3.本发明将所获基因插入到含有T7强启动子的PET28的质粒中，并导入到大肠 杆菌中，构建产AdoHcyase的大肠杆菌基因工程菌。所获基因工程菌在IPTG或乳糖诱 导下能够高效的表达AdoHcyase，经过疏水纯化或阳离子交换树脂纯化，获得纯酶，并 制备成酶干粉。所述的基因工程菌表达制备AdoHcyase的方法简单，表达量稳定，可以 进行产业化扩大，生产试剂盒所需的大量酶源，广泛应用于L-同型半胱氨酸检测试剂盒 中。

本发明上述的基因工程菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为 CGMCC No.5654，保藏日期：2011.12.26，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例：

实施例1：

根据文献中发表的AdoHcyase基因序列，设计引物序列：

正向引物：5’-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3’

反向引物：5’-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3’

应用上述引物，利用PCR方法从环境基因组文库中大量筛选克隆 PCR反应体系：

加双蒸水至100μl；

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min， 4℃；

取PCR产物10μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，发现有1.2kb的产物条带，用DNA回收试 剂盒回收该条带，对该条带进行测序，并通过测序，确定获得的S-腺苷高半胱氨酸水解 酶基因具有SEQ ID.No.1所示核苷酸序列和SEQ ID.No.2所示氨基酸序列。通过 BLAST比对，与报道的嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的 AdoHcyase基因具有98％的同源性。

实施例2：将实施例1中获得的片段，与经BamH I和Nco I双酶切的PET28质粒进 行连接，获得带有该片段的PET28质粒。

酶切反应体系为：

2×buffer 10μl、

质粒 2μl、

BamHI 1μl、

NcoI  1μl、

双蒸水 6μl

酶切反应条件：37℃，14～24h

连接反应体系为：

2×buffer 10μl、

质粒 1μl、

回收片段 1μl、

T4 1μl

双蒸水 7μl

连接反应条件：37℃，14～24h。

将获得的PET28质粒导入大肠杆菌BL21中；转化条件为50μl感受态细胞加入2μl 质粒，冰浴30min，42℃热击90s，然后涂布含100mg/L Kana抗性LB平板，37℃过夜 培养，挑选阳性克隆，即获得含有AdoHcyase基因的大肠杆菌基因工程菌(保藏在中国 微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏 编号为CGMCC No.5654，保藏日期：2011.12.26的)。

实施例3：将实施例2得到的菌株从平板上接种到含有100mg/L Kana的2YT液体培 养基中，37℃振荡培养8h，在细胞密度达到OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.6mmol/L的 IPTG，30℃培养20h后，停止培养；9000rpm离心20min收集菌体，pH7.2的200mmol/L 磷酸盐缓冲液清洗菌体1次，加5倍缓冲液破碎菌体，10000rpm离心50min，收集上 清液，过阳离子交换树脂，先用50mmol/L NaCl浓度洗脱，然后分别用100、200、 300mmol/L的NaCl浓度洗脱，收集浓度为200mmol/L浓度的NaCl洗脱部分，SDS凝胶 电泳，鉴定为纯酶。

实施例4：将实施例2得到的菌株从平板上接种到含有200mg/L Kana的LB液体培 养基中，25℃振荡培养10h，在细胞密度达到OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.3mmol/L 的IPTG，24℃培养32h后，停止培养；10000rpm离心20min收集菌体，pH7.8的200mmol/L 磷酸盐缓冲液清洗菌体2次，加3倍缓冲液破碎细胞，12000rpm离心30min，收集上清 液，过疏水层析柱，分别用400、300、200、100mmol/L NaCl浓度洗脱，收集200mmol/L 浓度的NaCl洗脱部分，SDS凝胶电泳，鉴定为纯酶。

实施例5：将实施例2得到的菌株从平板上接种到含有50mg/L Kana的乳糖自诱导 液体培养基中，培养基的组成为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％葡萄糖、4％乳糖、 0.6％NaCl，37℃振荡培养48h，停止培养，10000rpm离心40min收集菌体，pH6.0的 200mmol/L磷酸缓冲液清洗菌体2次，加20倍缓冲液破碎细胞，10000rpm离心60min， 去除沉淀，将上清液过疏水层析柱，分别用400、300、200、100mmol/L NaCl浓度洗脱， 收集200mmol/L NaCl浓度的洗脱部分，SDS凝胶电泳，鉴定为纯酶。

实施例6：将实施例3、4、5所得的纯酶，加入终浓度为5％聚乙二醇、1％甘油，-20 ℃预冷50h；然后在冷阱温度为-40℃，压力为100Pa下冷冻干燥24h，得到重组AdoHcyase 酶制剂。

实施例7：将实施例3、4、5所得的纯酶，加入终浓度为2％海藻糖，-20℃预冷36h； 然后在冷阱温度为-50℃，压力为30Pa下冷冻干燥50h，得到重组AdoHcyase酶制剂。

实施例8：将实施例6、7获得的重组AdoHcyase酶制剂，测定最适反应温度，测 定方法如下：

在pH 7.2的120mmol/L磷酸钾缓冲液中，加入2mM EDTA、0.01mmol/L AdoHcy，分 别孵育至30、35、40、45、50、55、60、65℃，加入一定量的酶制剂，反应10min，立 即加入50μl 5N HCLO₄，终止反应。取20μl反应液，HPLC分析反应产物腺苷的量。HPLC 测定条件为：柱子：C18反相柱，洗脱液：水∶甲醇＝95∶5，含有1mol/L醋酸钠，pH 为4.5，流速：1ml/min，检测波长：260nm，以0.1mmol/L的腺苷作为外标，测定反应 体系中生成腺苷的量。求出不同温度条件下的反应速度和相对酶活如表1：

表1：不同温度下，AdoHcyase催化AdoHcy水解反应速度

实施例9：将实施例6、7获得的重组AdoHcyase酶制剂，测定最适反应pH，测定 方法如下：

在pH分别为6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8的100mmol/L磷酸钾缓冲 液加入2mM EDTA、0.01mmol/L AdoHcy，孵育至37℃，加入一定量的酶制剂，37℃反应 10min，立即加入50μl 5N HClO₄，终止反应。取20μl反应液，HPLC分析反应产物腺苷 的量。HPLC测定条件为：柱子：C18反相柱，洗脱液：水∶甲醇＝95∶5，含有1mol/L 醋酸钠，pH为4.5，流速：1ml/min，检测波长：260nm，以0.05mmol/L的腺苷作为外标， 测定反应体系中生成腺苷的量。求出不同pH条件下的反应速度和相对酶活如表2：

表2：不同pH下，AdoHcyase催化AdoHcy水解反应速度

实施例10.将实施例6、7获得的重组AdoHcyase酶制剂，测定催化S-AdoHcy水 解反应的Km值，测定方法如下：

在100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，加入2mM EDTA，然后分成十份，每份1ml， 分别加入0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001mmol/L AdoHcy，孵育至37℃，加入一定量的酶制剂，反应10min，立即加入50μl 5N HCLO₄，终 止反应。取20μl反应液，HPLC分析反应产物腺苷的量。HPLC测定条件为：柱子：C18 反相柱，洗脱液：水∶甲醇＝95∶5，含有1mol/L醋酸钠，pH为4.5，流速：1ml/min， 检测波长：260nm，以0.05mmol/L的腺苷作为外标，测定反应体系中生成腺苷的量。求 出不同底物浓度下的反应速度，如表3。通过origin8.0软件耦合作图，获得Km值为 0.009±0.0009mmol/L。

表3：不同AdoHcy底物浓度下，AdoHcyase催化AdoHcy水解反应速度

从上述实施例可知，本发明的酶催化AdoHcy水解反应的Km为0.009± 0.0009mmol/L，最适反应温度为55℃，最适反应pH为7.2。酶活的定义：在pH7.2、37 ℃条件下，1min催化1μmol AdoHcy水解生成腺苷和L-同型半胱氨酸为1个酶活单位； 所得的AdoHcyase酶制剂可以应用于L-同型半胱氨酸检测试剂盒中，检测试剂盒所需 AdoHcyase酶量少，生产成本低。