具有提高的5＇-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物及使用该微生物产生核酸的方法

摘要

本发明涉及具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物以及产生5′-肌苷酸的方法，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加，所述产生5′-肌苷酸的方法包括培养具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物的步骤。

说明书

技术领域

本发明涉及具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物以及产生 5′-肌苷酸的方法，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比 内在表达水平增加，产生5′-肌苷酸的方法包括培养具有提高的5′-肌苷 酸生产力的棒状杆菌属微生物的步骤。

背景技术

核酸类物质之一的5′-肌苷酸(5′-inosinic acid)是核酸生物合成代谢 系统的中间物质，其不仅在动植物体内起到重要的生理作用，还应用 于食品、医药品以及其他多种医疗用途中。尤其，将5′-肌苷酸与谷氨 酸单钠(MSG)一起使用时具有协同提味效果，从而其是作为精味性调 味料而备受瞩目的核酸类调味料之一。

制造5′-肌苷酸的方法包括：对于从酵母细胞提取的核糖核酸进行 酶促分解的方法(日本专利公开公报第1614/1957号等)；将通过发酵所 产生的肌苷以化学方法磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.，36，1511(1972) 等)；以及培养能够产生5′-肌苷酸的微生物并回收积聚在培养基中的 肌苷一磷酸(IMP)的方法等。目前使用的最多的方法为利用微生物来产 生5′-肌苷酸的方法。棒状杆菌(Corynebacterium)属菌株被广泛地用作 产生5′-肌苷酸的微生物，例如，公开了培养产氨短杆菌菌株来产生5′- 肌苷酸的方法(韩国专利公开第2003-0042972号)等。

为了提高利用微生物来产生5′-肌苷酸的产量，通过增加或者降低 参与5′-肌苷酸的生物合成途径或者分解途径的酶的活性或者表达来 开发菌株。韩国专利第785248号公开了其中编码嘌呤生物合成途径加 上的磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因purC被超表达的 微生物及利用该微生物产生5′-肌苷酸的方法。此外，韩国专利第 857379号公开了其中purKE编码的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶被超表达 的产氨短杆菌菌株与使用该产氨短杆菌菌株来高产地产生高浓度的 IMP的法。

但是依然存在对于开发能够以更高的产量产生5′-肌苷酸的菌株 与利用其产生5′-肌苷酸的方法的需求。

对此，本发明的发明人进行研究以开发能够以高生产力产生5′- 肌苷酸的菌株，发现将参与嘌呤生物合成途径的主要酶的活性同时提 高为相比内在活性更高时5′-肌苷酸的生产力得以提高的现象，从而完 成了本发明。

发明内容

本发明提供具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物。

本发明的另一目的在于提供利用具有提高的5′-肌苷酸生产力的 棒状杆菌属微生物来产生5′-肌苷酸的方法。

为了达到如上所述的目的，本发明提供具有产5′-肌苷酸的生产力 的棒状杆菌属微生物，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平 相比内在表达水平增加。

本发明的棒状杆菌属微生物的编码嘌呤生物合成酶的基因的表达 水平相比内在表达水平增加，从而具有相比母株提高的5′-肌苷酸生产 力。

在本发明中，“嘌呤生物合成酶”是指对于将嘌呤碱基作为最终产 物生成的嘌呤生物合成途径中的反应进行催化的酶，包含：磷酸核糖 焦磷酸氨基转移酶、磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶、磷酸核糖甲酰甘氨 脒合成酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II、磷酸核糖氨基咪唑合成酶、 磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶、 肌苷酸环式水解酶、磷酸核糖焦磷酸激酶等。

在本发明的一具体实例中，嘌呤生物合成酶可以是磷酸核糖焦磷 酸激酶与选自以下的一种或多种酶的组合：磷酸核糖焦磷酸氨基转移 酶、磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶、磷酸 核糖甲酰甘氨脒合成酶II、磷酸核糖氨基咪唑合成酶、磷酸核糖氨基 咪唑羧化酶、磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶和肌苷酸环式水 解酶。

在本发明的一具体实例中，表达水平相比内在水平增加的编码嘌 呤生物合成酶的基因可以是下述基因的组合：编码磷酸核糖甘氨酰胺 转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨 脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨 脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪 唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪 唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷 酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖 焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。

在本发明的一具体实例中，表达水平相比内在水平增加的编码嘌 呤生物合成酶的基因可以是下述基因的组合：编码磷酸核糖焦磷酸氨 基转移酶的基因，即SEQ ID NO.35的purF；编码磷酸核糖甘氨酰胺 转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨 脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨 脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪 唑合成酶的基因，即SEQ ID NO.39的purM；编码磷酸核糖氨基咪唑 羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑 琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸 环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦 磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。

在本发明中“相比内在表达水平增加”是指，以与在微生物中天然 表达的水平或者在母株中表达的水平相比更高的量表达的现象，包括： 编码该酶的基因的数量(拷贝数量)的增加以及由此引发的表达水平的 增加或者由于基因突变而引起表达水平的增加或者由这两种引起的表 达水平的增加。

在本发明的一具体实例中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水 平的增加包括：从外部额外导入该基因到菌株或扩增内在基因从而使 得基因的拷贝数量增加，或者由于导入到转录或者翻译控制序列的变 异从而使转录效率或者翻译效率增加的情况，但是并不限于此。根据 本领域的公知技术，可以简单地完成内在基因的扩增，例如，在适当 的选择性压力下培养的方法等。

在本发明的一具体实例中，可以通过从细胞外部额外导入编码嘌 呤生物合成酶的基因或者扩增编码嘌呤生物合成酶的内在基因来增加 所述编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平。

在本发明的一具体实例中，在具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状 杆菌属微生物中，通过从外部导入编码嘌呤生物合成酶的基因的除了 相应的内在基因之外的一个以上的拷贝，从而表达水平相比内在水平 增加的编码嘌呤生物合成酶的基因可以存在两个以上的拷贝。

在本发明的一具体实例中，在具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状 杆菌属微生物中，将编码嘌呤生物合成酶的基因从外部导入是通过利 用重组载体的转化实现的，所述重组载体包含连续排列的相应基因的 两个拷贝。

在本发明的一具体实例中，根据导入的基因，制备具有提高的5′- 肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物所使用的重组载体可以选自分别具 有图2至图7的酶切图谱的pDZ-2purFM、pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、 pDZ-2purKE、pDZ-2purC以及pDZ-2prs。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以来自能够产生5′-肌苷酸的棒状杆菌微生物。例如，根 据本发明的具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以来 自：产氨短杆菌ATCC6872、嗜热产氨棒状杆菌 (thermoaminogenes)FERM BP-1539、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、黄色 短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳糖发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869以及由此制备的菌株。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个以上拷贝。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以是产氨短杆菌，更优选地，可以为转化的产氨短杆菌， 所述转化的产氨短杆菌是将prs基因与一种以上选自purF、purN、purS、 purL、purM、purKE、purC和purH的的基因的组合的内在活性增加 从而高浓度地产生5′-肌苷酸的产氨短杆菌。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以是下述的菌株：向产生5′-肌苷酸的产氨短杆菌 CJIP2401(KCCM-10610)菌株依次或者组合导入分别具有图2、图3、 图4、图5、图6和图7的酶切图谱的重组载体pDZ-2purFM、重组载 体pDZ-2purNH、重组载体pDZ-2purSL、重组载体pDZ-2purKE、重 组载体pDZ-2purC、重组载体pDZ-2prs，所导入的purF、purN、purS、 purL、purM、purKE、purC、purH和prs基因的两个拷贝中的一个根 据同源重组而置换相应的内在基因，从而，purF、purN、purS、purL、 purM、purKE、purC、purH个和prs基因的每个能够以分别两个拷贝 插入到染色体内。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以是包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个拷贝的产氨 短杆菌，优选地，可以是产氨短杆菌CN01-0120，所述编码嘌呤生物 合成酶的基因可以是选自下述基因的组合：编码磷酸核糖甘氨酰胺转 甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒 合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒 合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪唑 羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑 琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸 环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦 磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。

在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆 菌属微生物可以是包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个拷贝的产氨 短杆菌，优选地，可以是产氨短杆菌CN01-0316(KCCM 10992P)，所 述编码嘌呤生物合成酶的基因可以是选自下述基因的组合：编码磷酸 核糖焦磷酸氨基转移酶的基因，即SEQ ID NO.35的purF；编码磷酸 核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸 核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸 核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷 酸核糖氨基咪唑合成酶的基因，即SEQ ID NO.39的purM；编码磷酸 核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸 核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC； 编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码 磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。

并且，本发明提供产生5′-肌苷酸的方法，包括：培养具有5′-肌苷 酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中编码嘌呤生物合成酶的基因的表 达水平相比内在表达水平增加；以及从所述培养基中回收5′-肌苷酸。

在本发明的产生5′-肌苷酸的方法中，用于培养棒状杆菌属微生物 的培养基和其他培养条件可以与通常用于培养棒状杆菌属微生物的培 养基和其他培养条件相同，所属技术领域的技术人员能够简单地选择 并调整。并且，培养方法也可以使用所属技术领域中公知的任意的培 养方法，例如可以使用分批培养、连续培养以及流加培养方法等，但 是并不限于此。

在本发明的一具体实例中，具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微 生物可以是产氨短杆菌。

在本发明的一具体实例中，具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微 生物可以是产氨短杆菌CN01-0120或者产氨短杆菌CN01-0316(KCCM  10992P)。

在本发明的一具体实例中，培养棒状杆菌属微生物的步骤通过下 述方式完成：有氧条件下，在包含适当的碳源、氮源、氨基酸、维生 素等的常规培养基内通过调整温度、pH等来培养菌株。

作为碳源则可以使用如葡萄糖、果糖等碳水化合物，作为氮源则 可以使用如氨、氯化铵、硫酸铵等各种无机氮源以及蛋白胨、NZ-胺、 肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、干酪素水解物、鱼类或者其降解 产物、脱脂大豆饼或者其降解产物等有机氮源。作为无机化合物则可 以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙 等，除此之外，根据需求可以添加维生素与营养缺陷型碱基等。

培养是在有氧条件下实施的，例如，根据震荡培养或者通气搅拌 培养，优选为在28至36℃的温度下实施。优选地，培养基的pH在 培养期间维持在6至8的范围。培养可以实施4至6天。

下面通过实施例进一步详细地说明本发明。但是，实施例仅是示 例性地示出本发明，因此不能解释为实施例对本发明的范围加以限制。

发明效果

根据本发明，利用具有5′-肌苷酸的生产力的棒状杆菌属微生物能 够以高浓度以及高产量产生5′-肌苷酸并因此能够降低成本，其中编码 参与嘌呤生物合成的主要酶的基因的表达水平相比内在表达水平增 加。

附图说明

图1图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ 载体；

图2图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purFM；

图3图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purNH；

图4图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purSL；

图5图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purKE；

图6图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purC；

图7图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2prs。

实施例

实施例1.利用用于插入染色体的载体(pDZ)插入嘌呤生物合成基 因以及根据该插入开发5′-肌苷酸高产菌株

为了向产氨短杆菌菌株的染色体插入外源基因，利用了包含该基 因的两个连续拷贝的基于pDZ的重组载体。pDZ载体是用于插入棒状 杆菌属微生物的染色体内的载体，根据韩国专利公开第2008-0025355 号中公开的方法来制备pDZ载体，通过引用将其并入本文。图1简要 地图示了pDZ载体的结构。

在下述的(1)至(6)中，制备了能够用于将编码嘌呤生物合成酶的基 因插入棒状杆菌属微生物的染色体内从而将每个基因的拷贝数量增加 为2个的重组载体。如下所述地进行各个重组载体的转化以及选择转 化体。

通过电穿孔法(electroporation)用重组pDZ载体转化产5′-肌苷酸的 菌株，即产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)之后，从含有25mg/l 卡那霉素(kanamycin)的选出培养基中选出其中载体内的基因通过同源 重组而插入染色体内的菌株，所述重组pDZ载体包含编码所需嘌呤生 物合成途径上的酶的基因。在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳 糖苷)的固体培养基(肉汁为1％、酵母提取物为1％、蛋白胨为1％、氯 化钠为0.25％、腺嘌呤为1％、鸟嘌呤为1％、琼脂糖为1.5％)中，根 据菌落颜色确认载体向染色体内成功的插入。即，将蓝色菌落作为载 体插入染色体内的转化体而选出。在营养培养基(葡萄糖为1％、肉汁 为1％、酵母提取物为1％、蛋白胨为1％、氯化钠为0.25％、腺嘌呤为 1％、鸟嘌呤为1％)中振荡培氧(30℃、8小时)由于第一次交换(crossover) 而载体插入染色体内的菌株之后，分别稀释到10^-4-10^-10，以涂抹在含 有X-gal的固体培养基上。选出与大部分菌落带有蓝色相比，以低比 率显现的白色菌落，从而选出了由于第二次交换而将插入至染色体上 的载体序列去除的菌株。通过对抗生素，即卡那霉素的敏感性测试以 及通过PCR的基因结构确认过程，从而将选出的菌株鉴定为最终菌 株。

(1)purFM基因的克隆及重组载体(pDZ-2purFM)的制备

在棒状杆菌属微生物的染色体上，purF基因与purM基因位于接 近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含所述两个基 因与启动子部分的purFM载体。

从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体， 并且将其作为模板进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称 为PCR)而得到purFM，即包含连续排列的purF与purM的片段。聚合 酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)，并且聚合酶链 反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在 53℃下的30秒的退火(annealing)以及在72℃下的2分钟的聚合反应 构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purFM基因 (purFM-A、purFM-B)。将SEQ ID NO.1与2用作引物扩增purFM-A， 将SEQ ID NO.3与4用作引物扩增purFM-B。利用TOPO Cloning Kit (Invitrogen)将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而分别得到了 pCR-purFM-A与pCR-purFM-B载体。使用分别包含在purFM-A与 purFM-B的各个末端的限制性内切酶(purFM-A：EcoRI+XbaI， purFM-B：XbaI+HindIII)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR 载体分离各自的purFM基因。然后，通过3片段连接反应(3-piece  ligation)克隆已用限制性内切酶EcoRI与HindIII处理的pDZ载体，从 而最终制备了连续克隆两个purFM基因的pDZ-2purFM重组载体。图 2是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即 pDZ-2purFM的示意图。

通过电穿孔法用pDZ-2purFM载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产 氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在 purFM基因的位置处额外插入一个purFM基因，从而得到了总拷贝数 增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purFM连接部分的 SEQ ID NO.5与6的引物来最终确认连续插入的purFM基因。

(2)purNH基因的克隆及重组载体(pDZ-2purNH)的制备，purNH插 入菌株的开发

在棒状杆菌属微生物的染色体上，purN基因与purH基因位于接 近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分 的purNH载体。

从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体， 并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purNH，即包含连续排列 的purN与purH的片段。聚合酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA聚 合酶(Stratagene)，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指 由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火(annealing)以 及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动 子部分的两个purNH基因(purNH-A、purNH-B)。将SEQ ID NO.7与 8用作引物扩增purNH-A，将SEQ ID NO.8与9用作引物扩增 purNH-B。利用TOPO Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体 pCR2.1，从而得到了pCR-purNH-A与pCR-purNH-B载体。用分别包 含在purNH-A与purNH-B的各个末端的限制性内切酶(purNH-A： BamHI+SalI，purNH-B：SalI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述 pCR载体分离各自的purNH基因。然后，通过3片段连接反应克隆已 用限制性内切酶BamHI与SalI处理的pDZ载体，从而最终制备了连 续克隆两个purNH基因的pDZ-2purNH重组载体。图3是图示用于插 入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purNH的示意图。

通过电穿孔法用所述pDZ-2purNH载体转化5′-肌苷酸生产菌株， 即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近 内在purNH基因的位置处额外插入一个purNH基因，从而得到了总拷 贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purNH连接部 分的SEQ ID NO.10与11的引物来最终确认连续插入的purNH基因。

(3)purSL基因的克隆及重组载体(pDZ-2purSL)的制备，purSL插入 菌株的开发

在棒状杆菌属微生物的染色体上，purS基因与purL基因位于接近 的距离处，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分的purSL 载体。

从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体， 并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purSL，即包含连续排列 的purS与purL的片段。聚合酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA聚合 酶(Stratagene)，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由 在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下 的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两 个purSL基因(purSL-A、purSL-B)。SEQ ID NO.12与13用作引物扩 增purSL-A，将SEQ ID NO.14与15用作引物扩增purSL-B。利用TOPO  Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了 pCR-purSL-A与pCR-purSL-B载体。用分别包含在purSL-A与purSL-B 的各个末端的限制性内切酶(purSL-A：BamHI+SalI，purSL-B： SalI+BamHI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各 自的purSL。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI 处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purSL基因的 pDZ-2purSL重组载体。图4是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色 体内的载体，即pDZ-2purSL的示意图。

通过电穿孔法用所述pDZ-2purSL载体转化5′-肌苷酸生产菌株， 即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近 内在purSL基因的位置处额外插入一个purSL基因，从而得到了总拷 贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purSL连接部分 的SEQ ID NO.16与17的引物来最终确认连续插入的purSL基因。

(4)purKE基因的克隆及重组载体(pDZ-2purKE)的制备，purKE插 入菌株的开发

在棒状杆菌属微生物的染色体上，purK基因与purE基因位于接 近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分 的purKE载体。

从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体， 并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purKE，即包含连续排列 的purK与purH的片段。聚合酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA聚 合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃ 下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟 的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purKE 基因(purKE-A、purKE-B)。将SEQ ID NO.18与19用作引物扩增 purKE-A，将SEQ ID NO.20与21用作引物扩增purKE-B。利用TOPO  Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了 pCR-purKE-A与pCR-purKE-B载体。用分别包含在purKE-A与 purKE-B的各个末端的限制性内切酶(purKE-A：BamHI+KpnI， purKE-B：KpnI+XbaI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载 体分离各自的purKE基因。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制 性内切酶BamHI与XbaI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆 两个purKE基因的pDZ-2purKE重组载体。图5是图示用于插入棒状 杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purKE的示意图。

通过电穿孔法用所述pDZ-2purKE载体转化5′-肌苷酸生产菌株， 即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近 内在purKE基因的位置处额外插入一个purKE基因，从而得到了总拷 贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purKE连接部分 的SEQ ID NO.22与23的引物来最终确认连续插入的purKE基因。

(5)purC基因的克隆及重组载体(pDZ-2purC)的制备，purC插入菌 株的开发

从产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行 聚合酶链反应而得到purC。聚合酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA 聚合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃ 下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟 的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purC基 因(purC-A、purC-B)。将SEQ ID NO.24与25用作引物扩增purC-A， 将SEQ ID NO.25与26用作引物扩增purC-B。利用TOPO Cloning Kit 将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-purC-A与 pCR-purC-B载体。用分别包含在purC-A与purC-B的各个末端的限制 性内切酶(purC-A：BamHI+SalI，purC-B：SalI)对所述pCR载体进行 处理，从而从所述pCR载体分离各自的purC基因。然后，通过3片 段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI与SalI处理的pDZ载体， 从而最终制备了连续克隆两个purC基因的pDZ-2purC重组载体。图6 是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purC 的示意图。

通过电穿孔法用所述pDZ-2purC载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即 产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内 在purC基因的位置处额外插入一个purC基因，从而得到了总拷贝数 增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purC连接部分的SEQ  ID NO.27与28的引物来最终确认连续插入的purC基因。

(6)prs基因的克隆及重组载体(pDZ-2prs)的制备，prs插入菌株的 开发

从产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行 聚合酶链反应而得到prs。聚合酶则使用了PfuUltra^TM高保真DNA聚 合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃ 下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟 的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个prs基 因(prs-A、prs-B)。将SEQ ID NO.29与30用作引物扩增prs-A，将SEQ  ID NO.31与32用作引物扩增prs-B。利用TOPO Cloning Kit将扩增 产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-prs-A与pCR-prs-B 载体。用分别包含在prs-A与prs-B的各个末端的限制性内切酶(prs-A： BamHI+SpeI，prs-B：SpeI+PstI)对所述pCR载体进行处理，从而从所 述pCR载体分离各自的prs基因。然后，通过3片段连接反应克隆已 用限制性内切酶BamHI与PstI处理的pDZ载体，从而最终制备了连 续克隆两个prs基因的pDZ-2prs重组载体。图7是图示用于插入棒状 杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2prs的示意图。

通过电穿孔法用所述pDZ-2prs载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即 产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内 在prs基因的位置处额外插入一个prs基因，从而得到了总拷贝数增加 至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个prs连接部分的SEQ ID  NO.33与34的引物来最终确认连续插入的prs基因。

(7)通过增强嘌呤生物合成基因开发5′-肌苷酸高产菌株

将(1)至(6)中制备的pDZ-2purFM、pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、 pDZ-2purKE、pDZ-2purC以及pDZ-2prs载体的组合导入产生5′-肌苷 酸的产氨短杆菌CJIP2401菌株。任意选择了载体的导入顺序，导入方 法及鉴定则如上所述。

将产氨短杆菌CJIP2401用作母株，分别用由pDZ-2purNH、 pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC与pDZ-2prs构成的组合以及 曲pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC、pDZ-2purFM 与pDZ-2prs构成的组合实施了转化，从而得到了分别包含编码参与嘌 呤生物合成途径的主要酶的基因的2个拷贝的产氨短杆菌CN01-0120 (2purNH+2purSL+2purKE+2purC+2prs)与产氨短杆菌CN01-0316 (2purNH+2purSL+2purKE+2purC+2purFM+2prs)。

实施例2.重组产氨短杆菌的发酵效价测试

将具有如下所示组成的3ml种子培养基散布到直径为18mm的 试管中并实施高压灭菌之后，接种母株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株 和实施例1中制备的产氨短杆菌CN01-0120以及产氨短杆菌 CN01-0316，并且在30℃温度下震荡培养24小时，以用作种子培养 基。具有如下所示组成的27ml发酵培养基散布到500ml的用于震荡 的锥形烧瓶中，在120℃温度下实施10分钟的高压灭菌之后，接种3 ml的所述种子培养基并培养5至6日。培养条件调节成如下：转数为 200rpm、温度为32℃、pH值为7.2。

所述种子培养基以及发酵培养基的组成如下。

种子培养基：葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、肉汁为1％、酵母提 取物为1％、氯化钠为0.25％、腺嘌呤为100mg/l、鸟嘌呤为100mg/l、 pH为7.2。

烧瓶发酵培养基：谷氨酸钠为0.1％、氯化铵为1％、硫酸镁为1.2％、 氯化钙为0.01％、硫酸铁为20mg/l、硫酸锰为20mg/l、硫酸锌为20 mg/l、硫酸铜为5mg/l、L-半胱氨酸为23mg/l、丙氨酸为24mg/l、尼 克酸为8mg/l、生物素为45μg/l、盐酸硫胺素为5mg/l、腺嘌呤为30 mg/l、磷酸(85％)为1.9％、葡萄糖为4.2％、原糖为2.4％。

完成培养之后，利用HPLC法测量5′-肌苷酸生产力，下表显示了 培养基中的5′-肌苷酸的积聚量。

表1

比较培养基内的5′-肌苷酸的积聚量与母株，即产氨短杆菌 CJIP2401菌株的5′-肌苷酸的积聚量，确认了下述的现象：在相同条件 下，与母株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株相比，产氨短杆菌CN01-0120 与产氨短杆菌CN01-0316菌株在单位时间内5′-肌苷酸的生产力增加 10.9-11.4％。

基于布达佩斯条约，于2009年2月19日在位于首尔西大门区弘 济1栋的“韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of  Microorganisms，简称为KCCM)”保藏了保藏号为“KCCM 10992P”的 被确认为通过增加嘌呤生物合成酶的活性而具有提高的5′-肌苷酸生 产力的产氨短杆菌CN01-0316。

序列表

附加的序列表中记载了在本说明书中描述的SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.43的序列。