针对金黄色葡萄球菌衍生的α-毒素的人单克隆抗体及其在治疗或预防脓肿形成中的用途

摘要

本发明涉及对金黄色葡萄球菌的α-毒素特异性的人单克隆抗体和生成所述单克隆抗体的杂交瘤。另外，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸。此外，本发明涉及所述单克隆抗体用于治疗或预防脓肿形成的用途。

说明书

本发明涉及对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的α-毒 素特异性的人单克隆抗体、生成它的杂交瘤、编码它的核酸、和经它转染的 宿主细胞。此外，本发明涉及用于生成所述单克隆抗体的方法。另外，本发 明涉及包含至少一种抗体或至少一种编码所述抗体的核酸的药物组合物。此 外，本发明涉及所述单克隆抗体用于治疗或预防脓肿形成的用途。

金黄色葡萄球菌是一种被认为是机会病原体的兼性厌氧的、革兰氏阳 性、球状细菌。金黄色葡萄球菌通常在健康人的鼻、皮肤和胃肠道粘膜表面 建群。约20-30％的人群在任何给定的时间以金黄色葡萄球菌建群。这些细菌 经常引起轻微感染，诸如健康个体中的丘疹(pimple)和疖(boils)。通常，粘膜 和表皮屏障(皮肤)针对金黄色葡萄球菌感染提供保护。由于损伤诸如烧伤、 创伤或手术规程所致的对这些天然屏障的干扰明显提高感染风险，而且可以 引起重度和/或系统性感染。使免疫系统受损的疾病(例如，糖尿病、终末期 肾疾病、癌症、AIDS和其它病毒感染)而且免疫抑制疗法(例如如辐射、 化学治疗和移植疗法)提高感染风险。机会性金黄色葡萄球菌感染可以变得 相当严重，引起心内膜炎、菌血症、骨髓炎和脓肿形成，其可以导致严重的 发病率或死亡率。金黄色葡萄球菌感染可以分为局部化感染，诸如肺炎，和 临床上更复杂的金黄色葡萄球菌感染，诸如血流感染和由远端器官撒播 (seeding)引起的脓肿形成。

金黄色葡萄球菌是全世界的血流、皮肤、软组织、和下呼吸道感染的一 项主要原因。医院和社区获得性感染两者的频率在过去几年里已经稳定地升 高。另外，这些感染的治疗由于多药物抗性菌株的出现而已经变得更具考验。 在发达国家诸如美国，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)中对β-内 酰胺抗生素的抗性是医院和其它健康护理机构的一个主要问题。值得注意 地，与其它细菌性病原体相比，所有侵入性MRSA感染(包括那些在医院外 面的感染)的发生率较高，并且20％的这些感染导致死亡。另外，对万古霉 素的获得性抗性的发生进一步限制重度金黄色葡萄球菌感染的治疗选项。

金黄色葡萄球菌具有促成疾病发病机制的多种多样的大量毒力因子。这 些可以宽泛地细分成表面和胞外分泌性蛋白质。表面蛋白质包括细菌细胞壁 的结构组分(诸如肽聚糖和脂磷壁酸)和优先在指数生长期间表达的表面蛋 白质(包括蛋白A、纤连蛋白结合蛋白和聚集因子)两者。分泌性蛋白质一 般在细菌生长的静止期期间自细菌细胞排出，并且包括几种毒素诸如α-毒素 (又称为溶血素α)、肠毒素B、杀白细胞素(包括Panton-Valentine杀白细胞 素PVL)、脂肪酶和V8蛋白酶。尽管有关于这些毒素的生化和分子特性的广 泛知识，毒素在金黄色葡萄球菌感染的发病机制中的精确作用没有得到完全 了解。

实验证据和流行病学数据已经提示了在其它细胞毒素中，α-毒素可以牵 涉肺炎的发病机制(Mc Elroy等，1999)。认为α-毒素衔接敏感性宿主的表面受 体，并且如此附着于细胞表面。此事件促进毒素寡聚化成七聚体前孔并将具 有2nm孔径的β-桶结构插入质膜中。孔的形成引起膜完整性的损失、使细胞 脱稳定化，并且最终导致凋亡和细胞裂解。特别地，淋巴细胞、巨噬细胞、 肺泡上皮细胞、肺内皮、和红细胞对通过α-毒素的孔形成敏感；然而，粒细 胞和成纤维细胞表现为对裂解有抗性(McElroy等，1999)。

α-毒素在炎性应答和对细菌性感染的先天性免疫应答的诱导中的精确 作用没有得到完全了解。金黄色葡萄球菌表达许多其它毒力因子，并且至今， 每种毒力因子对疾病表现的贡献没有得到完全了解，并且对预防和治疗临床 上复杂的金黄色葡萄球菌感染的开发提供一项考验。

已知α-毒素是在宿主中建立金黄色葡萄球菌感染的毒力因子之一，并且 许多研究已经突出显示了α-毒素在疾病中的重要性，例如将纯化的α-毒素滴 注入家兔或大鼠肺组织中触发血管泄露和肺部高血压，其已经促成不同信号 传导分子(例如，磷脂酰肌醇、一氧化氮、前列腺素类、和血栓烷A2)的释 放。在文献中，已经显示了抗α-毒素免疫针对毒素的有害效应提供保护，但 是设计针对α-毒素的疫苗仍然是一项重大的考验。

Wardenburg和Schneewind(2008)表明小鼠中的肺疾病的严重性与由特定 的金黄色葡萄球菌隔离群生成的α-毒素水平相关联。此外，作者显示了针对 非孔形成α-毒素变体的免疫接种诱导对由金黄色葡萄球菌引起的肺炎的免 疫力。这些发现与来自相同小组的一项研究一致，表明α-毒素对于CA-MRSA 肺炎(社区相关甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)的发病机制是重要的。在另 一种背景中，作者表明针对α-毒素的抗体也保护人肺上皮细胞免于金黄色葡 萄球菌诱导的裂解(Wardenburg和Schneewind(2008))。

虽然这些结果指示α-毒素促成肺组织破坏，但是尚不清楚上文所描述的 实验中的动物死亡是源自毒素对肺细胞的直接破坏，源自过度炎性应答，还 是源自这两者。α-毒素抗体的被动转移显著降低白介素1β(即一种已知伴随 急性肺损伤的细胞因子)的循环水平。因此，合理的是，推断炎性应答可以 促成α-毒素介导的肺损伤。

在人局部化感染诸如肺炎期间，约40％的金黄色葡萄球菌肺炎患者形成 血流感染和播散性疾病。细菌感染的播散可以导致血流感染和远端器官撒 播。血流感染可以导致败血病，即一种快速行进且经常为致死性的金黄色葡 萄球菌感染并发症。

金黄色葡萄球菌感染的播散也是金黄色葡萄球菌肺炎动物模型中通常 看到的，再次，约40％的动物由于组织损伤而形成播散性菌血症，并经由表 皮层将感染扩散入血流和淋巴组织中。然而，播散主要取决于所使用的动物 品系的遗传背景和先天性免疫系统，诸如嗜中性粒细胞活化控制生长的潜 力，例如，嗜中性粒细胞消减的C57B/L动物对金黄色葡萄球菌的肾感染高度 易感，而免疫活性动物对感染有抗性。相反，A/J动物非常易感，这主要是 由于嗜中性粒细胞对肾的募集延迟所致(von-Blickwede，2008)。

虽然关于金黄色葡萄球菌蛋白的结构和功能的数据变得更全面，但是有 效疫苗的开发仍然是一项考验。

尝试通过使用包含特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素抗原的抗体和特 异性结合另一种细菌抗原的抗体的组合的组合物来安全地赋予针对α-毒素 和金黄色葡萄球菌细菌的免疫力(WO 2007/145689)。虽然这些组合物包含单 独为无效的抗体量，然而它们通过抗体组合的协同活性来中和感染和/或针对 感染提供保护。

与用单独的中和性或调理性抗体的免疫接种的保护效果相比，表明用金 黄色葡萄球菌隔离群的细菌考验后72小时时金黄色葡萄球菌毒素中和性和 调理性抗体的所述组合的保护性功效。调理性和毒素中和性抗体的组合表明 在预防皮肤和软组织感染及器官撒播中的保护效果。然而，所述专利申请自 身披露的中和性抗α-毒素抗体不足以预防器官撒播/脓肿形成或中和感染。

Heveker等(1994a，1994b)进一步尝试了描述针对金黄色葡萄球菌α-毒素 的中和性人和鼠单克隆抗体。IgG/λ亚型的人单克隆抗体以序列为特征，并 且显示了中和。

使用来自先前用金黄色葡萄球菌α类毒素测试疫苗免疫接种的健康志愿 者的外周血白细胞来分离由Heveker(1994a)所描述的生成抗α-毒素抗体的人 杂交瘤。虽然Heveker研究中所使用的α-类毒素代表经化学修饰的α-毒素，但 是可以假设修饰确实使抗原决定簇不太有免疫原性或者甚至无免疫原性，并 且因此该方法不可产生同等有效的免疫力，如对其它细菌毒素，诸如霍乱毒 素表明的，其中类毒素疫苗刺激没有赋予针对感染的免疫力的抗毒素抗体 (Levine(1983))。

已经在文献中将多种因子鉴定为对于脓肿形成至关重要的毒力因子，诸 如毒素、肽聚糖、胞外因子和酶。Kapral等(1980)假定了α-毒素在脓肿形成中 的潜在作用。报告了α-毒素在脓肿成熟后在脓肿中显著积累，尽管不可以证 明α-毒素对于脓肿形成是必需的。Adlam等(1977)的第二份出版物否认α-毒素 在脓肿形成中的关键作用。作者证明了α-毒素在天然爆发中看到的家兔乳腺 炎青紫乳房(blue-breast)的扩散性出血形式中发挥关键的作用。他们用两种无 关葡萄球菌菌株在实验室中再现了临床现象。高循环抗α-毒素滴度赋予针对 此致命形式的乳腺炎的保护。如此，中和性滴度可以通过将临床现象修饰成 不太严重的脓肿状况来预防致命性后果。然而，中和α-毒素不影响/阻止家兔 中的脓肿形成。在新近的出版物中，Kielian等(2001)调查了α-毒素在小鼠模 型中的脑脓肿形成中的作用。在实验上，作者将野生型金黄色葡萄球菌菌株 及其突变体植入额叶脑组织中，并评估每种菌株诱导脑脓肿的能力。作者使 用在表达已知的毒力因子方面相关的基因座的菌株突变体，例如sarA基因座 和agr基因座(两者都牵涉重要毒力因子的全局调节)的突变体。因为α-毒素 在sarA/agr调节系统的控制下，所以作者还将α-毒素突变体菌株纳入他们的实 验中。实验数据表明，与其同基因对照菌株RN6390相比，α-毒素或sarA/agr 基因座的突变体细菌菌株的复制在将细菌细胞注射入颅骨后具有降低的毒 力，与那些接受同基因菌株的小鼠中的大的形成良好的脓肿相比，导致要检 测的动物的脑中的细菌数目较少和小的炎性病灶。然而，突变体菌株在实验 脑脓肿模型中不是完全无毒力的，并且它不能排除除α-毒素外的别的因子在 脑脓肿形成中发挥至关重要的作用。

在局部、系统性和脓肿形成性金黄色葡萄球菌感染模型的分析中在如由 Schwan等(2003)所概述的另一种实验背景中评估α-毒素在脓肿形成中的作 用。作者注意到非溶血性金黄色葡萄球菌菌株在鼠脓肿和伤口模型中，而不 在与系统性感染有关的器官组织内随着时间流逝变得更丰富。例如，在脓肿 模型中使用金黄色葡萄球菌菌株RN6390的所有变体(高溶血性、溶血性和 非溶血性)的混合感染中，高溶血性组在感染后第7天时明显下降，而非溶 血性群显著增加。对几种加标记(signature)标签的突变体的测序指示agrC基因 中或agrA-agrC基因间区内的突变，其导致削弱α-毒素和β-毒素活性两者。在 感染的脓肿、伤口和系统模型中对特定突变体菌株分析agr活性(agr-)和α-毒 素(hla-)，与亲本野生型菌株(RN6390)相比，agr-突变体菌株和hla-突变体菌 株在第4天时没有显示鼠脓肿中细菌计数的差异。其适用于局部感染(伤口 模型)，而在感染的系统模型中发生hla突变体菌株和agr突变体菌株的相当大 的清除。结果清楚地指示α-毒素在系统性感染中，而不是在局部感染或脓肿 形成中的重要性。实际上，在脓肿模型中用hla-突变体和野生型菌株的混合 感染显示hla突变体群体略优于野生型菌株。作者甚至推断agr突变引起α-和β- 毒素表达的降低，这继而促成驻留于脓肿和伤口中的金黄色葡萄球菌细胞的 混合群体内的此agr突变体组的生长优势。该结果明显与由Kielian等所描述的 结果矛盾，其中缺乏α-毒素生成降低细菌毒力。因此，α-毒素在脓肿形成中 的作用是不清楚的。

总体上，没有证据指出一种单一的毒力因子为脓肿形成中的主要驱动 物。因此，研究聚焦于不完全由金黄色葡萄球菌控制的别的因子的存在，诸 如环境因素，或脓肿形成中作为常见的关键因素的给定结构基序。例如，关 于影响脓肿形成的毒力因子的新近数据指出未螯合的二价金属离子，诸如 Mn⁺⁺和Ca⁺⁺对脓肿形成和脓肿内的细菌生长的影响。动物中的金属离子螯合 抑制肝脓肿的形成，而且抑制脓肿中的金黄色葡萄球菌生长(Corbin 2008)。 另一方面，Tzianabos等(2001)假设生物体诸如金黄色葡萄球菌需要细菌细胞 上存在的毒力因子以建立病理学结构诸如组织中的脓肿。他们证明了与脓肿 的临床病例高度相关的菌株可以拥有一种或多种细胞壁关联的具有两性离 子电荷基序(即一种携带总净电荷0，如此为电中性，但是在不同原子上携 带形式上的正和负电荷的化学化合物)的多糖。在缺乏两性离子电荷基序的 情况中，不可观察到脓肿形成。作者推断，这些多糖聚合物可以调控此生物 体的脓肿诱导。另外，他们呈现了不仅关于核心多糖CP5和CP8，而且关于 脂磷壁酸(LTA)(即一种在细胞壁内的别的充分表征的毒力因子)的确认数 据。他们也鉴定了LTA内的两性离子电荷基序，并且因此将他们关于脓肿形 成的假设推广至两性离子电荷基序存在于脓肿形成的任何枢要毒力因子中。

基于指示多种因子促成金黄色葡萄球菌介导的脓肿形成的结果，本领域 技术人员不会预期单一因子的中和会阻止脓肿形成。

如此，本发明的目的是提供用于预防和治疗临床上复杂的金黄色葡萄球 菌感染，诸如脓肿形成的手段和方法。

因而，本发明根本的一个技术问题是提供对自金黄色葡萄球菌衍生的α- 毒素特异性的单克隆抗体，其中该抗体具有针对临床上复杂的金黄色葡萄球 菌感染，诸如脓肿形成的体内保护性能。

所述技术问题通过如下文中所限定的单克隆抗体来解决。

本发明提供了对金黄色葡萄球菌的α-毒素特异性的单克隆抗体，称作 243-4，其中所述抗体的轻链可变区包含下列至少一项：CDR1区中的SEQ ID  NO：1、CDR2区中的SEQ ID NO：2和CDR3区中的SEQ ID NO：3，且其中所述 抗体的重链可变区包含下列至少一项：CDR1区中的SEQ ID NO：4、CDR2区 中的SEQ ID NO：5和CDR3区中的SEQ ID NO：6，或其能够结合金黄色葡萄球 菌的α-毒素的片段或突变蛋白，其中所述单克隆抗体的突变蛋白携带所述重 或轻链中的任一个CDR区中的至少一处保守替代。

依照本发明的一个优选的实施方案，提供了对金黄色葡萄球菌的α-毒素 特异性的人单克隆抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1区中的SEQ  ID NO：1、CDR2区中的SEQ ID NO：2和CDR3区中的SEQ ID NO：3，且其中所 述抗体的重链可变区包含CDR1区中的SEQ ID NO：4、CDR2区中的SEQ ID  NO：5和CDR3区中的SEQ ID NO：6，或其能够结合金黄色葡萄球菌的α-毒素 的片段或突变蛋白，其中所述单克隆抗体的突变蛋白携带所述重或轻链中的 任一个CDR区中的至少一处保守替代。

令人惊讶地，已经发现了依照本发明的单克隆抗体展现出针对脓肿形成 的高保护性能。已经显示了在小鼠-肾模型中通过施用依照本发明的α-毒素特 异性人单克隆抗体来阻止脓肿形成。基于毒素的性质，即作为分泌性蛋白质 而不是细胞壁关联的组分(多糖)，可以排除任何直接的杀细菌效应，例如 杀死细菌细胞，或间接的免疫系统相关效应器功能，诸如补体介导的调理吞 噬，并且其没有造成脓肿形成的缺乏。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”涵盖不依赖于获得单克隆抗体 的来源的任何部分或完全人的单克隆抗体。完全人单克隆抗体是优选的。通 过杂交瘤生成单克隆抗体是优选的。杂交瘤可以是哺乳动物杂交瘤，诸如鼠 的、牛的、或人的。一种优选的杂交瘤是人起源的。也可以通过遗传工程且 特别地将如权利要求书中所限定的CDR区段CDR嫁接到可用单克隆抗体上 来获得单克隆抗体，所述CDR嫁接通过用如权利要求书中所限定的特定CDR 区段替换背景抗体的CDR区来实现。

术语“CDR区”意指抗体的互补决定区，即决定抗体对特定抗原的特异 性的区域。轻和重链两者上的三个CDR区(CDR1至CDR3)负责抗原结合。

重链内的CDR区的位置如下：

V_H外显子内的CDR1区氨基酸26至33，

V_H外显子内的CDR2区氨基酸51至58，

V_H外显子内的CDR3区氨基酸97至110。

CDR区的位置不依赖于抗体的类，即IgM、IgA或IgG。

λ型轻链内的CDR区的位置如下：

Vλ外显子内的CDR1区氨基酸26至33，

Vλ外显子内的CDR2区氨基酸51至53，

Vλ外显子内的CDR3区氨基酸90至101。

可以自V Base数据库(http://imqt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)获得 V_H、Vχ和Vλ外显子的氨基酸比对。

术语“片段”意指抗体的能够结合金黄色葡萄球菌的α-毒素的任何片段。 片段具有至少10，优选地20，更优选地50个氨基酸的长度。进一步优选的是， 片段包含抗体的结合区。优选的是，片段是Fab、F(ab’)₂、单链或域抗体。 最优选的是Fab或F(ab’)₂片段或其混合物。抗体片段可以是糖基化的，例如 含有抗体可变区中的碳水化合物模块。

因而，本发明进一步提供了如本文中所限定的单克隆抗体，其中所述抗 体是Fab、F(ab’)₂、单链或域抗体片段。

术语“突变蛋白”涵盖通过添加、删除、和/或替代至少一个氨基酸而有 所不同的单克隆抗体的任何突变蛋白。优选地，单克隆抗体的突变蛋白携带 如权利要求书中指示的重链和/或轻链中的任何CDR中的至少一处保守替 代。更优选地，突变蛋白具有不超过5，不超过4，优选地不超过3，特别优 选地不超过2处保守替代。通过直接ELISA来测定抗体的片段或突变蛋白能 够结合金黄色葡萄球菌的α-毒素的性能，如实施例部分所描述的：将纯化的 α-毒素在ELISA板的固相上固定化。将抗体的抗体片段或突变蛋白与固定化 的α-毒素一起温育，并通过合适的经酶缀合的二抗来显现结合的抗体或其突 变蛋白。

术语“保守替代”意指将属于特定物理-化学组的一个氨基酸用属于同 一物理-化学组的氨基酸替换。物理-化学组如下定义：

非极性氨基酸的物理-化学组包含：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸。具有不带电荷的极性 侧链的氨基酸组包含天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、和胱氨酸。 具有带正电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含赖氨酸、精氨酸、和 组氨酸。具有带负电荷的极性侧链的氨基酸的物理-化学组包含天冬氨酸和 谷氨酸，其羧酸根阴离子又称为天冬氨酸根和谷氨酸根。

依照别的实施方案，本发明提供了对金黄色葡萄球菌的α-毒素特异性的 单克隆抗体，其中所述抗体的轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：7，而 重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：8，或其能够结合金黄色葡萄球菌的 α-毒素的片段，或所述抗体的能够结合金黄色葡萄球菌的α-毒素的变体，其 中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：7至少85％相同，而所 述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：8至少85％相同。

如本文中所使用的，术语“变体”指如下的多肽，其中氨基酸序列与如 序列表中所列的氨基酸序列展现出某种程度的同一性。

本领域技术人员已知的术语“％同一性”意指两个或更多个多肽分子间 的关联性程度，其通过序列间的一致性确定。考虑缺口或其它序列特征，自 两个或更多个序列中的相同区域的百分比找到“同一性”百分比。

可以依靠已知的规程来确定彼此相关的多肽的同一性百分比。通常，使 用具有考虑特殊要求的算法的特殊计算机程序。用于测定同一性的优选规程 首先产生所研究序列间的最大一致性。用于测定两个序列间的同一性的计算 机程序包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux J等，(1984)；Genetics  Computer Group University of Wisconsin，Madison(WI)；BLASTP，BLASTN和 FASTA(Altschul S等，(1990))。BLAST X程序可以自国家生物技术信息中心 (National Centre for Biotechnology Information，NCBI)及其它来源(BLAST  Handbook，Altschul S等，NCB NLM NIH Bethesda MD 20894；Altschul S 等，1990)获得。也可以使用公知的Smith Waterman算法来确定同一性百分比。

用于序列比较的优选参数包括下列各项：

算法：           Needleman S.B.和Wunsch，CD.(1970)

比较矩阵：       来自Henikoff S.和Henikoff J.G.(1992)的BLOSUM62

缺口罚分：       12

缺口-长度罚分：  2

GAP程序也适合于与上述参数一起使用。上述参数是氨基酸序列比较的 标准参数(缺省参数)，其中末端的缺口不降低同一性数值。凭借与参照序 列相比的非常小的序列，将预期值增加至多至100,000，且在一些情况中将字 长度(字大小)降低至下至2可以是进一步必需的。

可以使用其它模型算法、缺口打开罚分、缺口延伸罚分和比较矩阵，包 括那些在Program Handbook，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中提到 的。选择会取决于要实施的比较，并且进一步取决于是在序列对间(其中GAP 或Best Fit是优选的)，还是在一个序列与大的序列数据库间(其中FASTA或 BLAST是优选的)实施比较。用上述算法确定的85％一致性被描述为85％同 一性。其适用于较高的同一性程度。

在优选的实施方案中，依照本发明的变体具有85％或更多，优选地90％ 或更多，且更优选地95％或更多的同一性。

依照本发明的一个优选的实施方案，单克隆抗体是人抗体。如本文中所 使用的，术语“人的”意指人单克隆抗体基本上没有外来物种的氨基酸序列， 优选地人单克隆抗体完全由人氨基酸序列组成。

依照本发明的单克隆抗体的轻链可以是κ或λ型的。

在本发明的一个优选的实施方案中，轻链是λ型的。轻链可以是天然存 在的链，包括天然重排的、经遗传修饰的或合成的轻链类型。

本发明的单克隆抗体的重链可以选自：同种型IgM、IgA、或IgG，优选 地IgG。

依照本发明的别的优选的实施方案，单克隆抗体的重链是IgG型的。

如本文中所使用的，术语“能够结合”指抗体与生成的抗体所针对的其 识别抗原间发生的结合。与没有抗原情况中发生的非特异性相反，此类结合 是特异性结合。

使用杂交瘤技术来制备能够结合α-毒素的抗体，其中B细胞是哺乳动物B 细胞，诸如鼠的、牛的或人的。优选地，B细胞是人B细胞。或者，可以通 过如权利要求书中指示的CDR区对可用单克隆抗体上的CDR嫁接，由此生成 依照本发明的对金黄色葡萄球菌的α-毒素特异性的单克隆抗体来获得能够 结合α-毒素的单克隆抗体。

在本发明的别的实施方案中，提供了能够结合金黄色葡萄球菌的α-毒素 的单克隆抗体，其可获自哺乳动物B细胞，诸如鼠的、牛的或人的，优选地 人B细胞或通过融合所述人B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞获得的杂交 瘤。

在别的实施方案中，本发明提供了能够生成能够结合金黄色葡萄球菌的 α-毒素的单克隆抗体的杂交瘤，如本文中所限定的。

如本文中所使用的，术语“α-毒素”指一种由金黄色葡萄球菌生成的细 菌蛋白质。α-毒素在结合宿主细胞的细胞表面后经历寡聚化成七聚体前孔。 孔的形成是凋亡和细胞裂解的主要原因。因此，单克隆抗体结合单体和寡聚 体形式的金黄色葡萄球菌衍生的α-毒素两者的性能对于有力的保护具有根 本的重要性。

依照本发明的别的优选实施方案，本发明的单克隆抗体能够特异性结合 金黄色葡萄球菌的单体和寡聚体形式的α-毒素。依照本发明的别的实施方 案，本发明的单克隆抗体或其片段或突变蛋白能够特异性结合金黄色葡萄球 菌的单体或寡聚体形式的α-毒素或它们两者。

如本文中所使用的，术语“寡聚体形式”包括与α-毒素的单体形式不同 的形式，诸如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等或多聚 体形式，诸如七聚体前孔形式的α-毒素。

依照别的优选实施方案，本发明的单克隆抗体是N端、内部或C端修饰 的。修饰包括单体形式的二-、寡-、或多聚化，例如通过使用二环己基碳二 亚胺的交联来实现。可以通过凝胶过滤将如此生成的二、寡-、或多聚体彼 此分开。别的修饰分别包括侧链修饰，例如ε-氨基-赖氨酸残基的修饰，或氨 基和羧基端修饰。别的修饰包括翻译后修饰，例如蛋白质的糖基化和/或部分 或完全脱糖基化、和二硫键形成。抗体也可以与标记物，诸如酶、荧光或发 射性标记物缀合。优选地，修饰选自下列至少一项：寡聚化、糖基化或与药 物或标记物的缀合。

此外，本发明提供了分别编码本发明的单克隆抗体的重链和轻链的核 酸。核酸可以是自种系或自B细胞中发生的重排衍生的天然存在的核酸，或 者，核酸可以是合成的。合成的核酸还包括具有经修饰的核苷间键，包括硫 代磷酸酯以提高核酸免于降解的抗性的核酸。核酸可以遗传工程化改造或者 通过核苷酸合成完全合成生成。

本发明进一步提供了包含至少一种编码本发明单克隆抗体的轻链的核 酸和/或至少一种编码本发明单克隆抗体的重链的核酸的载体。核酸可以存在 于同一载体中或者可以以二元载体形式存在。优选地，载体包含与核酸可操 作连接的启动子以便于编码轻和/或重链的核酸的表达。优选地，载体还包含 用于在宿主细胞中复制和维持的起点。载体还可以包含位于编码轻链或重链 的核酸的5’的编码信号序列的核苷酸序列。信号序列可以便于编码的链分泌 入培养基中。

优选地，载体自腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、SV 40病毒、逆转录病 毒、植物病毒或噬菌体诸如λ衍生物或M13衍生。特别优选的载体是含有人Ig 重链和人轻链的恒定区的载体，诸如由Persic等，1987所描述的供免疫球蛋白 的真核表达用的整合载体系统。

此外，本发明提供了包含载体和/或适合于表达载体的核酸的宿主细胞。 在本领域中，已知许多原核和真核表达系统，其中真核宿主细胞诸如酵母细 胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，诸如HEK293细胞、PerC6细胞、 CHO细胞、COS细胞或HELA细胞及其衍生物是优选的。特别优选的是人生 产细胞系。优选的是，经转染的宿主细胞将所生成的抗体分泌入培养液中。 若实现胞内表达，则依照标准规程，诸如例如那些由Benetti等，1998描述的 规程来实施复性。

依照本发明的人单克隆抗体自康复期患者的血液淋巴细胞生成，并且如 此生成具有高亲和力的天然精制的且选定的抗体以实现中和和针对感染的 有效保护。

本发明还提供了用于生成单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，通过 培养上文所描述的杂交瘤来生成单克隆抗体。生成的单克隆抗体被分泌入上 清液中，并且可以通过应用常规的层析技术来自其纯化。

或者，通过包含依照本发明的载体的宿主细胞，并在适合于重组表达编 码的抗体链的条件下培养宿主细胞来生成单克隆抗体。优选地，宿主细胞包 含至少一种编码轻链的核酸和至少一种编码重链的核酸，并且能够装配单克 隆抗体，使得产生与由哺乳动物，优选地人B细胞生成的单克隆抗体的三维 结构等同的三维结构。若轻链与重链分开生成，则可以将这两条链纯化，随 后装配以生成基本上具有如由哺乳动物，优选地人B细胞生成的单克隆抗体 的三维结构的单克隆抗体。

也可以通过编码的轻和/或重链的重组表达来获得单克隆抗体，其中通过 以已知的方式分离编码单克隆抗体的核酸，并将编码如权利要求书中所限定 的CDR的核酸序列嫁接至分离的核酸上来生成核酸。

本发明进一步提供了包含至少一种单克隆抗体和/或至少一种编码单克 隆抗体的轻和/或重链的核酸的药物组合物。

药物组合物可以进一步包含抗生素药物，诸如链霉素、青霉素和万古霉 素等，优选地与本发明的单克隆抗体偶联。

药物组合物包含剂量范围为0.1-100mg/kg体重的单克隆抗体。

可以以任何已知的方式，诸如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内、 表面、鼻内施用，或以吸入喷雾剂施用药物组合物。

在本发明的一个优选的实施方案中，使用药物组合物来预防或治疗哺乳 动物患者，诸如牛、猪、猫、犬、马、人的器官中的脓肿形成。在本发明的 一个优选的实施方案中，将药物组合物应用于人患者。在本发明的别的实施 方案中，脓肿形成是由金黄色葡萄球菌感染引起的。此外，要用本发明的药 物组合物治疗的金黄色葡萄球菌感染可以是例如乳房感染，诸如乳腺炎。

因而，本发明提供了如本文中所限定的单克隆抗体或编码轻链和/或重链 可变区的核酸用于制备供预防或治疗哺乳动物，优选地人患者的器官中的脓 肿形成用的药物组合物的用途。

在本发明的一个优选的实施方案中，应用如本文中所限定的药物组合 物、单克隆抗体或编码轻链或重链可变区的核酸以预防或治疗器官，诸如肾、 心、肝、胆囊、胰、小肠、大肠、肺、脑、皮肤、眼、淋巴组织或脾中的脓 肿形成。在本发明的一个优选的实施方案中，要治疗的脓肿是腹部脓肿。因 而，要治疗的腹部器官是肝、胆囊、脾、胰、小肠、肾、和大肠。

如本文中所使用的，术语“脓肿形成”指器官，诸如肾、心、肝、胆囊、 胰、小肠、大肠、肺、脑、皮肤、眼、淋巴组织或脾中的脓肿形成。如本文 中所使用的，术语“脓肿”意指基于感染过程(通常由细菌或寄生物引起) 已经在腔中积累由组织形成的脓集合。由这些繁殖的细菌释放的毒素破坏细 胞，并触发炎性应答，其将大量的白细胞吸引至该区域，并提高区域性血液 流动。这些白细胞分解死亡的组织，并依靠吞噬吸收细菌。自分解的组织、 死亡的细菌和白细胞、和已经积累的胞外流体形成稠的绿色或微黄色的脓。 脓肿以试图阻止脓感染邻近结构、由相邻健康细胞形成的脓肿壁的包囊为特 征。它是组织的一种防御反应以阻止感染性物质扩散至身体的其它部分。脓 肿可以在任何种类的实体组织中，但是最常在皮肤表面(在那里，它们可以 是表面脓疱(疖)或深皮肤脓肿)上，在肺、脑、肾和扁桃体中发生。主要 的并发症是脓肿物质的扩散，诸如对相邻或远端组织的器官撒播和广泛的区 域性组织死亡(坏疽)。通过评估器官内的细菌载荷来检测脓肿形成。

如本文中所使用的，术语“腹部脓肿”指腹腔的器官中的脓肿。腹腔是 容纳内脏的体积，并且位于胸腔之下(或低于胸腔)，且在盆腔之上的体腔。 它是盆腹腔的一部分。腹腔的器官包括胃、肝、胆囊、脾、胰、小肠、肾、 和大肠。

如本文中所使用的，“器官撒播”意指活细菌自感染的局部部位散播至 远端组织和器官。器官撒播以健康组织中存在活的感染性细菌细胞，而不形 成细菌细胞的包囊宏观菌落为特征。

如本文中所使用的，“细菌载荷”定义为充分限定的解剖学组织内的活 细菌细胞量，其表示为在固体生长培养基，诸如琼脂板上长出菌落的细菌细 胞的量。为了评估器官内的细菌载荷，自周围组织手术提取器官，并在无菌 条件下在无菌盐水溶液中将器官组织捣碎以破坏该组织的良好结构化组织， 并分开细菌细胞与哺乳动物组织。将限定量的细胞悬浮液(或在无菌盐水中 的其连续稀释物)在固体细菌生长培养基上涂布。细菌载荷表示为每个肾的 “菌落形成单位”(例如cfu/肾)。

本发明还提供了用于诊断金黄色葡萄球菌感染的测试试剂盒，其包含本 发明的至少一种单克隆抗体和任选地别的适合于实施诊断测试的成分。

适合于实施诊断测试的成分是例如具有280-320mOsm/升范围内的摩尔 渗透压浓度和pH 6-8范围内的pH值的缓冲溶液；含有螯合剂的缓冲溶液；含 有一价或二价阳离子的缓冲溶液，其中缓冲液组成的总阳离子浓度范围为约 0.02M至约2.0M；和/或含有0.01％和20％间的浓度的动物或人衍生的血清的 缓冲溶液。

测试试剂盒适合于金黄色葡萄球菌感染的特异性的可靠诊断。测试测定 法可以基于液体或膜结合形式的常规ELISA测试。检测可以是直接的或间接 的，如本领域中已知的，其中任选地，抗体与酶、荧光或放射性标记物缀合。

因而，本发明还提供了依照本发明的至少一种单克隆抗体用于检测对样 品中的α-毒素的结合的用途。可以例如用经HRP缀合的山羊抗人IgG二抗来 检测依照本发明的抗体对α-毒素的结合。

附图简述

图1

图1显示了人单克隆抗体243-4重链可变区的DNA和氨基酸序列。243-4 的CDR1区在第26位至第33位，243-4的CDR2区在第51位至第58位，而243-4 的CDR3区在第97位至第110位。

图2

图2显示了人单克隆抗体243-4轻链可变区的DNA和氨基酸序列。243-4 的CDR1区在第26位至第33位，243-4的CDR2区在第51位至第53位，而243-4 的CDR3区在第90位至第101位。

图3

图3显示了人单克隆抗体243-4的抗原特异性。在ELISA测定法中通过对 一组细菌毒素的结合来评估抗体243-4的抗原特异性。在用经纯化的毒素包 被的微量滴定板上实施ELISA。在于室温温育过夜后，用BSA封闭微量滴定 板，并用经HRP缀合的山羊抗人IgG二抗来检测单抗243-4对固定化的毒素的 结合。清楚地，人单克隆抗体243-4对金黄色葡萄球菌α-毒素的结合比对测试 的所有其它毒素的结合有利。

图4

图4显示了Western印迹实验中人单克隆抗体243-4对流行病学金黄色葡 萄球菌菌株的α-毒素的结合。自静止生长期的细菌培养物监测12种流行病学 金黄色葡萄球菌菌株的α-毒素生成。培养后，将标准化的细菌上清液和纯化 的α-毒素在SDS-PAGE凝胶上加载，并应用于电印迹。在封闭后，将硝酸纤 维素膜与纯化的人单克隆抗体243-4一起温育。通过人单克隆抗体243-4的结 合来证明来自每种评估的流行病学菌株的单体和/或七聚体α-毒素两者的生 成和识别。

在图4中，M意指大小标志物，数字1-12是流行病学金黄色葡萄球菌菌株， 而αTox是纯化的α-毒素。

图5

图5显示了通过BIAcore对人单克隆抗体243-4的亲和力测定。使用 BIAcore 2000仪来分析人单克隆抗体243-4的结合动力学。将不同α-毒素浓度 应用于用单抗243-4固定化的流动池。记录结合和解离阶段以计算抗体的解 离常数。使用软件BIAevaluation 4.1通过全局拟合来评估动力学数据。

图6

图6显示了人肺泡细胞损伤的组织培养模型中人单克隆抗体243-4的α-毒 素中和。在存在同种型对照抗体或单克隆抗体243-4的情况中将人A549肺泡 上皮细胞与α-毒素共培养16小时。所述时间后，通过乳酸脱氢酶(LDH)测定 法来分析细胞，所述测定法提供由α-毒素引起的细胞损伤的读出，并且揭示 可以用应用的抗体实现的保护程度。为了解读结果，将源自与最高的α-毒素 浓度一起预温育的细胞裂解程度设置为100％。用毒素处理的细胞仅显示依 赖于应用的α-毒素浓度的裂解滴定。在将α-毒素与同种型对照抗体一起预温 育时观察到相同的滴定，指示同种型对照没有保护效果。相反，通过与人单 克隆抗体243-4一起温育来保护人肺泡上皮细胞免于α-毒素依赖性裂解。在三 个独立的时机实施实验，每个时机确认抗体243-4的保护性。

图7

图7显示了人单克隆抗体243-4在多器官感染的中央静脉插管相关小鼠 模型中的保护效果。插管放置后24小时，小鼠经由插管接受1x10e7个CFU的 金黄色葡萄球菌菌株US300和7.5mg/kg单抗243-4或PBS。2天后，处理组的小 鼠接受第二剂抗体(5mg/kg)，而对照组的小鼠仅接受PBS。手术后5天，对小 鼠实施安乐死以监测肾细菌载荷和肾脓肿形成。用单克隆抗体243-4免疫的 小鼠显示了细菌载荷的强烈降低，而且没有观察到肾脓肿形成，而所有对照 小鼠拥有高细菌肾载荷和强烈的脓肿形成。

以下实施例例示了本发明，但是并不意图限制本发明的范围。在研究说 明书并注意常见的一般知识时，其它实施方案对于本领域技术人员会是显而 易见的。

实施例

实施例1

243-4的DNA和氨基酸序列

分别通过DNA和氨基酸序列来测定抗体特异性。测定重和轻链可变片段 的DNA序列。对于RNA分离，通过离心来沉淀5x10e5个杂交瘤细胞，并使用 Qiashredder柱(#79654，Qiagen)来均质化。然后，通过使用RNeasy试剂盒 (#74124，Qiagen)依照供应商的说明手册自均质化的杂交瘤细胞团粒分离 mRNA。基于分离的mRNA，使用Superscript II逆转录酶(#18064-022， Invitrogen)通过逆转录合成cDNA。使用Advantage 2PCR试剂盒(#639206， Clontech)依照供应商的说明手册自合成的cDNA扩增抗体243-4的基因。通过 应用为了扩增人重排的IgG可变区基因而设计的引物组合来保证抗体基因的 特异性扩增(Welschof等，1995)。为了扩增可变重链域(VH)和可变轻链域(VL) 两者，与一个反向引物组合使用一组链特异性正向引物，所述反向引物特异 性在重链或轻链的恒定域中退火(与VH1、VH2、和VH3组合的VH扩增CH IgG；与VLλ1、VLλ2/5、VLλ3、VLλ4a、VLλ4b、和VLλ6组合的VL扩增 CLλ；见表1)。然后，将PCR扩增物在用于测序的TOPO TA克隆试剂盒 (#K457540，Invitrogen)的质粒pCR4-TOPO中克隆，并且最终发送纯化的质粒 DNA以使用TOPO克隆试剂盒的质粒特异性引物(T3和T7，见表1)来测序 (Microsynth，Balgach，Switzerland)。将获得的DNA序列加工，并使用克隆管 理者软件包(#875-501-1787，Scientific&Educational Software)来比对。源自实 施的比对，限定共有序列，随后使用所有人种系可变区序列的V Base数据库 (http://imqt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)来分析共有序列。基于初始测 序结果，设计并应用别的链特异性内部引物序列(VL-atox as和VH-atox as， 见表1)以确定先前使用的引物组合的退火区中鉴定的抗体序列。将由此生 成的抗体基因应用于测序，如上文所描述的，如图1和2中所显示的。

表1

用于对抗体243-4的可变域扩增和测序的引物序列

*圆括号中的碱基代表前一个位置处的替代，并且数字指示核苷酸替代的百 分比。

实施例2：

人单克隆抗体243-4的抗原特异性(ELISA)

在ELISA测定法中通过对一组细菌毒素(α-毒素：#120，List Biological  Laboratories；所有其它毒素：内部生成，Kenta Biotech AG)的结合来评估 抗体243-4的抗原特异性。在用浓度各为1μg/ml的纯化的毒素包被的微量滴定 板(#439454，Nunc MaxiSorp)上实施ELISA。于室温温育过夜后，用0.5％BSA 将微量滴定板封闭2小时，并用1∶2000稀释的经HRP缀合的山羊抗人IgG二抗 (#62-8420，Zymed Laboratories，Invitrogen)检测单抗243-4(1μg/ml)对固定化 的毒素的结合。用HCl停止反应。

使用Softmax软件于490nm在ELISA读数仪上读出光密度，如图3中 所显示的。

实施例3：

Western印迹实验中对流行病学金黄色葡萄球菌菌株的α-毒素的结合

于37℃在BHI培养基(#255003，Becton Dickinson)中生长16小时后监测来 自12种流行病学金黄色葡萄球菌菌株的α-毒素生成。菌株自德国金黄色葡萄 球菌参照中心(Robert Koch研究所，Wernigerode)获得，并且代表目前引起金 黄色葡萄球菌感染的最普遍的流行病学菌株。与导致不同信号强度的其它菌 株相比，这些菌株中的一些生成较少的α-毒素。

表2中描写了评估的菌株的不同基因型。培养后，通过离心来将细菌沉 淀，并相对于初始细菌培养物的OD₆₀₀＝0.6标准化培养物上清液。将25μl每种 上清液在4-20％SDS-PAGE凝胶(#EC60252，Invitrogen)上加载，接着电印迹1 小时。作为参照平行地将1μg纯化的α-毒素(#120，List Biological Laboratories) 加载并进行印迹。用5％奶粉封闭1小时后，将硝酸纤维素膜(#LC2000， Invitrogen)与50μg/ml纯化的人单克隆抗体243-4一起温育。最终，用1∶2000稀 释的经HRP缀合的山羊抗人IgG二抗(#62-8420，Zymed Laboratories， Invitrogen)检测抗体243-4对α-毒素的结合，如图4中所显示的。

表2

代表性克隆系的医院和社区获得的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株 (MRSA)的组

*1)多基因座序列分型

*2)克隆复合物

*3)蛋白A基因(spa)可变重复区分析

实施例4：

亲和力测定(通过BIAcore进行)

使用BIAcore 2000仪(BIAcore)来测量表面等离振子共振。在20mM Mops 缓冲液，pH 7.0、150mM NaCl、和0.1mg/ml BSA中实施所有实验。首先通 过胺偶联以约13200个RU，将山羊抗人IgG(#81-7100，Zymed Laboratories， Invitrogen)在CM5芯片(BIAcore)上固定化，如BIAapplications手册中所描述 的。在初始的共价包被外，经由与预固定化的抗人IgG抗体的相互作用来将 抗体243-4结合于传感器芯片，最终产生额外的固定化水平约240个RU。对于 抗原-抗体相互作用的动力学表征，以50μl/分钟的流速注射渐增的α-毒素浓度 (3.9nM、7.8nM、15.62nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、和500nM； #120，List Biological Laboratories)的脉冲。每个测量循环(5分钟结合，接着 是30分钟解离)后，用10mM盐酸甘氨酸(pH 1.7)再生表面来溶解抗体-抗 原复合物。对于计算抗体243-4的解离常数，记录结合和解离阶段，并使用 软件BIAevaluation 4.1(BIAcore AB，如图5中所显示的)通过全局拟合来评 估。对于全局拟合分析，仅考虑这些抗原浓度，其容许遵循朗缪尔1∶1结合模 型(小于等于125nM，表2)且如BIAcore手册中所概述的那样分析。

表3

定量α-毒素-抗体243-4相互作用的动力学常数

  抗原浓度   k_ass(l mol^-1s^-1)   k_diss(s^-1)   K_D(以M计)   3.9nM   5.7*10⁴  8.2*10^-5  1.4*10^-9

  7.8nM   6.1*10⁴  1.0*10^-5  1.6*10^-9  15.62nM   6.2*10⁴  8.0*10^-5  1.3*10^-9  31.25nM   6.3*10⁴  9.7*10^-5  1.5*10^-9  62.5nM   6.6*10⁴  9.0*10^-5  1.4*10^-9  125nM   6.2*10⁴  8.9*10^-5  1.4*10^-9  均值   6.2*10⁴±0.3*10⁴  8.9*10^-5±0.7*10^-5  1.4*10^-9±0.1*10^-9

实施例5：

人肺泡细胞损伤的组织培养物模型

将人A549肺泡上皮细胞以每孔3x10e5个细胞的密度在RPMI培养基 (#R0883，Sigma-Aldrich)中分配。平行地，将渐增浓度的α-毒素 (5μg/ml-50μg/ml；#120，List Biological Laboratories)与仅培养基、20μg/ml同种 型对照抗体(人IgGIλ，纯化的骨髓瘤蛋白；#I 5029，Sigma-Aldrich)或20μg/ml 纯化的单克隆抗体243-4一起预温育。于37℃温育4小时后，将α-毒素或α-毒 素-抗体溶液添加至细胞，并再进行温育16小时。所述时间后，通过乳酸盐 脱氢酶(LDH)测定法(#04744934001，Roche)分析细胞，所述测定法提供释放 入培养液中的细胞LDH的读出，如图6中所显示的。

实施例6：

多器官感染的小鼠模型

手术前将雌性Balb/c小鼠(Charles River，Sulzfeld，Germany)(重量为 27-31g)适应14天。自供应商获得规定为无病原体的小鼠。为了放置插管， 用赛拉嗪(8mg/kg体重)/氯胺酮(100mg/kg体重)腹膜内麻醉小鼠。在剃 光的颈左侧产生最小的水平皮肤切口以在上腔静脉中放置单一内腔聚乙烯 插管(外径0.6mm，Medical Instruments，Seeheim，Germany)。插管放置 后24小时，小鼠经由插管接受1x10e7个CFU的金黄色葡萄球菌菌株US300(在 100μl中)和7.5mg/kg纯化的单抗243-4或PBS(在50μl中)。2天后，处理组的 小鼠接受第二剂抗体(5mg/kg)，而对照组的小鼠仅接受PBS。手术后5天，对 小鼠实施安乐死以监测肾细菌载荷和肾脓肿形成。出于所述原因，自实施安 乐死的动物在无菌条件下收获肾，并在盐水中均质化。在器官取出前，确认 上腔静脉中的插管位置，并在肾均质化前，对器官目视检查脓肿形成。最后， 将器官匀浆的连续稀释液在MPK板上于37℃培养至少48小时。计算菌落形成 单位(CFU)，并记录为CFU/肾，如图7中所显示的。

表4

处理和对照组动物中的差别的肾脓肿形成

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