高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A及其生产

摘要

本发明涉及高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A及其生产。本发明还提供了包含所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的亲和层析柱。本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A与野生型蛋白A相比，稳定性大大提高，具有更强的抗体结合能力。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及高稳定性的具抗体结合 能力的重组蛋白A及其生产。

背景技术

蛋白A(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，为其表 面的一种膜蛋白。蛋白A具有与抗体特异性结合的能力，蛋白A亲和层析柱已 成为生物技术领域应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养 上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc 片段的基因工程重组蛋白。蛋白A可以通过基因工程重组技术生产。

但是，目前市场销售的蛋白A具有不稳定的缺陷，从而影响其使用。本领 域还需要进一步优化蛋白A及其生产技术，以提高其稳定性以及抗原结合能力， 进而提高其应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A 及其生产方法。

在本发明的第一方面，提供一种具抗体结合能力的重组蛋白A，其是：

(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白；或

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(如 1-10个，较佳地1-5个，更佳地1-3个)且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a) 衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的缺失或添加发生在蛋白的羧基端、氨基端或者二 者兼有。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其选自下组：

(i)编码所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载 体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的具抗体结合能力的重组蛋白A 的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。

在另一优选例中，在温度20±10℃下培养所述的宿主细胞。

在另一优选例中，在温度20±7℃下培养所述的宿主细胞；更佳地在温度20 ±5℃下培养所述的宿主细胞；更佳地在温度15±3℃下培养所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，培养所述宿主细胞过程 中采用IPTG或乳糖诱导表达。

在另一优选例中，采用0.05-2.0mM浓度的IPTG诱导表达。

在本发明的另一方面，提供所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的用途， 用于结合抗体；或用于制备抗体亲和柱；或用于抗体的纯化。

在本发明的另一方面，提供一种纯化抗体的亲和柱，其包括亲和介质，以 及附着于所述亲和介质的所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。

在另一优选例中，所述的亲和介质选自(但不限于)：琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶、纤维素、大孔吸附树脂等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

附图说明

图1、左图为金黄色葡萄球菌基因组抽提结果；右图为全长SPA(FL)与截短 体SPA(32-327)PCR产物的电泳鉴定结果。图中SPA-32指截短体SPA(32-327)。

图2、菌落PCR鉴定结果。

图3、将该重组表达载体转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，并进行诱 导表达。

其中，Lane1：诱导前；Lane2，3，4，5：0.5mM IPTG诱导后。

图4左图：SDS-PAGE检测在不同的温度条件下培养重组SPA(32-327) BL21(DE3)细胞，获得的培养上清和包涵体形式蛋白的表达情况。

图4右图：为SDS-PAGE检测在不同的诱导条件下培养重组BL21(DE3) 细胞中蛋白的表达情况。其中Lane 1：诱导前；Lane 2：0.1mM IPTG；Lane 3： 0.5mM IPTG；Lane 4：1.0mM IPTG；Lane 5：10mM IPTG。Sup：上清；Pel： 沉淀。

图5、不同温度下SPA(32-327)的生长曲线图。

图6、发酵进程曲线。

图7、SDS-PAGE电泳鉴定DEAE-FF纯化蛋白。各泳道分别为：1： SPA(32-327)上清；2：流出液；3，4，5：目的蛋白。

图8、Ni-NTA纯化SPA(32-327)。

图9、SPA(32-327)冻干前后的稳定性鉴定。其中各泳道分别为：1： SPA(32-327)冻干前；2：SPA(32-327)-His冻干前；3：SPA(32-327)冻干后；4： SPA(32-327)-His冻干后。

图10、不同蛋白浓度的SPA(32-327)或SPA(32-327)-His的Dottern实验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种高稳定性的具抗体结合能 力的重组蛋白A，与野生型蛋白A相比，该重组蛋白A稳定性大大提高，具有更 强的抗体结合能力。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，除非另外说明，所述的“具抗体结合能力的重组蛋白A”、 “SPA(32-327)”、“截短体蛋白SPA(32-327)”、“截短体蛋白”等可互换使 用，均是指相对于野生型蛋白A，其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白；更佳地，相 对于野生型蛋白A，其羧基端还缺少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。

若需要表示野生型的蛋白，除非另外说明，其将被标示为“野生型蛋白A”、 “SPA(FL)全长蛋白”。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的 物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋 白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其 他物质中分开，则为分离纯化的。“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或 大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本 发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从 原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述具抗体结合能力的重组蛋白A的片段、衍生物和类似物。 如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明 的具抗体结合能力的重组蛋白A相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白 片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选 保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不 是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白， 或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇) 融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。 根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范 围。然而，所述的具抗体结合能力的重组蛋白A及其片段、衍生物和类似物的氨 基酸序列中，相对于野生型蛋白A，其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白更佳地，相 对于野生型蛋白A，其羧基端还缺少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。

在本发明中，术语“具抗体结合能力的重组蛋白A”指具有本发明的具抗体 结合能力的重组蛋白A活性的SEQ ID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与所 述具抗体结合能力的重组蛋白A相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这 些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳 如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末 端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个 以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通 常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端添加一个或数个氨基酸通常也不 会改变蛋白质的功能。该术语还包括具抗体结合能力的重组蛋白A的活性片段和 活性衍生物。最好的，在这些SEQ ID NO：2的变异形式中，相对于野生型蛋白A， 其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白；更佳地，相对于野生型蛋白A，其羧基端还缺 少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。

蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与具抗体结合能力的重组蛋白A的 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用所述抗具抗体结合能力的重组蛋白A 的抗血清获得的蛋白或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含具抗体结合能 力的重组蛋白A或其片段的融合蛋白。

发明还提供具抗体结合能力的重组蛋白A或蛋白的类似物。这些类似物与具 抗体结合能力的重组蛋白A的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响 序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变 异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生 随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括 具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在 的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限 于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式 如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残 基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高 了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“具抗体结合能力的重组蛋白A保守性变异蛋白”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳 地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成 蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

  最初的残基  代表性的取代   优选的取代   Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val

  Arg(R)  Lys；Gln；Asn  Lys   Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg  Gln   Asp(D)  Glu  Glu   Cys(C)  Ser  Ser   Gln(Q)  Asn  Asn   Glu(E)  Asp  Asp   Gly(G)  Pro；Ala  Ala   His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg  Arg   Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe  Leu   Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe  Ile   Lys(K)  Arg；Gln；Asn  Arg   Met(M)  Leu；Phe；Ile  Leu   Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr  Leu   Pro(P)  Ala  Ala   Ser(S)  Thr  Thr   Thr(T)  Ser  Ser   Trp(W)  Tyr；Phe  Tyr   Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser  Phe   Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala  Leu

本发明还提供了编码本发明具抗体结合能力的重组蛋白A或其保守性变异 蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基 因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编 码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码 区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中 是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有 差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序 列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的 附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以 是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序 列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发 生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替 换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改 变其编码的蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至 少70％，更佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发 明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明 中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2 ×SSC，0.I％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％ 小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以 上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：2所示的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段” 的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸， 最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定 和/或分离编码具抗体结合能力的重组蛋白A的多聚核苷酸。

本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A核苷酸全长序列或其片段通常可以 用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发 明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增 而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将 各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其 衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋 白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或具抗 体结合能力的重组蛋白A编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术 产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的 多聚核苷酸序列来表达或生产重组的具抗体结合能力的重组蛋白A。一般来说有 以下步骤：

(1).用本发明的编码具抗体结合能力的重组蛋白A的多核苷酸(或变异体)，或 用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，具抗体结合能力的重组蛋白A多核苷酸序列可插入到重组表达载 体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、 植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制 和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制 起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具抗体结合能力的重组蛋白A 编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表 达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的 核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于 转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆 菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序 列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300 个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主 细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿 主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收 获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。 如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体 包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的 方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

作为本发明的另一个实例，通过基因工程手段生产具抗体结合能力的重组 蛋白A，比如利用任何适宜的基因工程菌生产所述的具抗体结合能力的重组蛋 白A，分离所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细 胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离 和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包 括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透 破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、 高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的一个具体实施例，所述的具抗体结合能力的重组蛋白A为根 据Genbank(GI：88193823)Staphylococcus aureus全基因序列设计引物，从金黄色 葡萄球菌基因组中调取的SPA(32-327)基因片段。所述的基因片段在与表达载 体连接后，在大肠杆菌中进行表达，获得了表达量较高的克隆。并对表达后的 SPA进行了纯化，纯化后的蛋白具有较强抗体结合能力。

作为本发明的优选方式，所述的具抗体结合能力的重组蛋白A较佳地选择在 低温下表达，其在低温下表达量要高于在高温如37℃下的表达。

本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A较佳地可以用于制备纯化抗体用的亲 和柱。因此，本发明提供了一种纯化抗体的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着 于所述亲和介质的本发明所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。

本发明对所述的亲和介质没有特别但限制，任何适合于附着蛋白A的亲和 介质都是可用的，例如但不限于：琼脂糖(珠)、葡聚糖凝胶、纤维素、大孔吸 附树脂等。

利用本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A制备所述的亲和柱的方法没有 特别的限制，可以采用本领域技术人员熟知的方法和条件。

本发明的主要优点在于：

本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A具有稳定性好、抗体结合能力强的 特点。而全长的蛋白A的稳定性差。

本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A具有高的抗体结合能力。可用于制 备蛋白A的抗体亲和柱，用于抗体的纯化。在本发明的实施例中，经证实6ng的 SPA(32-327)就可与抗体结合，并随着蛋白量的增加，与抗体结合的越多。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、基因序列和相应的蛋白序列

所述的SPA(32-327)基因序列如下(SEQ ID NO：1，891bp)：

CCTGCTGCAAATGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTATCAAGTTTTAAA TATGCCTAACTTAAATGCTGATCGACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAA GCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCTCAAGCTCCAAAAGC TGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAAC ATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAA GCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGC TGACAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAAC TTGAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTG CTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAGCGGATAACAA ATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAG AACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTT AGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACAA AGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTA ACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGC TAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAATAA

所述的SPA(32-327)的蛋白序列如下(SEQ ID NO：2，296aa)：

P A A N A A Q H D E A Q Q N A F Y Q V L N M P N L N A D R R N G F I Q S L K D D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K A D A Q Q N N F N K D Q Q S A F Y E I L N M P N L N E A Q R N G F I Q S L K D D P S Q S T N V L G E A K K L N E S Q A P K A D N N F N K E Q Q N A F Y E I L N M P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L T E E Q R N G F I Q S L K D D P S V S K E I L A E A K K L N D A Q A P K

所获得的SPA(32-327)基因序列和相应的蛋白序列(Query 1；SEQ ID NO：2) 及与Genbank(GI：88193823)Staphylococcus aureus序列中相应位点的序列(Sbjct 1，SEQ ID NO：3)的比对如下：

Query 1   PAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADRRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAP  6Q

          PAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNAD+RNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAP

Sbjct 1   PAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAP  6Q

Query 61  KADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQA  12Q

          KADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQA

Sbjct 61  KADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQA  12Q

Query 121 PKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK  18Q

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Sbjct 121 PKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK  18Q

Query 181 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAD  24Q

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Sbjct 181 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAD  24Q

Query 241 NKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK      296

          NKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK

Sbjct 241 NKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK      296

SPA(FL)全长基因序列如下(1503bp，SEQ ID NO：4)：

TTGAAAAAGAAAAACATTTATTCAATTCGTAAACTAGGTGTAGGTATTGCATCTGTAACTTT AGGTACATTACTTATATCTGGTGGCGTAACACCTGCTGCAAATGCTGCGCAACACGATGAA GCTCAACAAAATGCTTTTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAA TGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTC AAAAACTTAATGACTCTCAAGCTCCAAAAGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGA TCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAAT GGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTA ATAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGCTGACAACAATTTCAACAAAGAACAACAAA ATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATC CAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAA ATGAATCTCAAGCACCGAAAGCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTA TGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAA AAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACA AGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTA CATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATC CTTCAGTGAGCAAAGGAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAA AGAGGAAGACAACAACAAACCTGGCAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACA ACAACAAGCCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAAAAAACCTG GTAAGGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGATG GCAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACGGAGTAC ATGTCGTTAAACCTGGTGATACAGTAAATGACATTGCAAAAGCAAACGGCACTACTGCTGA CAAAATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGATAAAAACATGATCAAACCTGGTCAAGAACTT GTTGTTGATAAGAAGCAACCAGCAAACCATGCAGATGCTAACAAAGCTCAAGCATTACCAG AAACTGGTGAAGAAAATCCATTCATCGGTACAACTGTATTTGGTGGATTATCATTAGCGTTA GGTGCAGCGTTATTAGCTGGACGTCGTCGCGAACTATAA

SPA(FL)全长蛋白序列如下(500aa，SEQ ID NO：5)：

L K K K N I Y S I R K L G V G I A S V T L G T L L I S G G V T P A A N A A Q H D E A Q Q N A F Y Q V L N M P N L N A D Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K A D A Q Q N N F N K D Q Q S A F Y E I L N M P N L N E A Q R N G F I Q S L K D D P S Q S T N V L G E A N K L N E S Q A P K A D N N F N K E Q Q N A F Y E I L N M P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L T E E Q R N G F I Q S L K D D P S V S K G I L A E A K K L N D A Q A P K E E D N N K P G K E D N N K P G K E D N N K P G K E D G N K P G K E D N K K P G K E D N K K P G K E D N K K P G K E D G N K P G K E D N K K P G K E D G N G V H V V K P G D T V N D I A K A N G T T A D K I A A D N K L A D K N M I K P G Q E L V V D K K Q P A N H A D A N K A Q A L P E T G E E N P F I G T T V F G G L S L A L G A A L L A G R R R E L

SPA(FL)全长蛋白序列(Query 1；SEQ ID NO：5)及与Genbank(GI：88193823) Staphylococcus aureus序列(Sbjct 1，SEQ ID NO：6)的比对结果如下：

Query 1   LKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQ  60

          +KKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQ

Sbjct 1   MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQ  60

Query 61  RNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEA  120

          RNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEA

Sbjct 61  RNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEA  120

Query 121 QRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEANKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQR 180

          QRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA KLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQR

Sbjct 121 QRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQR 180

Query 181 NGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNG 240

          NGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNG

Sbjct 181 NGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNG 240

Query 241 FIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFI 300

          FIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFI

Sbjct 241 FIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFI 300

Query 301 QSLKDDPSVSKGILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPG----------------KEDNNKPGK 344

          QSLKDDPSVSKILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPG                 KEDNNKPGK

Sbjct 301 QSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGK 360

Query 345 EDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDNKKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGN 404

          EDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKED KPGKEDNKKPGKEDGNKPGKED KPGKEDGN

Sbjct 361 EDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGN 420

Query 405 GVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQ 464

          GVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQ

Sbjct 421 GVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQ 480

Query 465 ALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL  500

          ALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL

Sbjct 481 ALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL  516

实施例2、SPA(FL)全长基因和SPA(32-327)基因的克隆与表达鉴定

1、PCR扩增获得截短体SPA(32-327)和全长SPA(FL)

培养金黄色葡萄球菌，常规方法抽提其基因组DNA。

设计以下扩增引物用于扩增截短体SPA(32-327)的编码基因：

正向：CGCCATATGCCTGCTGCAAATGCTGCGC(SEQ ID NO：7)

反向：CCGCTCGAGTTATTTTGGTGCTTGAGC(SEQ ID NO：8)

设计以下扩增引物用于扩增全长SPA(FL)的编码基因：

正向：CGCCATATGTTGAAAAAGAAAAACATTTATTC(SEQ ID NO：9)

反向：CCGCTCGAGTTATAGTTCGCGACGACG(SEQ ID NO：10)

分别采用以上引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，分别扩增获 得全长SPA(FL)与截短体SPA(32-327)。PCR产物的电泳鉴定结果见图1。

将上述获得的全长SPA(FL)与截短体SPA(32-327)PCR产物以NdeI/Xho I 酶切，酶切产物连接于pGEM-T载体(购自Progema)，将重组在日转化入感受 态的大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆于LB培养基中摇过夜，菌落PCR鉴定 结果如图2。经测序验证获得了正确的序列。

利用Nde I/Xho I双酶切从pGEM-T载体中切出DNA片段后插入至表达载 体pET-24a(购自Progema)的相应位点内，获得pET-24a/SPA(32-327)和 pET-24a/SPA(FL)。将上述重组表达载体转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)， 并进行诱导表达。结果，感受态细胞中，SPA(32-327)有表达，而SPA(FL)未表 达成功，见图3。

实施例3、SPA(32-327)的表达优化

请提供培养重组BL21(DE3)细胞的具体方法：挑取转化平板上的单克隆菌 落，接种至30mL LB培养液中(含100μg/mL Amp)，置于37℃摇床过夜培养 (10～12h)后，以2％接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度至OD600 0.5～0.6 时，于37℃和12℃下分别加入终浓度0.5mmol/L IPTG诱导4小时，10000rpm离 心收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心，对离心后上清和沉淀分别进行电 泳鉴定。

基于以上方法，考察不同温度对SPA(32-327)的表达量的影响，以及不同 IPTG浓度对诱导SPA(32-327)表达的影响。

将前述制备的转入了pET-24a/SPA(32-327)的BL21(DE3)细胞在不同的温度 (15℃、30℃和37℃)下表达，观察细胞表达SPA(32-327)的情况。在这些温度下 表达采用的IPTG浓度均为0.5mM。结果见图4左图以及图5。可见，重组细胞在 30℃与37℃下诱导后生长缓慢，其可能原因为SPA(32-327)在较高温下过快表达 对菌体生长有抑制作用，而较低温诱导下，SPA(32-327)表达速度慢，抑制作用 弱，故菌体得以继续生长。

前述制备的转入了pET-24a/SPA(32-327)的BL21(DE3)细胞给予不同的 IPTG浓度(0.1mM、0.5mM、1.0mM和10mM)诱导。观察细胞表达SPA(32-327) 的情况。在上述诱导浓度下表达采用的温度均为37℃。结果见图4右图。可见， 在不同的IPTG诱导浓度下，蛋白表达的差异不大。

实施例4、SPA(32-327)的10L发酵罐的高密度发酵

种子培养基：胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，NaCl 1％(w/v)， 用5M NaOH调pH至7.0；

发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 10g/L，NH₄Cl 2g/L， K₂HPO₄ 10.7g/L，KH₂PO₄ 5.2g/L，MgSO₄ 1g/L，用10M NaOH调pH至 7.0；

一级种子培养：以1％的接种量将种子液接入装液量为30ml/250ml的LB培 养基(50ug/ml Kan)的三角瓶中，摇床转速为180r/min，37℃培养6～8h。

二级种子培养：以1％的接种量将一级种子接入装液量分别为30ml/250ml 和200ml/500ml的LB培养基(50ug/ml Kan)的三角瓶中，摇床转速为180r/min， 37℃过夜培养。

发酵前期通气量控制在5L/min，搅拌转速控制在150r/min，整个过程中控 制DO在30％左右，所以之后加大通气量和搅拌转速，以维持DO水平，最后 将通气量和搅拌转速提至最大。整个发酵过程中温度控制在37℃。当还原糖耗 尽，开始流加式补料。当菌体处于对数生长后期时加0.5mM IPTG诱导，诱导 5h后放罐，离心收集菌体。

发酵进程曲线见图6。

上述发酵得到的菌体湿重约为450g。蛋白被表达，并以可溶性形式表达。

实施例5、SPA(32-327)的离子交换纯化研究

采用离子交换柱DEAE Sepharose FF纯化SPA(32-327)。

10g重组BL21(DE3)菌体用100ml裂解缓冲液(50mM Tris.Hcl，pH 8.0)悬浮， 超声破碎，稀释4倍后，400ml上清上样于30ml DEAE Sepharose FF柱，用50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0缓冲液平衡至基线平稳后，用0～0.3mmol/L的NaCl洗 脱液进行连续梯度洗脱，经过SDS-PAGE电泳(图7)，纯化后所收集的蛋白为 SPA(32-327)。

实施例6、SPA(32-327)的镍柱亲和层析纯化

构建带His-Tag的SPA(FL)与SPA(32-327)，准备采用镍柱亲和层析纯化蛋 白。构建和蛋白表达的方法为：

设计以下扩增引物用于扩增截短体SPA(32-327)的编码基因：

正向：CGCGAATTCCCTGCTGCAAATGCTGCGC(SEQ ID NO：11)

反向：CCGCTCGAGTTATTTTGGTGCTTGAGC(SEQ ID NO：8)

其中正向引物中含有EcoR I，将其构建到相同酶切的pET-24a，在翻译时， 蛋白的N端就含有一段质粒本身编码的6His的蛋白序列，从而可以用Ni亲和 柱进行纯化。

His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)是用于纯化6×His标签重组蛋白的一 种纯化介质，6×His可与Ni²⁺螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介 质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或 低PH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。

15℃过夜诱导以上获得的重组BL21(DE3)菌体1L，获得的菌体用40ml裂解 缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl)超声破碎。Ni-NTA琼脂糖胶体积为3ml， 40ml上清上柱后，用5倍柱体积的裂解缓冲液平衡。分别用4倍柱体积的10mM， 20mM，40mM，80mM，250mM咪唑洗脱。由图8可知，SPA(32-327)在50mM 咪唑存在的条件下就可被洗脱，60mM以上浓度的咪唑可得纯度很高的 SPA(32-327)。

实施例7、SPA(32-327)的冻干稳定性

采用的冻干方法为：将纯化后的SPA(32-327)、SPA(32-327)-His分装在5ml 冻干管中，-80℃预冻过夜，次日，放入于真空冷冻干燥器内抽真空冻干48h。

鉴定经过冻干过程的SPA(32-327)的稳定性的方法如下：称取少量冻干品， 用纯水配成1mg/ml，溶解性极好，与冻干前样品对比进行SDS-PAGE电泳检测， 未见降解。

结果如图9。可见，SPA(32-327)在冻干过程中极为稳定。

实施例8、SPA(32-327)-His与IgG抗体亲和性研究

1.ELISA试验

取稀释1000倍的样品(前述表达并纯化的SPA(32-327)-His蛋白样品)100μl (20ng)，样品浓度0.2mg/ml。ELISA试剂盒购自Roche公司。

(1)点样：将纯化后样品逐级10倍稀释后取3μl点样于NC膜上，用保鲜 膜封好后于37℃孵育2h；

(2)封闭：将NC膜置于封闭液中4℃封闭过夜；

(3)洗涤：用洗涤液PBST洗膜3次，每次10min；

(4)与二抗反应：将二抗用稀释液稀释4000倍，并将NC膜浸入其中，37℃ 孵育2h；

(5)洗涤：用洗涤液PBST洗膜3次，每次10min；

(6)显色：将NC膜浸入DAB显色液中，室温显色5min后用去离子水终 止反应。

(7)HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍 加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧 光条带(5min左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶 片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，进行 分析与扫描。

结果如表2。其中SPA-32表示SPA(32-327)，对照表示试剂盒提供的阳性对 照。

表2

由表可知，经表达并纯化的SPA-32与羊抗鼠IgG亲和力较高，与羊抗兔亲 和力较低。

2.Dottern实验

将不同浓度的SPA(32-327)或SPA(32-327)-His点样于NC膜上，4℃封闭过夜 后PBST洗涤3遍，每次10分钟；10ml PBS(0.1％脱脂奶粉)加二抗HRP-羊抗鼠 IgG(0.4mg/ml，购自Roche)2μl，孵育2h；PBSR洗涤3遍，显色工作液1.5ml覆 盖NC膜，孵育5min；曝光，显影。与抗体结合的越多，颜色越深。

由图10可知，6ng的SPA(32-327)就可与抗体结合，并随着蛋白量的增加， 结合力增强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。