一种用于形成药物复合物的载体多肽、制备方法及其用途

摘要

本发明提供了一种载体多肽，其制备方法，基于该载体多肽的载剂及由该载剂制备的药物组合物，其中所述载体多肽具有通式：GLWWX

说明书

技术领域

本发明涉及药物辅料领域，具体而言，本发明涉及一种载体多肽及其 制备方法和用途，该多肽具有与极性较大的药物(小分子、DNA、RNA、 药用多肽及蛋白类药物)形成复合物的能力，能够增加药物对生物体内降 解因素的稳定性，延长其在体内的半衰期。

背景技术

生物技术药物(特别是蛋白质、多肽)作为药物的研究取得了快速发 展，在2009年的一份调查报告中，324种生物技术药物(包括临床试验或 者正在接受管理部门审查的药物)几乎覆盖了150种疾病，包括癌症、自身 免疫性疾病以及艾滋病等传染病。蛋白质和多肽也存在突出的问题，如给 药系统的不完善，稳定性差，在体内半衰期短，生物利用率低等。通过修 饰来优化蛋白质的代谢动力学特性，以延长其半衰期是经常采用的方法， 而修改过程中一些蛋白和多肽药物会部分或全部失活。所以，寻找一种简 便的、稳定的药物载体将具有重要的意义。

发明内容

本发明涉及使用具有特殊理化性质的多肽与其他极性药物形成复合 物，能够有效提高药物在血液中的半衰期及稳定性。

本发明的一个目的是针对极性药物(特别是生物类药物)在体内存留时 间较短，提供了一种能与极性药物形成复合物的载体多肽，以增加药物对生 物体内降解因素的稳定性，延长其在体内的半衰期。

本发明的另一个目的是提供了载体多肽的制备方法。

本发明的另一个目的是提供了包括所述载体多肽的载剂，及其在制备药 物组合物中的应用。

本发明的另一个目的是提供了载体多肽与极性药物形成的复合物与药 学上可接受的辅料(包括：载体材料、赋形剂、稳定剂或稀释剂等等)形成 的药物组合物及其制备方法。

结合本发明的目的对本发明逐一加以描述：

在本发明的一个方面，提供了载体多肽，及其药学上可接受的盐、酯、 醚、酰胺或其混合物，所述载体多肽具有SEQ ID NO 1氨基酸序列(人工序 列)：

GLWWX₁X₂WWX₃X₄WWX₅X₆X₇WWX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄

SEQ ID NO 1

其中，X₁为Lys或Arg；

X₂为Ala或Val或者Leu；

X₃为Lys或Arg；

X₄为Ala或Val或Leu；

X₅为Lys或Arg；

X₆为Ser或Thr；

X₇为Leu或Val；

X₈为Lys或Arg；

X₉为Lys或Arg；

X₁₀为Lys或Arg；

X₁₁为Lys或Arg或Leu；

X₁₂为Lys或Arg；

X₁₃为Lys或Arg；

X₁₄为Ala或没有。

通式序列的载体多肽的特点为人工合成的含有23或者24个氨基酸的多 肽，N末端为非极性氨基酸末端同时C末端为极性氨基酸末端，在中间W-W 用于形成所需结构。

上述载体多肽优选下列序列的多肽：

载体多肽1(SEQ ID NO 2)：GLWWKAWWKAWWKSLWWRKRKRKA，

载体多肽2(SEQ ID NO 3)：GLWWKVWWKLWWKSLWWRKRLRKA，

载体多肽3(SEQ ID NO 4)：GLWWKLWWKLWWKSLWWRKRKRKA，

载体多肽4(SEQ ID NO 5)：GLWWKLWWKLWWKSLWWRKRLRK。

在本发明的一个方面，载体多肽的制备方法为化学合成法；优选地，其 采用Fmoc方法或者Boc方法并经过HPLC纯化及脱盐。

在本发明的一个实施方案中，使用Fmoc法进行专利所述的载体多肽的 固相合成，多肽的固相合成方法为领域内通用方法。产品适用HPLC进行纯 化及脱盐。

在本发明的另一个方面，提供了载体多肽和/或其药学上可接受的盐、 酯、醚、酰胺或其混合物在制备药物载体中的应用。

在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包括1)前述的载体多 肽和/或其药学上可接受的盐、酯、醚、酰胺或其混合物；及2)极性药物。

本发明所述的药物组合物可以采用本领域公知的一般技术制备。

在本发明一个优选的方面，所述极性药物为小分子药物、多肽药物、 RNA药物或者蛋白类药物；优选地，所述极性药物选自青霉素类、头孢霉 素类、GLP-1多肽、Exendin-4多肽、PKA竞争型多肽抑制、EGFR的siRNA、 单克隆抗体药物。

在本发明一个优选的方面，载体多肽与其他药物的摩尔比为25∶1到 1∶100；优选地，优选地，所述摩尔比为1∶5～1∶50；再优选地，所述摩尔比 为1∶10到1∶20。

在本发明的一个实施方案中，将载体多肽与其他药物制成不同比例的复 合物，以摩尔计算，从10∶1到1∶100，不同的比例得到的复合物具有不同的 释放特性。按照摩尔比例，称取适量的药物，溶于适量的生理盐水、纯水、 PBS缓冲液、或含一定比例(20％以下)的有机溶剂的上述溶液中，称取适 量的载体多肽，溶于适量的生理盐水(或PBS、水)中，在0-5℃温度下， 超声混合1-15分钟，或者搅拌1-3小时，或者放置过夜，溶液可以直接 加辅料做成制剂，也可以冷冻干燥后再与其他辅料一起制成制剂。注：PBS 为磷酸盐。

在本发明一个优选的方面，所述药物组合物还包括可溶性填充剂、pH 调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂的一种或多种。其中，水溶性填 充剂辅料为甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、 半乳糖的一种或多种的组合。pH调节剂为非挥发性的酸，或者生理可接受 的有机或无机酸和碱及盐，或其组合；优选地，其选自橼酸、磷酸、乳酸、 酒石酸、盐酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸 钾、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵及其组合。稳定剂为EDTA-2Na、 硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精 氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲 基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、 聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或多种的组合。渗透压调节剂，是 氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。

在本发明一个优选的方面，所述药物组合物的剂型为冻干粉。

在本发明一个优选的方面，所述药物组合物的剂型为溶液注射剂。

在本发明的另一个方面，提供了剂型为冻干粉的药物组合物的制备方 法，其包括步骤：

1)取多肽药物和载体多肽溶液，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压 调节剂等，加入注射用水，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀释；2)加入 0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，过滤将活性炭除去；3)采 用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状 物并封口。

在本发明的一个实施方案中，采取以下的方法制备剂型为冻干粉的药物 组合物：取多肽药物和载体多肽溶液适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗 透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释 至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，除去活 性炭，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色 疏松块状物，封口即得。

在本发明的另一个方面，提供了剂型为溶液注射剂的药物组合物的制备 方法，其包括步骤：

1)取多肽药物和载体多肽溶液或冻干粉，加入水溶性填充剂、稳定剂、 渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀 释；2)加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，过滤将活性炭 除去；3)采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装并封口。

在本发明的一个实施方案中，采取以下的方法制备剂型为溶液注射剂的 药物组合物：取多肽药物和载体多肽溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、 稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解， 加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟， 脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。

本发明的药用组合物可以用在制备治疗药物方面，治疗的方向依据药物 原来治疗方向一致，通常能够减少给药次数，提高依从性。具体地，本发明 的组合物物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式给药。虽然剂量依治疗对象、 给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的组合物在相当宽的剂量范围内 是有效的。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治 疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症 状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范 围。

本发明具有以下的优点：

1，本发明的载剂能延长药物在体内的浓度持续时间，提供了缓释的功 能；

2，采用本发明的载剂制备的药物组合物有助于减少药物摄取，从而降 低医疗成本。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1载体多肽与其他多肽药物可形成类似脂质体的复合物示意图；

图2表示在小鼠中，GLP-1与载体多肽1-4复合物与对照相比在不同 时间的降血糖功能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例仅为解释性的内 容，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。

实施例1载体多肽1-4的制备

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS 336X 型仪器进行载体多肽1-4的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进 行。

将制得的多肽使用HPLC C18半制备柱进行纯化，流动相为乙腈。经 脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。

实施例2小分子药物与载体多肽1的复合物

极性小分子药物选择青霉素类药物羟氨苄青霉素，按照摩尔比例(以下 比例没有注明同为摩尔比)羟氨苄青霉素与载体多肽1比例10∶1。

称取羟氨苄青霉素，溶于生理盐水形成1mmol/L溶液充分混匀后，称 取0.1mmol的载体多肽1溶于1L的上述生理盐水中，充分混匀后，在4℃ 温度下，超声混合5分钟，得到复合物溶液，并冻干。

实施例3GLP-1多肽与载体多肽1的复合物

称取0.3mg的GLP-1冻干粉，溶于1ml生理盐水，充分混匀后，称取 3.3mg载体多肽1冻干粉溶于上述GLP-1生理盐水中，充分混匀后，在4℃ 温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。

实施例4Exendin-4多肽与载体多肽2的复合物

称取0.42mg的Exendin-4冻干粉，溶于1ml生理盐水，充分混匀后， 称取3.4mg载体多肽2冻干粉溶于上述Exendin-4生理盐水中，充分混匀后， 在4℃温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。

实施例5RNA与载体多肽3的复合物

称取3nmol的EGFR siRNA冻干粉(购自Santa Cruz Biotechnology公 司，sc29301)，溶于1ml PBS缓冲液，充分混匀后，称取0.13mg载体多肽 3冻干粉溶于上述含EGFR siRNA冻干粉的PBS缓冲液中，充分混匀后， 在4℃温度下，搅拌1小时，冷冻干燥得到复合物固体粉末。

实施例6蛋白药物与载体多肽4的复合物

称取10nmol的HER-2单克隆抗体冻干粉(赫塞汀)(MW：23404.2)， 溶于1ml PBS缓冲液，充分混匀后，称取0.34mg载体多肽4冻干粉溶于上 述含赫塞汀的PBS缓冲液中，充分混匀后，在4℃温度下，放置过夜，冷冻 干燥得到复合物固体粉末。

实施例7药物组合物的制备

将加泊洛沙姆0.05g，甘露醇0.2g、乳糖0.1g、注射用水3ml置于10ml 的容器中，搅拌使溶解，加1mol/L的枸橼酸或氢氧化钠调节pH至6.0，冷 却至5℃，取实施例2方法制备的复合物溶液5ml加入其中，继续调补pH 至6.0，加水至10ml。加入10mg活性碳，在5℃下搅拌20分钟，过滤除 去活性炭，采用微孔滤膜(Millipore，Inc)过滤除菌，滤液按每支0.2ml进行分 装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥12小时，至样品温度到5℃后，再干燥 2小时，制得白色疏松块状物，封口即得复合物的药物组合物，置于预充式 的注射器中，规格为100ug/支，4℃以下保存，注射前以200ul注射用水溶 解，后给药。

实施例8药物组合物的制备

NaCl 20mg，枸橼酸10mg，注射用水7ml置于10ml的容器中，搅拌 使溶解，加1mol/L的枸橼酸或氢氧化钠调节pH至6.5，冷却至0℃，取以 实施例3的方法制得的复合物粉末(以Exendin-4重量计算为5mg)加入其中， 继续搅拌溶解，调补pH至6.5，加水至10ml。加入10mg活性碳，在0-4 ℃下搅拌20分钟，过滤除去活性炭，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支 100ul分装入预充式注射器，样品温度到5℃以下保存，规格为50ug/支。

实施例9载体多肽1与小分子药物复合物的血浆稳定性测定

以实施例1的复合物(折合1mg羟氨苄青霉素)，溶在10ml大鼠血浆 中，在37度下放置不同时间(0、0.5、1、4小时)，以HPLC法测定血中药 物含量，计算稳定性。以相同浓度的药物在水溶液中的稳定性进行比较。结 果如下表1所示。

表1载体多肽1与羟氨苄青霉素复合物的血浆稳定性

实施例10载体多肽1与GLP-1多肽组合物的体内半衰期实验

本实施例使用SD大鼠5组，每组10只，其得自上海SLAC动物中心。

将大鼠注射GLP-1及其与载体多肽1的复合物(折合GLP-1为 1000μg/kg，GLP-1与载体多肽1的摩尔比例分别为1∶5，1∶10，1∶20及1∶50)， 分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36、48、72及96小时后 于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。

采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中融合蛋白的浓度，操 作如下：4℃，13,000rpm的速度下离心20分钟得到血清。用GLP-1EIA试 剂盒(Phoenix Pharmaceuticals，INC)对鼠血浆中的GLP-1的浓度进行测定。 试验方法参照公司说明书进行GLP-1浓度测定，并根据结果评价GLP-1稳定 性。

GLP-1及其复合物的体内药代动力学结果见表2，结果显示本发明的 GLP-1复合物在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延长，具有长效特性。

表2GLP-1及其复合物在大鼠体内的半衰期

  样品来源   半衰期(小时)   GLP-1   ＜0.1   GLP-1+多肽1(1∶5)   14.5   GLP-1+多肽1(1∶10)   34.0   GLP-1+多肽1(1∶20)   70.8   GLP-1+多肽1(1∶50)   71.5

实施例11载体多肽3与RNA药物的复合物的稳定性

将载体多肽与EGFR的siRNA的复合物(实施例4的组合物)，分别与 HeLa细胞(上海中科院细胞所)37℃孵育12小时。并于孵育4、6、8、12、 24和48小时后测定EGFR的表达量，结果表明EGFR的siRNA在孵育12 小时后基本丧失其抑制EGFR表达的功能，但是复合物却在给药48小时后 依然存在EGFR表达的抑制作用。

表3载体多肽3与RNA药物的复合物的稳定性实验(％意味着抑制百分 比)

实施例12载体多肽2与GLP-1的复合物的体内稳定性测定

称取0.3mg的GLP-1冻干粉，溶于1ml生理盐水，充分混匀后，称取 3.3mg载体多肽2冻干粉溶于上述GLP-1生理盐水中，充分混匀后(混合比 例为GLP-1∶载体多肽2～1∶10)，在4℃温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得 到复合物固体粉末。分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36、 48、72及96小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。

采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中融合蛋白的浓度，操 作如下：4℃，13,000rpm的速度下离心20分钟得到血清。用GLP-1EIA试 剂盒(Phoenix Pharmaceuticals，INC)对鼠血浆中的GLP-1的浓度进行测定。 试验方法参照公司说明书进行GLP-1浓度测定，并根据结果评价GLP-1稳定 性。

GLP-1及载体多肽2复合物的体内药代动力学结果见表4，结果显示本 发明的GLP-1及载体多肽2复合物在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延 长，具有长效特性。

实施例13载体多肽3与GLP-1的复合物的体内稳定性测定

称取0.3mg的GLP-1冻干粉，溶于1ml生理盐水，充分混匀后，称取 3.2mg载体多肽3冻干粉溶于上述GLP-1生理盐水中，充分混匀后(混合比 例为GLP-1∶载体多肽2～1∶10)，在4℃温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得 到复合物固体粉末。分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36、 48、72及96小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。

采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中融合蛋白的浓度，操 作如下：4℃，13,000rpm的速度下离心20分钟得到血清。用GLP-1EIA试 剂盒(Phoenix Pharmaceuticals，INC)对鼠血浆中的GLP-1的浓度进行测定。 试验方法参照公司说明书进行GLP-1浓度测定，并根据结果评价GLP-1稳定 性。

GLP-1及载体多肽3复合物的体内药代动力学结果见表4，结果显示本 发明的GLP-1及载体多肽3复合物在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延 长，具有长效特性。

实施例14载体多肽4与GLP-1的体内稳定性测定

称取0.3mg的GLP-1冻干粉，溶于1ml生理盐水，充分混匀后，称取 3.2mg载体多肽2冻干粉溶于上述GLP-1生理盐水中，充分混匀后(混合比 例为GLP-1∶载体多肽2～1∶10)，在4℃温度下，搅拌3小时，冷冻干燥得 到复合物固体粉末。分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36、 48、72及96小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。

采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测大鼠血清中融合蛋白的浓度，操 作如下：4℃，13,000rpm的速度下离心20分钟得到血清。用GLP-1EIA试 剂盒(Phoenix Pharmaceuticals，INC)对鼠血浆中的GLP-1的浓度进行测定。 试验方法参照公司说明书进行GLP-1浓度测定，并根据结果评价GLP-1稳定 性。

GLP-1及载体多肽4复合物的体内药代动力学结果见表4，结果显示本 发明的GLP-1及载体多肽4复合物在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延 长，具有长效特性。

表4GLP-1及载体多肽复合物的体内药动力学结果

  样品来源   半衰期(小时)   GLP-1   ＜0.1   GLP-1+多肽2(1∶10)   67.46   GLP-1+多肽3(1∶10)   59.85   GLP-1+多肽4(1∶10)   75.38

实施例15GLP-1与载体多肽复合物的降血糖功能的测定

分别取上述实施例10中GLP-1与载体多肽1(1∶10)的复合物； 实施例12中GLP-1与载体多肽2(1∶10)的复合物；实施例13中GLP-1 与载体多肽3(1∶10)的复合物及实施例14中GLP-1与载体多肽4(1∶ 10)的复合物进行小鼠糖耐量的测定。在小鼠给药后半个小时，小鼠腹腔 注射2g/kg的葡萄糖然后按照图示的时间段对小鼠的血糖进行测定，见图 2。