吉氏巴贝西虫重组抗原及其诊断试剂盒和应用

摘要

本发明公开一种吉氏巴贝西虫重组抗原，该重组抗原包含：吉氏巴贝西虫顶复体分泌蛋白BgTRAP的TSP1功能区和谷氨酸富含区的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明还公开了诊断犬吉氏巴贝西虫病的试剂盒及应用。本发明的吉氏巴贝西虫重组抗原，不仅能实现高效可溶性表达和分离纯化，而且具有良好的抗原性，作为犬吉氏巴贝西虫病的诊断抗原，表现出很好的特异性和较高的敏感性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种吉氏巴贝西虫重组抗原及其诊断试剂盒和应用。 

背景技术

吉氏巴贝西虫(Babesia gibsoni)是寄生在犬红细胞中的一种蜱传原虫，是犬梨形虫病(俗称焦虫病)的主要病原之一，引起犬发热、贫血、血红蛋白尿和消瘦，甚至死亡。目前，吉氏巴贝西虫病的诊断主要依赖于红细胞染色镜检，但对于红细胞染虫率低的非急性感染诊断困难。因此，建立检测抗体的吉氏巴贝西虫血清学诊断方法极其重要。早期用虫体抗原进行血清学诊断，其敏感性和特异性均受到一定限制，近几年，鉴定虫体重要抗原分子并应用重组蛋白进行血清学诊断取得较大进展，其中，顶复体分泌蛋白BgTRAP是一个与细胞入侵有关的重要抗原分子，其原核表达的完整重组蛋白显示了一定的诊断价值。不过BgTRAP全长编码基因表达产物主要以包涵体形式存在，可溶性蛋白表达量极少，分离纯化非常困难，不利于拓展该分子在诊断上的进一步应用。 

发明内容

本发明要解决BgTRAP完整蛋白重组表达产量少、纯化困难的技术问题，提供一种吉氏巴贝西虫重组抗原，该重组抗原包含BgTRAP蛋白TSP1功能区和抗原区的411个氨基酸，是一个可溶性截短型抗原，该截短型抗原不仅能实现高效可溶性表达和分离纯化，而且具有良好的抗原性，适于作为犬吉氏巴贝西虫病的诊断抗原。 

此外，还需要提供一种包含上述吉氏巴贝西虫重组抗原的诊断试剂盒。 

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现： 

在本发明的一个方面，提供了一种吉氏巴贝西虫重组抗原，该重组抗原包含：吉氏巴贝西虫顶复体分泌蛋白BgTRAP的TSP1功能区和谷氨酸富含区的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

在本发明的另一方面，还提供了一种吉氏巴贝西虫重组抗原基因，该重组抗原基因包含：编码吉氏巴贝西虫BgTRAP蛋白TSP1功能区和谷氨酸富含区氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述吉氏巴贝西虫重组抗原基因序列的重组载体。 

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。 

在本发明的另一方面，还提供了一种诊断犬吉氏巴贝西虫病的试剂盒，包含上述吉氏巴贝西虫重组抗原。 

所述试剂盒还包含ELISA酶标板、酶标二抗、酶底物液，其中酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗犬二抗。 

所述试剂盒还包含对照GST蛋白、阳性对照血清、阴性对照血清，其中阳性对照血清为人工感染吉氏巴贝西虫的犬血清，阴性对照血清为正常犬血清。 

在本发明的另一方面，还提供了一种检测犬吉氏巴贝西虫抗体的方法，包括以下步骤： 

用上述吉氏巴贝西虫重组抗原包被ELISA酶标板； 

将待测血清与包被重组抗原作用后，依次加入酶标二抗和酶底物液； 

用酶标仪测波长415nm处的OD值，得检测结果。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述吉氏巴贝西虫重组抗原在制备诊断犬吉氏巴贝西虫病的产品中的应用。 

本发明吉氏巴贝西虫重组抗原，作为ELISA诊断抗原，可明确区分吉氏巴贝西虫感染犬血清和正常犬血清，而与其他病原感染无交叉反应，显示其良好的诊断特异性。犬感染吉氏巴贝西虫系列血清检测结果表明，本发明吉氏巴贝西虫重组抗原对感染早期以及慢性感染期均可检测，表明具有较高敏感性。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1是本发明实施例1的BgTRAP蛋白一级结构及截短型抗原蛋白位置示意图； 

图2是本发明实施例2的PCR产物的电泳结果图； 

图3是本发明实施例2重组tBgTRAP的表达与纯化的SDS-PAGE电泳图； 

图4是本发明实施例3抗重组蛋白的抗血清与吉氏巴贝西虫表面荧光反应的激光显微镜照片图； 

图5是本发明实施例4重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原的特异性试验结果图； 

图6是本发明实施例4检测感染吉氏巴贝西虫犬的抗体消长曲线图。 

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。 

本发明通过吉氏巴贝西虫BgTRAP编码基因的生物信息学分析，选取其C-末端跨膜区前， 包含TSP1功能区和抗原区的411个氨基酸所编码基因片段，重组表达了一个可溶性截短型BgTRAP抗原，解决了完整蛋白重组表达纯化困难的问题。免疫荧光试验表明，本发明截短型抗原具有良好的抗原性。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验(ELISA)诊断抗原，可清晰地区分吉氏巴贝西虫感染犬血清和正常犬血清，而与其他病原感染无交叉反应，显示其诊断的特异性。犬感染吉氏巴贝西虫系列血清检测表明，该抗原可检测早期感染(4d)和感染200d以后的样本，显示其诊断的敏感性。因此，本发明可溶性重组BgTRAP截短型抗原可作为一种诊断制剂检测犬吉氏巴贝西虫抗体。 

实施例1吉氏巴贝西虫BgTRAP基因及编码蛋白的生物信息学分析 

上海兽医研究所周金林等在2006年首次报道了吉氏巴贝西虫BgTRAP分子的鉴定(Zhou J，Fukumoto S，Jia H，et al.Characterization of the Babesia gibsoni P18 as a homologue of thrombospondin related adhesive protein.Mol Biochem Parasitol，2006，148：190-198)，该分子为顶复体分泌的具有很强免疫原性的功能分子，与吉氏巴贝西虫入侵红细胞的生物学过程密切相关。BgTRAP全长cDNA序列已登录Genbank，序列号为AB053292。图1是BgTRAP蛋白的一级结构及本发明截短型抗原蛋白位置示意图，如图1所示，BgTRAP基因全长2,373bp，含有一个编码735个氨基酸的开放阅读框架(ORF)。在预测的蛋白质N-端，有一个疏水性的信号肽序列(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，成熟的蛋白由713个氨基酸构成，分子量为80kDa。蛋白质含有vWFA和TSP1二个结构功能域，在C-末端有一个跨膜区，另外，在TSP1和跨膜区之间是谷氨酸富含区，包括三个五联谷氨酸重复，是蛋白质免疫原性区段。本发明截短型抗原选取C-末端跨膜区前，包含TSP1功能区和抗原区的411个氨基酸(SEQ ID NO.1)所编码基因片段(SEQ ID NO.2)进行重组表达。 

实施例2吉氏巴贝西虫BgTRAP截短型基因的克隆和表达 

1、引物 

根据报道的吉氏巴贝西虫BgTRAP基因序列和编码蛋白的结构分析，选取C-末端跨膜区前，包含TSP1功能区和抗原区的411氨基酸(SEQ ID NO.1)所编码的1233bp的基因片段，设计PCR扩增引物：TRAP-F：5’-GCGAATTCAGTGCACTGGCCCTTGAAGAG-3’(SEQ ID NO.3，包含EcoR I酶切位点，GAATTC)；TRAP-R：5’-GACTCGAGCTTGTACTCCCAGAAAAGAG-3’(SEQ ID NO.4，包含Xhol I酶切位点，CTCGAA)，所用引物由赛百盛公司合成。 

2、吉氏巴贝西虫BgTRAP基因的选择性片段的克隆和表达 

以含全长TRAP基因的重组质粒pBluescriptSK(+)/BgTRAP为模板，截短型抗原基因特异 引物TRAP-F和TRAP-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性2min；然后94℃45sec，55℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环；循环结束后72℃延伸7min。PCR扩增反应产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳分析。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将纯化产物经EcoR I和Xho I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，连接于同样酶切处理的pGEX-4T-1空质粒中，将连接产物转化感受态细胞DH-5α，提取重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，阳性的重组质粒转化宿主菌BL21。重组表达菌在37℃，1mM IPTG诱导下进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析。重组蛋白用GST融合蛋白纯化系统纯化，BCA试剂盒测定蛋白浓度。 

3、结果 

以含有全长吉氏巴贝西虫BgTRAP基因序列的质粒pBluescriptSK(+)/BgTRAP为模板，经截短型基因特异性引物TRAP-F和TRAP-R的PCR扩增，可获得预期大小为1233bp左右的特异片段(见图2)，图2中，1.DNA标准分子量；2.PCR产物。目的基因经胶回收、连接于表达质粒pGEX-4T-1中，阳性质粒经测序分析，结果证实目的基因已连接到表达载体质粒中，表明表达重组质粒构建成功。重组阳性质粒再转化宿主菌BL21(DE3)，经1mM IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明，空质粒pGEX-4T-1表达的GST标签蛋白为26kDa左右，重组质粒表达的融合蛋白约为71k Da左右，与预期分析的大小基本相一致(tBgTRAP预测的蛋白质分子量为45kDa)，结果显示该基因可以在原核系统中成功表达。细菌经反复冰融和超声波处理后，并用SDS-PAGE检测，表明该融合蛋白以可溶性的蛋白形式存在，表达产物经GST融合蛋白纯化系统纯化，得到单一条带(见图3)。图3中，1.蛋白质标准分子量；2.未诱导的重组菌；3.诱导的重组菌；4.纯化后的重组蛋白。 

实施例3重组蛋白抗血清的制备和免疫荧光试验 

1、方法步骤 

将实施例2纯化的重组截短型蛋白和对照GST蛋白按常规方法免疫小白鼠，经琼脂扩散实验测定效价1∶16以上，眼球采血，制备抗血清。抗血清梯度稀释进行免疫荧光实验，免疫荧光试验参照zhou et al(2006)方法进行，具体如下：(1)染虫红细胞抗原片制备，选优质载玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将PBS洗净后的犬感染吉氏巴贝西虫染虫红细胞，滴于玻片上。用含2.5％丙酮的甲醇固定30min，固定后以冷的0.01M PBS(pH 7.4)液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。(2)取固定标本，加不同稀释度的重组GST-TRAP免疫鼠血清(试验组)或重组GST免疫鼠血清(对照组)，37℃孵育30min。(3)以PBS液3×5min冲洗；(4)再加1∶5000稀释的荧光标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育30min；(5)PBS 3×5min冲洗；(6)加含50μg·mL^-1 RNase A的6.25μg·mL^-1 propidium iodide(PI)；(7)PBS 3×5min冲洗；加甘油缓冲液，封片、荧光显微镜检和激光显微镜检查。 

2、结果 

结果表明，抗重组截短型蛋白的抗血清可以与红细胞中的虫体发生特异性反应，而与宿主红细胞无反应(见图4)，对照GST蛋白的抗血清则都没有反应信号。图4显示的是抗血清1∶500稀释后的免疫反应结果，虫体表面特异性免疫荧光反应通过激光显微镜的观察可见，结果证实，截短的重组TRAP蛋白保留了完整蛋白的免疫原性。在图4中，A.免疫荧光染色；B.虫体核酸的染色；C.感染红细胞的相差图；D.重叠照片结果。 

实施例4重组截短型蛋白作为酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断抗原的实验 

1、重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原的特异性分析 

选用人工感染的吉氏巴贝西虫感染的阳性血清、正常犬血清、犬巴贝西虫感染血清、锥虫感染犬血清和弓形虫感染犬血清，进行重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原的特异性分析样本。重组截短型蛋白抗原GST-TRAP和对照GST蛋白分别以0.1μg/ml包被在96孔板，空白对照加PBS。待检血清用PBST 1∶200稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG，用PBST1∶4000稀释使用。底物为新配制的ABTS酶底物液，ELISA结果用酶标仪在波长415nm处测OD值表示。 

结果表明重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原可以明确区分感染血清和正常狗血清，而对照GST蛋白则对阴性和阳性血清样品都没有反应。为了验证重组截短型蛋白在诊断上的特异性，选择与吉氏巴贝西虫近似的犬巴贝西虫不同亚种、犬弓形虫和锥虫感染的血清进行测试，结果如图5所示，只有吉氏巴贝西虫感染犬血清能被检测出，其他虫感染的犬血清均为阴性，显示了该抗原良好的诊断特异性。图5中，1.正常犬血清；2.吉氏巴贝西虫感染血清；3.伊氏锥虫感染血清；4.犬巴贝西虫罗氏株感染血清；5.犬巴贝西虫韦氏株感染血清；6.犬巴贝西虫指名株感染血清；7.刚地弓形虫感染血清。 

2、重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原检测感染吉氏巴贝西虫犬的抗体消长情况 

为了检验重组截短型蛋白作为ELISA诊断抗原检测犬吉氏巴贝西虫病的敏感性和适宜范围，进一步明确其诊断价值，选用吉氏巴贝西虫人工感染的犬系列血清，进行犬体内抗体消长的检测分析。 

检测结果表明，重组截短型抗原作为ELISA诊断抗原可从感染后4d检测到明显的抗体，7d后抗体维持在较高的水平，随后到感染207d抗体仍均维持较高水平，尽管犬感染后红细胞染虫率已经很低(图6)。这个结果说明，截短型表达的重组蛋白显示了良好的免疫反应性， 作为ELISA诊断抗原，在感染早期以及慢性感染期均有诊断或检测价值。 

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

序列表 

<110>中国农业科学院上海兽医研究所 

<120>吉氏巴贝西虫重组抗原及其诊断试剂盒和应用 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>411 

<212>PRT 

<213>Babesia gibsoni 

<400>1 

Ser Ala Leu Ala Leu Glu Glu Ala Leu Tyr Ala Arg Arg Asn Gly Val 

1               5                   10                  15 

Thr Ile Phe Ser Leu Asp Ile Gly Glu Arg Ser Ser Gly Phe Trp Lys 

            20                  25                  30 

Gln Val Val Gly Cys Arg Ala Gly His Arg Cys Leu Lys Tyr Met Ser 

        35                  40                  45 

Ala Leu Asn Gln Glu Leu Leu Glu Lys Val Gly Thr Met Val Arg Asn 

    50                  55                  60 

Leu Cys Glu Pro Asp Gly Arg Asp Ala Val Cys Leu Glu Glu Trp Ser 

65                  70                  75                  80 

Glu Tyr Thr Ala Cys Ser Lys Pro Cys Gly Ile Gly Leu Lys Thr Ser 

                85                  90                  95 

Thr Leu Lys Gly His Lys Thr Leu Leu Thr Thr Thr Asn Gly Ala Asn 

            100                 105                 110 

Gly Ile Lys Gly Arg Thr Cys Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Lys Thr 

        115                 120                 125 

Lys Gln Leu Leu Cys Asn Thr Lys Gln Cys Asn Arg His Pro Tyr Pro 

    130                 135                 140 

Ala Asn Thr Met His His Ser Ser His Thr Asp Gly Leu Pro Ser Gly 

145                 150                 155                 160 

Ala Asn Glu Tyr Thr Ala Ala Tyr Gln Asn Gly Glu Gly Asp Val Val 

                165                 170                 175 

Asp Thr Met Val Glu Gly Lys Thr Asp Glu Glu Glu Pro Thr Gly Gly 

            180                 185                 190 

Asp Val Ser Val Pro Thr Thr Pro Ala Glu Pro Arg His Pro Lys Lys 

        195                 200                 205 

Glu Gln Tyr Phe Pro Leu Asn Pro Asp Asp Thr Asp Ile Ile Asp Pro 

    210                 215                 220 

Tyr Pro Gly Phe Asn Pro Thr Asp Glu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Leu 

225                 230                 235                 240 

Gly Asp Glu Met Gly Leu Thr Thr Asn Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu 

                245                 250                 255 

Glu Met Glu Asp Gln Thr Leu Asp Glu Glu Ser His Asp Glu Ala Asp 

            260                 265                 270 

Asp Thr Glu Glu Ser Val Thr Asp Ala His Pro His Pro Arg His Thr 

        275                 280                 285 

Asp Leu Glu Asp Gly Tle Ala Asp Ala Leu Asn Glu Met Asp Asp Tyr 

    290                 295                 300 

Ser His Glu Asp Glu Tyr Asp His Glu Ala Asp Ala Glu Glu Glu Glu 

305                 310                 315                 320 

Glu Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Asp Tyr Ser 

                325                 330                 335 

Glu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Asp Asp Arg Gly Asn 

            340                 345                 350 

Ile Ile Lys Asp Asp Phe His Glu Gly Asp Tyr Asp Met Asp Ala Arg 

        355                 360                 365 

Arg Gly Pro Tyr Gly Ile Asp Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Glu Gly Leu 

    370                 375                 380 

Tyr Glu Asp Gln Gln Glu Asn Glu Tyr Gly Gly Gly Asn Asn Met Phe 

385                 390                 395                 400 

Asp Gly Lys Met Pro Leu Phe Trp Glu Tyr Lys 

                405                 410 

<210>2 

<211>1233 

<212>DNA 

<213>Babesia gibsoni 

<400>2 

agtgcactgg cccttgaaga ggctctctat gcgcgccgta atggtgtaac catattttct     60 

ctggacattg gggaaagaag cagtggattt tggaagcagg ttgtaggctg tcgtgctggg    120 

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cacaagacgt tgttgactac cacaaatgga gcgaacggca taaaagggag aacatgtgag    360 

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cacccttacc cagcgaatac aatgcaccac agcagccaca ctgatggact tccatctgga    480 

gcgaatgaat acactgccgc ataccagaac ggggaaggtg atgtagttga tactatggtt    540 

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gaggcagagg agacggagga agaagaagag gatgaagatg attactcaga agacgaagat    1020 

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gacggaaaga tgcctctttt ctgggagtac aag                                 1233 

<210>3 

<211>29 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<222>(1)..(29) 

<223>引物 

<400>3 

gcgaattcag tgcactggcc cttgaagag                                      29 

<210>4 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<222>(1)..(28) 

<223>引物 

<400>4 

gactcgagct tgtactccca gaaaagag                                      28。