1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物及其应用

摘要

本发明公开了1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物及其应用，结构通式如下：

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及的是一种新型1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4- 吡唑甲酰胺类化合物及其应用。

背景技术

肿瘤是困扰现代人健康的一大顽症，它发病率高、死亡率高、复发率高、治疗难。 每年全世界约有700万人死于癌症，约占总死亡人数的四分之一。其中，乳腺癌和卵巢 癌则是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌。目前我 国现有癌症患者死亡率逾30％，已成为我国居民死亡的第二大因素。药物治疗已成为对 恶性肿瘤有效而又普遍使用的一种治疗方法。2010年全球抗肿瘤药物销售额约为600 亿美元。临床上应用的抗肿瘤药物种类繁多，其中化疗药物主要有烷化剂铂络合物抗肿 瘤药物、葱环类抗肿瘤药物、破坏DNA的抗生素等。此外，天然抗肿瘤药物的研究也占 有相当大的比例，如目前临床上常用一些药物有喜树碱、长春新碱、紫杉醇等。然而， 现有的抗肿瘤药物存在着选择性较差、毒副作用、耐药性等问题。寻找高效低毒的抗肿 瘤药物仍是科学家面临的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供新型的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合 物，该类化合物药理活性结果显示其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用。

本发明的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物结构通式如下：

通式(I)

R₁，R₂是可以独立地为氢，苄基或烷基或者R₁和R₂与它们所连接的N一起形成下述 基团：咪唑烷基、2-咪唑烷基、3-咪唑烷基、吡咯基、2H-吡咯基、2-吡咯啉基、吡咯 烷基、三唑基、吡唑基、哌嗪基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、吗啉基、硫代吗啉基；所 述基团可任选被羟基、卤素、烷基、氨基、卤代烷基、烷硫基烷基、烷氧基烷基或嘧啶 基取代或如下所示基团取代：

其中Y是S，O，NH或N-烷基；

R₁和R₂可以相同或不同；R₃是H、CF₃、Br、NO₂、CH₃和OCH₃中的任一种；R₄是 氢、卤素、氰基、羟基、卤代烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷硫基、烷硫基烷基；

上述化合物的合以2-氰基乙酰胺为起始原料经过路线I或乙酰乙酸乙酯为起始原 料经过路线II而制得，具体合成路线如下：

合成路线I：

合成路线II：

依据上述合成途径，可以得到下述结构的药物：

上述药物可加入一种或多种药物载体或赋形剂，制备成片剂、胶囊剂、散剂、丸 剂、颗粒剂或乳剂。通过药理活性试验表明其对肿瘤细胞株有很好的抑制作用。

附图说明

图1为化合物(1)H NMR图谱；

图2为化合物(2)H NMR图谱；

图3为化合物(3)H NMR图谱；

图4为化合物(4)H NMR图谱；

图5为化合物(5)H NMR图谱；

图6为化合物(6)H NMR图谱；

图7为化合物(7)H NMR图谱；

图8为化合物(8)H NMR图谱；

图9为化合物(9)H NMR图谱；

图10为化合物(10)H NMR图谱；

图11为化合物(11)H NMR图谱；

图12为化合物(12)H NMR图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：化合物(1)的合成

采用合成路线I的方式：

将2-氰基乙酰胺(3.36g，39.96mmol)用7mL乙酸溶解在250mL圆底烧瓶中，同 时在该烧瓶中加入1，1，1-三乙氧基乙烷(7.13g，43.95mmol)，整个反应体系在100℃ 下搅拌过夜，反应毕，降至室温。将15mL乙醚加至反应体系中，同时将产生的固体过 滤收集，干燥得3.3g白色固体2-氰基-3-乙氧丁基-2-烯胺，熔点：95～97℃，产率54％， (ES，m/z)：155.2[M+H]⁺¹。

将2-氰基-3-乙氧丁基-2-烯胺(1.0g，6.49mmol)用15mL甲醇溶解在50mL圆 底烧瓶中，同时加入苯肼(840mg，7.77mmol)。整个反应体系在80℃下搅拌过夜，反 应毕。将反应液真空浓缩，所得粗产品用硅胶柱色谱分离提纯，洗脱剂为乙酸乙酯/石 油醚(1∶1)，得1.0g黄色固体5-氨基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-咪唑羧基酰胺，熔 点：92～94℃，产率71％，(ES，m/z)：217.2[M+H]⁺¹。

将5-氨基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-咪唑羧基酰胺(546mg，2.53mmol)用40mL 四氢呋喃溶解在100mL圆底烧瓶中，同时加入1-(嘧啶基-4)哌啶-4-酰氯(1500mg，6.70 mmol)和叔丁醇钾(848mg，7.57mmol)。整个反应体系在室温下搅拌2h，反应毕。将反 应液真空浓缩，所得粗产品用硅胶柱色谱分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(20∶1)， 得0.46g棕色固体N-(4-氨甲酰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-yl)-1-(嘧啶-4)哌啶-4- 咪唑羧基酰胺，熔点：115～117℃，产率47％，(ES，m/z)：405.2[M+H]⁺¹。¹H NMR(300MHz， CD₃OD)δ：1.30(s，2H)，1.64～1.68(m，2H)，1.93～1.97(m，2H)，2.46(s，3H)，2.89 (brs，1H)，4.15(d，2H)，7.10～7.12(m，2H)，7.45～7.52(m，5H)，8.10～8.13(m， 2H)。见图1。

实施例2：采用1-吡啶-4-哌啶-4-甲酰氯为试剂，按照合成路线I，即可制得化 合物(2)

Mp(熔点)：101～103℃；(ES，m/z)：421.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.30(s，2H)， 1.64～1.68(m，2H)，1.93～1.97(m，2H)，2.46(s，3H)，2.89(brs，1H)，4.02(s，3H)，4.15(d，2H)， 7.10～7.12(m，2H)，7.45～7.52(m，5H)，8.10～8.13(m，2H)。见图2。

实施例3：采用1-(吖丁啶-3)-哌啶-4-甲酰氯为试剂，按照合成路线I，即可制 得化合物(3)的合成

Mp(熔点)：121～123℃；(ES，m/z)：383.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ： 1.88～2.05(4H，m)，2.48(3H，s)，2.63～2.69(1H，m)，2.80(2H，t)，3.20～3.30(2H， m)，4.06～4.12(1H，m)，4.26～4.45(4H，m)，7.42～7.56(5H，m)。见图3。

实施例4：采用3-甲磺酰胺基苯甲酰氯为试剂，按照合成路线I，即可制得化合物 (4)的合成

Mp(熔点)：126～128℃；(ES，m/z)：414.2[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：2.51(s，3H)， 3.00(s，3H)，7.43-7.51(m，7H)，7.56(brs，1H)，7.71(s，1H)。见图4。

实施例5：化合物(5)的合成

采用合成路线II的方式：

将乙酰乙酸乙酯(24g，184.42mmol)和苯肼(20g，184.95mmol)置于1000mL圆 底烧瓶中，整个反应体系在100℃下搅拌过夜，反应毕。冷至室温，过滤，用乙醚反复 洗涤固体，得30g浅黄色3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮，熔点：99～101℃，产率 92％，(ES，m/z)：175.2[M+H]⁺¹。

将3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5(4H)-酮(1g，5.74mmol)用10mL 1，4-二氧六环溶 解在50mL的圆底烧瓶中，同时加入氢氧化钙(640mg，8.64mmol)。在50℃下搅拌1h， 然后滴加氯甲酸乙酯(685mg，6.31mmol)，整个反应体系在回流条件下搅拌1h，然后 冷至室温加入30mL的3M盐酸，继续搅拌20min，反应毕。用二氯甲烷(3×30mL) 萃取，合并有机相。同时用30mL的0.06M盐酸洗涤有机相，无水硫酸镁干燥，浓缩。 将所得粗产品用甲醇重结晶，得0.6g黄褐色5-羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸 乙酯，熔点：92～94℃，产率，42％，(ES，m/z)：247.2[M+H]⁺¹。

将5-羟基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(500mg，2.03mmol)和三溴氧磷 (873mg，3.05mmol)置于50mL圆底烧瓶中，整个反应体系在120℃下搅拌过夜，冷至 室温，反应毕。加入20mL乙酸乙酯稀释，再加入15mL水，真空浓缩反应液，所得粗 产品用硅胶柱色谱分离提纯，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(1∶1)，得430mg黄色固体5- 溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸，熔点：124～126℃，产率，75％，(ES，m/z)： 280.2[M+H]⁺¹。

将5-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸(2.2g，7.83mmol)用10mL二氯甲烷溶 解在100mL圆底烧瓶中，再加入草酰氯(1.5g，11.82mmol)后室温下搅拌15min后， 将反应液真空浓缩，所得粗产品用10mL二氯甲烷溶解，在0℃下，再滴加(200mg，2.94 mmol)的25％的氨水，室温下搅拌30min，反应毕。加入25mL二氯甲烷稀释，用饱和 食盐水洗涤，合并有机相，干燥，浓缩，所得粗产品用硅胶柱色谱分离提纯，洗脱剂为 石油醚/乙酸乙酯(1∶1)，得白色固体5-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺，熔点： 127～129℃，产率，50％，(ES，m/z)：280.2[M+H]⁺¹。

将5-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺(0.976g，3.5mmol)用15mLN，N- 二甲基甲酰胺溶解在50mL圆底烧瓶中，再加入碳酸钾固体(0.967g，7.0mmol)和1-(吡 啶-3-)哌啶(0.599g，3.7mmol)。整个反应体系在75℃下搅拌3h后，反应毕。加入 35mL氯仿稀释，萃取，合并有机相，干燥，浓缩，所得粗产品用硅胶柱色谱分离提纯， 洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(15∶1)，得白色0.886g白色固体3-甲氧基-1-苯基-5-(4-吡啶 基-3-)哌嗪基-1-)-1H-吡唑-4-甲酰胺，熔点：139～141℃，产率，67％，(ES，m/z)： 379.2[M+H]⁺¹。¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：3.40～3.42(m，6H)，4.05(s，3H)，7.40～7.50 (m，1H)，7.51～7.65(m，4H)，7.71～7.82(m，1H)，8.02～8.05(m，1H)，8.08～8.10(m， 1H)，8.33(s，1H)。见图5。

实施例6：采用1-哌啶-4-哌啶为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物(6)

Mp(熔点)：120～122℃；(ES，m/z)：385.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.74～1.88 (m，2H)，2.28(d，2H)，2.95～3.04(m，4H)，3.21～3.66(m，9H)，3.90(s，3H)， 7.39～7.42(m，2H)，7.50～7.52(m，3H)。见图6。

实施例7：采用1-吡啶-4-哌啶为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物(7)

Mp(熔点)：124～126℃；(ES，m/z)：379.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.72～1.74(m， 4H)，2.10-2.20(m，4H)，2.50(s，3H)，5.49(d，2H)，6.04～6.08(m，5H)，6.53(d， 2H)。见图7。

实施例8：采用1-吡咯-3-哌嗪为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物(8)

Mp(熔点)：115～117℃；(ES，m/z)：371.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.99～2.07 (m，1H)，2.09-2.33(m，1H)，3.16～3.29(m，3H)，3.38～3.59(m，7H)，3.88～3.91(m， 2H)，4.01(s，3H)，7.40～7.43(m，2H)，7.49～7.51(m，3H)。见图8。

实施例9：采用1-吡咯-3-哌嗪为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物(9)

Mp(熔点)：113～115℃；(ES，m/z)：371.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：2.07～2.15 (m，1H)，2.50～2.53(m，1H)，3.18～3.45(m，10H)，3.49～3.57(m，1H)，3.74～3.82 (m，1H)，3.91(s，3H)，3.97～4.02(m，1H)，7.40～7.43(m，2H)，7.50～7.53(m，3H). 见图9。

实施例10：采用1-哌啶-4-哌嗪为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物(10)

Mp(熔点)：107～109℃；(ES，m/z)：385.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.74～1.88 (m，2H)，2.28(d，2H)，2.95～3.04(m，4H)，3.21～3.66(m，9H)，3.90(s，3H)， 7.39～7.42(m，2H)，7.50～7.52(m，3H)。见图10。

实施例11：采用1-(吖丁啶)-3-哌嗪为试剂，按照合成路线II，即可制得化合物 (11)

Mp(熔点)：115～117℃；(ES，m/z)：357.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：2.85～3.00 (m，4H)，3.20～3.35(m，4H)，3.90(s，3H)，4.10～4.25(m，2H)，4.28(d，3H)， 7.38～7.41(m，2H)，7.49～7.51(m，3H)。见图11。

实施例12：采用1-(吡咯-2-甲基)哌嗪为试剂，按照合成路线II，即可制得化合 物(12)

Mp(熔点)：110～112℃；(ES，m/z)：385.2[M+H]⁺¹；¹H NMR(300MHz，DMSO)δ：1.68～1.76 (m，1H)，1.94～2.05(m，3H)，2.26～2.30(m，1H)，3.17～3.23(m，4H)，3.30～3.35(m， 5H)，3.40～3.55(m，2H)，3.92(s，3H)，3.95～3.98(m，1H)，7.41～7.44(m，2H)， 7.51～7.54(m，3H)。见图12。

实施例13：化合物药理实验

待测化合物对MCF-7(人乳腺癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)和BeL7402(人肝癌细 胞)肿瘤细胞作为研究对象，采用四甲基偶氮唑盐比色法，即MTT法。活性用半数抑制 浓度(IC₅₀)表示，单位为μM。

以MCF-7细胞为例：

取0.25％胰蛋白酶消化单层培养的MCF-7细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培 养液配成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL(含3×10⁴～5×10⁴个细胞)。将 培养板放入CO2孵箱，在37℃、5％CO₂条件下，待培养细胞贴壁后加入不同浓度的待测 化合物，每个化合物测试4个浓度(1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol/L)，对照组 加入与给药组等体积的溶剂。继续在CO₂孵箱中于37℃、5％CO₂条件下培养72h。每孔 加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，于37℃继续孵育4h，中止培养，弃去孔内培养上 清液，每孔加入150μL DMSO，轻度振荡10min，选择570nm波长，在酶标仪上测定 各孔光吸收值(OD值)，用下面公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并计算IC₅₀。重 复测试3次，取平均值为最终结果。

  化合物   MCF-7(IC₅₀μM)  HeLa(IC₅₀μM)   BEL-7402(IC₅₀μM)   (1)   10.62   24.62   15.44   (2)   6.57   9.52   ＞100   (3)   17.09   ＞100   9.04   (4)   ＞100   15.07   30.22   (5)   5.66   13.79   11.35   (6)   24.82   18.73   ＞100   (7)   3.25   8.74   10.47   (8)   ＞100   35.62   18.09   (9)   14.31   17.92   15.49   (10)   28.76   ＞100   8.73   (11)   31.38   25.46   16.84   (12)   12.16   18.63   ＞100

通过上述数据可知，化合物2对MCF-7和HeLa肿瘤细胞具有明显的抑制活性，而对 BEL-7402肿瘤细胞几乎不敏感；化合物5和7对三种肿瘤细胞均显示了很好的抑制活性， 有进一步研究的价值；其余化合物对三种肿瘤细胞也显示了不同的抑制活性。初步构效 关系分析表明吡唑环上的R₃为供电子基，-NR₁R₂为吡啶联哌啶或哌嗪结构是有利于提高 化合物的抗肿瘤活性的。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。