用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦穗部和籽粒靶标基因沉默方法

摘要

本发明涉及一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦穗部和籽粒靶标基因沉默的方法，主要通过用携带靶标基因片段的重组BSMV的α、β、γcDNA体外转录物等量混合后接种抽穗期～扬花期小麦穗，实现穗部和种子靶标基因表达的沉默。相对于现有的基于转基因的小麦穗部和种子RNAi技术方法，其具有简单、快速、准确、可重复性好的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦穗部和籽粒靶标基因沉默 的方法，利用该方法能够研究小麦穗和发育种子中表达基因的生物学功能。

背景技术

分子克隆和新一代DNA测序技术的飞速发展，极大促进了禾谷类作物大量基因及转录本 的分离和分子操作(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna/)。此外，主要农作物包 括水稻、玉米基因组测序已经完成，小麦基因组测序正在进行之中。结构基因组学的快速发 展使得用于基因功能分析，特别是农艺性状相关基因功能分析的有效方法成为基因功能研究 的瓶颈。在模式植物拟南芥和水稻中，建立的基因功能研究技术，如利用T-DNA插入方法构 建基因敲除突变体库(Kaiser et al.，2002)和利用T-DNA激活标签方法构建基因激活突变 体库(Weigel et al.，2000)，已经极大促进了其基因功能的研究。然而，这些方法都不适用 于小麦，因为小麦的遗传转化率很低；加之，基因组很大，构建突变体库需要转化子的数目 非常庞大。对于重要粮食作物小麦，目前尚缺乏用于功能基因研究的有效方法。

近年来，建立和发展的病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)方法 可以通过在一些植物中快速创建基因沉默或抑制的表型，已逐渐成为基因功能鉴定的有效工 具。迄今，适用于单子叶作物小麦VIGS的病毒载体仅有唯一的大麦条斑花叶病毒(the Barley  stripe mosaic virus，BSMV)载体，它由α、β、γ3条RNA正链组成；经过改造的重组BSMV 载体已逐渐被广泛用于小麦苗期基因沉默及基因功能鉴定(Scofield et al.，2005；Tai and  Bragg，2007)。迄今，尚没有关于小麦穗部和籽粒基因沉默BSMV-VIGS方法技术的报道。 小麦穗部和籽粒表达基因与产量、品质和抗病性等重要农艺性状密切相关；揭示穗部和籽粒 表达基因的功能将极大促进禾谷类作物产量和品质性状的改良。因此，建立小麦穗部和籽粒 基因功能分析的工具非常必要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦穗部和籽粒 靶标基因沉默(BSMV-VIGS)的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案予以实现：

一种用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦穗部和籽粒靶标基因沉默方法，其特征在于， 将携带靶标基因片段的重组BSMV的α、β、γ_PDS cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦， 接种时期在抽穗期～扬花期，接种部位为小麦穗，接种方法为用拇指和食指上下摩擦穗部5 次，即可实现小麦穗部和籽粒靶标基因的有效沉默。

经发明人验证，采用本发明的方法能够用于小麦穗部和籽粒靶标基因沉默的应用，按下 列步骤进行：

(a)构建携带靶标基因片段的重组BSMV的γcDNA；

(b)按照权利要求1所述的接种时期、接种部位和接种方法，用重组BSMV的α、β、γ cDNA的体外转录物等量混合接种小麦穗，即可实现小麦穗或种子靶标基因沉默。

采用本发明的方法，在小麦穗部和籽粒发育时期就可以实现发育穗部和籽粒靶标基因的 瞬时沉默，快速创制靶标基因沉默或抑制的表型，以分析靶标基因的生物学功能。

附图说明

图1：显示用于本发明的大麦条斑花叶病毒(BSMV)的α、β、γRNA(a)及用于小麦 穗部和籽粒种子PDS或1Bx14基因沉默的重组BSMV插入片段的组织结构(b)示意图。 图中矩形框表示开放阅读框，框中的符号表示基因名称；MCS表示多克隆位点；Ins1和Ins2 分别表示插入片段。

图2：显示在抽穗期和扬花期向小麦穗部接种携带PDS片段的重组BSMV导致小麦穗部(a) 和种子(b)内源PDS基因沉默的表型。图中显示的均为接种22天后的小麦穗或种子；BSMV： 00表示用未携带插入片段的空病毒BSMV接种(对照)；BSMV：PDS表示用携带185bp的PDS 基因片段的重组病毒BSMV接种(内源PDS沉默表型)。

图3：显示在小偃6号和陕优225小麦品种的扬花期向穗部接种携带1Bx14片段的重组 BSMV导致发育种子的HMW-GS基因1Bx14沉默的蛋白质SDS-PAGE图谱。图中BSMV：00表示用 未携带插入片段的空病毒BSMV接种后所得种子(对照)；BSMV：1Bx14表示用携带176bp的 1Bx14片段的重组病毒BSMV接种后所得种子(HMW-GS 1Bx14基因表达抑制)。左侧的1Ax1， 1Dx2，1Bx14，1By15和1Dy12分别为各HMW-GS的名称。箭头指示接种重组病毒的种子中因 1Bx14基因沉默导致HMW-GS 1Bx14的量比对照(左侧泳道相应条带)极显著减少。

下面结合说明书附图和实施例对本发明方法进行详细的说明。

具体实施方式

实施例1：

申请人采用携带185bpPDS片段的重组病毒BSMV(Scofield et al.，2005)对本发明的方法 进行验证，具体方法是：

首先，用本领域共知的体外转录方法转录BSMV的α、β、γ_PDS cDNA获得其转录子α、β、 γ_PDS RNA；

其次，取三种转录子α、β、γ_PDS RNA各300ng，分别与25μl的FES Buffer(含1％甘氨 酸、0.75％K₂HPO₄、1％硅藻土、1％澎润土、1％的Na₃PO_4.10H₂O)于拇指和食指尖间混合均匀；

然后，在处于抽穗～扬花期小麦穗部上下轻轻摩擦5次。

13天后即可观察到穗部和种子的种皮漂白的表型，即内源PDS基因沉默的表型，PDS基 因沉默的表型可持续至接种后35天。

可以预见，按照本发明所述的小麦穗部和籽粒BSMV-VIGS方法，可以实现小麦穗部和发 育籽粒的任何已知序列靶标基因表达的沉默。

附图1显示了重组BSMV的α、β、γRNA(a)和用于小麦穗部和种子PDS基因l1Bx14 基因沉默的重组BSMV的γ_PDS或γ_1Bx14中插入片段(b)的组织结构示意图。其中，图1的a为 BSMV的α、β、γRNA组织结构示意图；b的上部是用于小麦穗部和种子PDS基因沉默的 重组BSMV的γ_PDS中的插入片段组织结构示意图。图2显示了在抽穗期和扬花期的小麦穗部 接种携带PDS片段的重组BSMVα、β、γ_PDS RNA产生的小麦穗部和种子内源PDS基因沉默的 表型。

实施例2：

申请人构建了携带176bp的小麦种子高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)编码基因1Bx14 片段的重组γ_1Bx14 cDNA。构建方法如下：

根据本领域公知的小麦HMW-GS编码基因1Bx14序列(GenBank accession：AY367771.1) 及其与其它HMW-GS编码基因的同源性，申请人设计了上游引物和下游引物，其中：

上游引物：5′-CGAAGGCGTAGTCTCGCTGGGG-3′；

下游引物5′-GCGAGCTCCGGAAGCGCG-3′；

用申请人研究小组已克隆和构建的含1Bx14基因的质粒载体pHMW1Bx14(Liu et  al.2011)为模板，通过本领域公知的PCR扩增方法，得到1Bx14基因特异的176bp片段(位 于1Bx14基因编码区的第98至273bp)。其序列如下：

5′-GCGAGCTCCGGAAGCGCGAGCTCGAGGCATACCAACAGGTGGTGGACCAGCAACTCCGAGACGTTAGCCCCGGG TACCGCCCCATCACCGTCAGCCCGGGCACGAGACAATACGAGCAGCAACCTGTGGTGCCGCCCAAGGCCGGATCCTTCTA CCCCAGCGAGACTACGCCTTCG-3′。

将该176bp片段连接到线性化的BSMV的γcDNA质粒pγ(Scofield etal.，2005)，即得 到γ_1Bx14 cDNA，图1b的下部是本发明构建的γ_1Bx14中的插入片段组织结构示意图。

通过本领域共知的方法体外转录BSMV的α、β、γ_1Bx14 cDNA获得3种转录子α、β、γ _1Bx14 RNA，取三种转录子α、β、γ_1Bx14 RNA各300ng，分别与25μl的FES Buffer(含1％甘氨 酸、0.75％K₂HPO₄、1％硅藻土、1％澎润土、1％的Na₃PO₄ 10H₂O)于拇指和食指尖间混合均匀；然 后，在处于扬花期小麦穗部上下轻轻摩擦5次；接种22天后，用本领域共知的小麦种子蛋白 质SDS-PAGE方法在蛋白质水平上检测目标基因的表达抑制。

本实施例实现了小麦发育种子中胚乳高分子量蛋白亚基(HMW-GS)编码基因1Bx14的沉 默，并分析了HMW-GS 1BX14在麦谷蛋白大聚合体形成中的作用。

图3显示了在扬花期小偃6号和陕优225小麦品种的穗部接种携带176bp的1Bx14片段 的重组BSMVα、β、γ_1Bx14 RNA，产生的种子HMW-GS基因1Bx14沉默的SDS-PAGE图谱。

综上所述，本发明与现有的用于小麦幼苗的BSMV-VIGS技术和通过小麦转基因的RNA干 扰(RNAi)技术相比，经验证表明，具有的特点和效果如下：

1、与现有用于小麦幼苗的BSMV-VIGS技术相比，本发明在小麦的抽穗期～扬花期向穗部 摩擦接种本领域公知的携带185bpPDS片段的重组病毒BSMV(Scofield et al.，2005)(在穗部 上下滑动5次)，接种后13天在穗部和籽粒出现穗部和种子种皮漂白的表型，即为内源PDS 基因沉默的表型；PDS基因沉默表型可持续至接种后35天。

2、与通过小麦转基因的RNA干扰(RNAi)技术相比，本发明无需进行小麦的遗传转化(小 麦的遗传转化率非常低)，只需用携带靶标基因片段的重组BSMV病毒的α、β、γcDNA的体 外转录物在抽穗期～扬花期的小麦穗部摩擦接种，就可以实现靶标基因的有效沉默，能快速 创制靶标基因表达被抑制的表型。本发明操作简单，省时省力，大大缩短了获得小麦穗部和 籽粒靶标基因表达被抑制的表型的周期。

3.首次利用PDS作为标记基因，利用重组BSMV的α、β、γ_PDS cDNA的体外转录物在抽 穗期～扬花期的小麦穗部摩擦接种，实现了小麦穗部和籽粒内源PDS基因的有效沉默。

4.首次构建了携带176bp的小麦种子高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)编码基因1Bx14 片段的重组BSMV；利用本发明建立的上述小麦穗部和籽粒表达基因快速有效沉默的 BSMV-VIGS方法，实现了发育小麦种子胚乳HMW-GS基因1Bx14的沉默。

因此，本发明的小麦穗部和籽粒表达基因快速有效沉默的BSMV-VIGS方法，可以用于快 速有效地鉴定小麦穗部和籽粒发育相关基因(涉及产量和品质性状)的功能。

GCGAGCTCCGGAAGCGCGAGCTCGAGGCATACCAACAGGTGGTGGACCAGCAACTCCGAGACGTTAGCCCCGGGTACCGCCCCATCACCGTCAGCCCGGGCACGAGACAATACGAGCAGCAACCTGTGGTGCCGCCCAAGGCCGGATCCTTCTACCCCAGCGAGACTACGCCTTCG