检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒

摘要

本发明涉及一种生物领域的检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及其检测方法和试剂盒，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中探针为SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列，检测方法中包括多重PCR扩增，其中特异性引物为SEQ ID NO.59-70所示的核苷酸序列。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成，成本低，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因芯片，更具体的，本发明涉及一种检测6-丙酮 酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒。

背景技术

遗传性代谢病(inborn errors of metabolim，IEM)是因维持机体正常代谢所必 需的由多肽和/或蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传性缺陷及编码这 类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的一组疾病。大多为单基因病，属常染色体隐性 遗传，总的发病率约0.5％～1％。随着人们对此类疾病认识的加深及实验分析技术的发展， 该病的诊断率明显上升，目前已达四五千种。此类疾病种类繁多，涉及到糖类、氨基酸、 脂类等的代谢紊乱，临床症状多种多样，目前临床诊断主要依靠于生化检查及氨基酸、 有机酸分析等，只有少数医院和研究机构可以对其中的某些疾病进行基因诊断。而患者 出现临床改变时往往已经严重影响了其生存质量，所以常规的检查方法无法对遗传代谢 病进行早期诊断和产前诊断。

高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是最常见的常染色体隐性遗传的 氨基酸代谢紊乱疾病，主要由四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin deficiency，BH4) 缺乏所致。四氢生物蝶呤缺乏症是由于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸羟化 酶的辅助因子BH4合成或代谢障碍所致，不但影响苯丙氨酸羟化酶的活性，引起苯丙氨 酸代谢障碍而在体内蓄积，同时影响脑内单胺神经递质，如多巴胺、5-羟色胺的合成， 患儿出现严重的精神系统损害症状和体征，如运动障碍、肌张力异常、顽固性抽痉、肢 体震颤、智能障碍等。如果仅给予低/无苯丙氨酸饮食治疗，血苯丙氨酸浓度虽然能降 至正常，但神经系统症状日趋严重，预后极差。所以将四氢生物蝶呤缺乏症与经典型PKU 进行区分具有重要的临床意义。

BH4是由三磷酸鸟苷在三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH)、6-丙酮酰四氢生物蝶呤合 成酶(PTPS)和墨蝶呤还原酶(SR)的作用下合成，参与芳香族氨基酸羟化酶的催化反 应后，BH4被氧化为蝶呤-4a-二甲醇胺，再由蝶呤-4a-二甲醇胺脱水酶(PCD)和二氢蝶 呤还原酶(DHPR)还原为具有活性的BH4。上述任一种酶的缺乏均可导致BH4缺乏症，而 6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏是BH4缺乏中最常见的类型。编码6-丙酮酰 四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)的基因是PTS基因，定位于11q22.3-23.3，mRNA长921bp， 包含6个外显子，具有功能的PTPS是由两个三聚体构成的环状结构，有6个活性中心，其 催化BH4的合成需要镁离子和锌离子的共同作用。目前已报道44种PTS基因突变类型，包 括40种错义/无义突变，5种剪切突变，7种插入/缺失。目前对HPA进行分型的方法一般 是BH4负荷试验、尿蝶呤谱分析、DHPR活性测定等。随着编码6-丙酮酰四氢生物蝶呤合 成酶和二氢蝶呤还原酶基因分别于1992年和1987年克隆定位，使用6-丙酮酰四氢生物蝶 呤合成酶基因诊断HPA的报道也越来越多。然而，现在尚无一种快速、低成本、大通量 和自动化检测PTS基因突变的方法。因此，需要一种新的技术方案来克服现有技术的上 述缺陷和不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成 酶缺乏症的基因芯片及使用方法、试剂盒。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异 性高，稳定性好，时间短，成本低，适用于临床患者基因突变检测和正常人杂合子携带 者检测。

本发明的目的通过以下技术方案实现，

第一方面，本发明涉及一种检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的基因芯片， 包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID NO.1-54所 示的核苷酸序列。

优选地，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯中 的一种。

第二方面，本发明还涉及应用前述基因芯片检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏 症的方法，包括多重PCR扩增，所述的多重PCR扩增特异性引物为：

SEQ ID NO.59-60所示的核苷酸，

SEQ ID NO.61-62所示的核苷酸，

SEQ ID NO.63-64所示的核苷酸，

SEQ ID NO.65-66所示的核苷酸，

SEQ ID NO.67-68所示的核苷酸，

SEQ ID NO.69-70所示的核苷酸。

第三方面，本发明还涉及一种用于检测6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的试剂 盒，所述试剂盒包括前述基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上 的寡核苷酸探针，所述探针为SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列。

本发明具有如下的有益效果：本发明的基因芯片操作步骤简单，只需要进行一次多 重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区 分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结 果可在一天内完成；采用通用芯片技术，固相载体也可通用于其他芯片，有效降低了成 本，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring Harbor  Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、基因芯片及其制造方法

本实施例的基因芯片，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷 酸探针，所述探针为SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列，其中固相载体为载玻片。

所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)将玻片用双蒸水洗净，在碱液中浸泡过夜，取出后用双蒸水清晰3遍，再于体 积分数为1％的HCl中浸泡30分钟，清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过4-氨 丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化处理，再经苯异硫氰酸酯溶液进行异硫氰基化处理，用氮 气吹干后，放于4℃避光保存；

(2)芯片Zip探针(SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列)是随机组合的长度为24bp 的寡核苷酸片段，将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列 进行同源性比较，选择其中同源性程度最低的一组作为Zip探针序列。位点特异性探针 长度不等，需保证其Tm值基本保持一致，以确保后续反应的均一性；

(3)将合成好的Zip探针溶解于点样液中，将探针溶液转移到对应的96孔板内，使 用GMS417点样仪，运行相应程序将探针点到活化好的固相载体上，置于37℃，90％湿度 的恒温恒湿箱中过夜，使探针与玻片充分交联。固定好的固相载体在氨水中封闭反应的 活性基团，可以储存于4℃以备下步杂交实验用。

2、基因芯片的使用方法

使用前述的基因芯片进行6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的检测，包括如下步 骤：

(1)突变检测位点的选择，需要进行检测的18个突变位点及探针核心序列如表1。

表1

突变形式中的“del”表示缺失突变，如248-250del表示SEQ ID NO.55所示的核苷 酸序列中第248至250位3个碱基缺失；“＞”表示置换突变，如234A＞6表示SEQ ID NO.49 所示的核苷酸序列中第234位碱基由A突变为G。

即，SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第234个 碱基是否发生突变，由A→G；

SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第245个碱基 是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第288个碱基 是否发生突变，由T→A；

SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第318个碱 基是否发生突变，由T→C；

SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第338个碱 基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第339个碱 基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第351个碱 基是否发生突变，由A→G；

SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第356个碱 基是否发生突变，由C→A；

SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第365个碱 基是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第396个碱 基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第458个碱 基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第472个碱 基是否发生突变，由A→C；

SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第509个碱 基是否发生突变，由G→C；

SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第116个碱 基是否发生突变，由C→T；

SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第248至250 个碱基是否发生突变，第248至250这三个碱基缺失。

SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列第1769个 碱基是否发生突变，由A→G；

SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列第1个碱基 是否发生突变，由G→A；

SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列第2477个 碱基是否发生突变，由A→G。

(2)样品准备

获取血液样本，准备全血样品，用苯酚-氯仿法(参照《分子克隆实验指南》第三版) 抽提全血中的基因组DNA。

(3)样品血液的预处理

分别以各样本的基因组DNA为模板，进行多重PCR。上述18个突变位点分布于6个外 显子和3个内含子上，其中内含子3和内含子4上的两个位点因为离外显子较近，可以同 外显子一起扩增得到，因此设计6对引物进行扩增。因为外显子1所扩增片段GC含量很高 (＞75％)，其扩增体系中需添加DMSO，因此要单独扩增，引物不变；其余5个片段在一个 反应管内进行扩增。

外显子1反应成分(25μl体系)：20ng基因组DNA，10mM Tris-HCl，50mM KCl， 3.0mM MgCl₂，200μM dNTP，0.6μM引物，2.5U Taq DNA聚合酶，0.125μlDMSO；

五重PCR反应成分(25μl体系)：20ng基因组DNA，10mM Tris-HCl，50mM KCl，3.0mM  MgCl₂，200μM dNTP，0.6μM各引物，2.5U Taq DNA聚合酶。外显子1的扩增反应条件为： 94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，每次循环下降0.5℃，72℃延伸1min， 循环10次，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min； 五重PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火30s，每次循环下降0.5℃，72℃延伸1min， 循环10次，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环25次。反应完成后在反应 混合液中加入1μl蛋白酶K，70℃反应10min，随后94℃20min灭活蛋白酶K；多重PCR反 应的引物如表2所示。

表2

即，SEQ ID NO.59-60所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所 示核苷酸序列第116个碱基的DNA片段；

SEQ ID NO.61-62所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核 苷酸序列第234个碱基的DNA片段；

SEQ ID NO.63-64所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核 苷酸序列第245个碱基、第248至250个碱基和含有SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列第1个 碱基的DNA片段；

SEQ ID NO.65-66所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核 苷酸序列第288个碱基和第318个碱基的DNA片段；

SEQ ID NO.67-68所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核 苷酸序列第338个碱基、第339个碱基、第351个碱基、第356个碱基、第365个碱基、第 396个碱基、第458个碱基、第472个碱基、第509个碱基和含有SEQ ID NO.58所示的核苷 酸序列第2479个碱基的DNA片段；

SEQ ID NO.69-70所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.56所示的 核苷酸序列第1777个碱基的DNA片段。

(4)将前述步骤获得DNA片段与探针进行连接

蛋白酶K消化后的扩增产物，立刻进行LDR反应。在反应液中依次加入10×Taq ligase  buffer 2μl，探针混合液1μl，各探针浓度均为1μM，Taq DNA ligase 0.25μl，补 水至总体积20μl；反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

(5)杂交

向20μl LDR反应液中加入15μl双蒸水和35μl 2×杂交液，混匀后于95℃加热变 性5min，迅速放于冰上冷却，离心待用。将杂交框粘贴于基因芯片上的点样区域，吸取 65μl杂交液添加到杂交框中，封闭好置于65℃杂交箱中杂交1小时。

杂交结束后，去掉杂交框，将芯片分别放于0.3×SSC/0.1％SDS和0.06×SSC中各洗 脱1min，离心甩干。

上述溶液配置方法如下所述：预配置20×SSC溶液：在800ml水中溶解175.3g NaCl 和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装 后高压灭菌。

0.3×SSC：将20×SSC与水按1∶66.7体积比稀释。

0.06×SSC：将20×SSC与水按1∶333.3体积比稀释。

0.1％SDS：1克SDS溶解在1000ml水中。

(6)扫描与分析

杂交后的基因芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，得到的图像用软件进行分 析。最终获得各个样本点的荧光信号强度值和背景值，扣除背景值影响后得到该点的 AMSI值(absolute median signal intensities)。根据同一位点野生型和突变型探针 点的绝对强度比值，确定基因型。实验结果表明，检测特异性高，稳定性好，经前期试 验该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，样本抽 提到得到扫描结果可在一天内完成。

综上所述，本发明的基因芯片操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接 酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合 子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成； 采用通用芯片技术，固相载体也可通用于其他芯片，有效降低了成本，适用于临床患者 基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。