一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒

摘要

本发明公开了属于酶联免疫检测技术领域的一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒。该试剂盒由固相酶标板、人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体、人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品、生物素化人胰岛素样生长因子Ⅱ、亲和素标记的辣根过氧化物酶和辅助试剂组成。该试剂盒可灵敏检测血清中IGFⅡ水平的差异。

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种人胰岛素样生长因子Ⅱ 酶联免疫分析检测试剂盒。

背景技术

人胰岛素样生长因子Ⅱ(Insulin-Like Growth FactorⅡ，IGFⅡ)是有67个 氨基酸的单链多肽，分子量7Kd，结构与胰岛素相似，大部分经肝脏合成，主要 存在于血液中，通过与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥促进细胞繁殖、分 化、生长、代谢等多种生物效应。近几年来大量研究显示，胰岛素样生长因子 Ⅱ具有促进细胞增殖及恶性转化的作用，是一种细胞增殖调控因子，人类多种 恶性肿瘤肝癌、胃癌、结肠癌等的发生、发展与胰岛素样生长因子Ⅱ基因调 控异常有关。目前国内还没有人胰岛素样生长因子Ⅱ的酶免疫分析相关方法学 检测和试剂盒的研究使用报道。北京北方生物制品研究所有人胰岛素样生长因 子Ⅱ放射免疫分析的试剂盒，但因为标记物为放射性125I，在使用中存在污染 和辐射的缺点；国外有人胰岛素样生长因子Ⅱ的ELISA试剂盒，但价格昂贵。 因此，建立一种方便灵敏特异准确的检测方法，从而能为临床和实验室继续探 讨胰岛素样生长因子Ⅱ在炎症、肿瘤、肿瘤治疗后效果观察及早期诊断方面提 供一个新的思路，提供一种可靠的手段是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试 剂盒，检测血清中人胰岛素样生长因子Ⅱ的水平。

在生理状态下，血清中IGFⅡ含量甚微且由于分子量小较难获得高效价抗 血清，因此发明人用人胰岛素样生长因子Ⅱ多肽连接生物大分子甲状腺球蛋 白，连接后将其用微量多次免疫法免疫大耳白兔获得高效价高亲和力的抗血 清。用该抗血清包被聚苯乙烯酶标板制成固相化抗体板。用胰岛素样生长因子 Ⅱ多肽连接生物素，将生物素化的胰岛素样生长因子Ⅱ与样本中待测胰岛素样 生长因子Ⅱ同时等体积加入固相抗体板中，经过反应洗涤后再加入酶标亲和 素，经过反应洗涤后加入酶底物经过显色判断待测物中胰岛素样生长因子Ⅱ的 含量。

一种人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒由固相酶 标板、人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体、人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品、生物素化 人胰岛素样生长因子Ⅱ、亲和素标记的辣根过氧化物酶和辅助试剂组成。

所述人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体是由人胰岛素样生长因子Ⅱ连接甲状腺 球蛋白后免疫动物获得抗血清，经过饱和硫酸铵分级纯化得到。

其特征在于，所述动物为羊、兔或鼠。

所述人胰岛素样生长因子Ⅱ连接甲状腺球蛋白的方法为戊二醛法。

所述生物素化人胰岛素样生长因子Ⅱ的制备方法如下：将人胰岛素样生长 因子Ⅱ加入到0.1mol/L pH 9.2的碳酸盐缓冲液中，在磁力搅拌下，吸取活化生 物素溶液加入人胰岛素样生长因子Ⅱ溶液中，室温搅拌2h，24h后将其用生理 盐水透析12h，间隔换液4次，将反应物移至离心管高速离心，取上清加入等 体积甘油，-20℃保存。

所述辅助试剂包括：显色液、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液。

本发明的有益效果：用本发明的试剂盒检测150份正常献血员和180份肝 癌介入前和介入后患者血清，发现正常献血员血清IGFⅡ水平明显低于肝癌各 组患者，P＜0.05；肝癌患者进行介入治疗3天后IGFⅡ水平明显低于治疗前， P＜0.05；介入治疗后3天与治疗后一个月水平相比无明显差异。表明该试剂盒 可灵敏检测血清中IGFⅡ水平的差异。

附图说明

图1为IGFⅡ酶联免疫分析标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分 子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社) 或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1人胰岛素样生长因子Ⅱ酶联免疫分析检测试剂盒的制备

1、材料

免疫用大耳白兔3只，雄性，体重1.5公斤，由301医院动物实验中心提 供。人IGFⅡ多肽购于北京博奥森生物科技有限公司，人胰岛素样生长因子Ⅱ 标准品购自sigma公司。

2、人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体的制备和纯化

将IGFⅡ与甲状腺球蛋白(TG)按最优分子比(1∶100)投料，采用戊二醛法 连接，经透析后分装、冷冻干燥备用，制得IGFⅡ-TG。

首次免疫将IGFⅡ-TG 200μg与弗氏完全佐剂4ml充分混匀，分别与3只 兔背部皮内多点注射，每隔4周加强免疫一次(将免疫原100μg与弗氏不完全 佐剂4ml充分混匀后同上法注射)。于第4次免疫后7天经动物颈动脉放血， 分离血清，分装，-80℃保存。

取2mL兔抗IGF-Ⅱ血清，加入4mL生理盐水稀释，置磁力搅拌器上，用饱 和硫酸铵分级纯化，过SephadexG75柱，制得人胰岛素样生长因子Ⅱ抗体。用 紫外分光光度法测其蛋白含量。

3、生物素化人胰岛素样生长因子Ⅱ的制备

IGFⅡ0.25mg加0.1mol/L pH 9.2的碳酸盐缓冲液在磁力搅拌下，吸取1.86 mg活化生物素溶液加入IGFⅡ溶液中，室温搅拌2h后，次日将其用生理盐 水透析12h，间隔换液4次，将反应物至小管高速离心，取上清加入等体积甘 油保护，-20℃保存。

4、亲和素标记的辣根过氧化物酶的制备

称3mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5ml新鲜三蒸水中，加NaIO₄进行 醛化后，用50mmol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液调PH≥9.0，在磁力搅拌下缓慢将 200μL亲和素溶液滴加醛化的HRP溶液中，4℃搅拌反应2h，加入0.4％的NaBH₄100μL于反应液中，4℃反应2h，用10mmol pH 7.8PBS透析过夜。次日，将反 应液离心，取上清加入等体积甘油，分装冻存。

5、辅助试剂

显色液(包括显色剂A和显色剂B)、反应终止液、底物工作液、洗涤液 和缓冲液均购买自天根(北京)生化科技有限公司。

实施例2检测方法

1、固相抗体酶标板的制备

取纯化后的IGFⅡ抗体，用0.05M柠檬酸盐缓冲液配制成10ug/ml，将其 按每孔200μl量加入96孔酶标板中，37℃孵育3h，洗板，加入含3％牛血清白蛋 白的Tris.HCl封闭液中，4℃过夜，甩去封闭液，用冷冻干燥机去掉孔内多余水分， 将其装入锡箔袋中用真空包装机抽真空密封，保存于4℃。

2、试剂和仪器准备

冻干的人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品1瓶：每瓶用实验缓冲液0.5mL溶 解后浓度分别为250、83、27、9、3、1ng/mL；生物素化人胰岛素样生长因子 Ⅱ1瓶；亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液1瓶；显色剂A：1支；显色剂B： 1瓶，显色液：用前A与B以1∶19的比例混合；终止液1瓶；浓缩洗涤液1 瓶(30mL)：用前用重蒸水1∶20倍稀释；缓冲液1瓶；加样器、振荡器、温箱。

3、样品收集、处理及保存方法

血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000 转/分)。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。对收集后当天进行的标本， 储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在 -20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时， -20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。

血浆：应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂， 加入10％(v/v)抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1％heparin或2.0％EDTA.Na₂) 混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上 清。如有沉淀形成，应再次离心。

本实施例选取库存150份正常献血员和患者复查存留的180份肝癌介入前 和介入后患者血清做为实验样品。

4、操作步骤

(1)使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免 加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

(2)根据待测样品数量加上人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品的数量决定所 需的板条数。每个S0孔、人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品和空白孔做复孔。每 个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

(3)加入稀释好后的人胰岛素样生长因子Ⅱ标准品100μl于反应孔、加入 待测样品100μl于反应孔内。除空白孔外立即加入100μl的生物素化人胰岛素 样生长因子Ⅱ。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1.5小时。

(4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水 纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(5)每孔加入200μl的亲和素标记的辣根过氧化物酶，轻轻振荡混匀，37℃ 温育30分钟

(6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水 纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

(7)每孔加入底物工作液200μl，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避 免光照。

(8)取出酶标板，迅速加入50μl终止液，加入终止液后应立即测定结。

(9)在450nm波长处测定各孔的OD值。

加样步骤如下表：

5、结果

(1)标准曲线：以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的IGFⅡ标准品浓 度为横坐标(X)，做标准曲线。包被兔IGFⅡ抗体(10μg/mL)固相板在IGF Ⅱ浓度1.0-250ng/mL范围内形成良好的线性关系(r＝0.990)，见图1。

(2)灵敏度和精密度：按B0-2SD计算，最小检出值＜0.1ng/ml，同批 测定同一血清，其批内变异系数(CV)6.3％(n＝8)；同一血清分批测定，其批 间变异系数(CV)10％(n＝8)。

(3)特异性和准确率：IGFⅡ抗体与IGFⅠ、VEGF、TGF-β1、PDGF等 细胞因子125-1000ng/ml范围内均无交叉反应；向血清中分别加入IGFⅡ标准 5、100ng/ml，回收率分别为97.8％、105.7％。

(4)正常献血员血清和肝癌患者血清中IGFⅡ水平变化同正常组相比， 肝癌各组IGFⅡ水平明显升高；肝癌患者进行介入治疗3天后IGFⅡ水平明显 低于治疗前，介入治疗后3天与治疗后一个月水平相比无明显差异。见表1。

表1正常献血员和肝癌患者血清IGF-Ⅱ水平的变化

^*P＜0.05与正常献血员组血清相比较；^▲P＜0.05与肝癌介入治疗前组血清相比