人类核糖体蛋白L23标签多肽在制备抗癌药物中的应用

摘要

本发明公开了人类核糖体蛋白L23标签多肽在制备抗癌药物中的应用，所述人类核糖体蛋白L23标签多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1定义。人类核糖体蛋白L23标签多肽对人乳腺癌Bcap-37的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。在0.2，0.5和0.8μg/ml浓度下对人乳腺癌Bcap-37生长抑制有较好的效果，其中浓度0.5μg/ml时人类核糖体蛋白L23标签多肽对人乳腺癌Bcap-37细胞的生长抑制率最好，达到72.29％。

说明书

技术领域

本发明涉及人类核糖体蛋白L23标签多肽在制备抗癌药物中的应用，属于生物医 药技术领域。

背景技术

核糖体是催化蛋白质合成的细胞器。哺乳动物的核糖体是由4种RNA和大约80个 不同的蛋白质组成，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，小亚基核 糖体蛋白命名为S1至S31，大亚基核糖体蛋白命名为L1至L44。RPL23a蛋白是60s 核糖体蛋白的组成部分。RPL23A基因编码的核糖体蛋白是60S亚基的一个组成部分。 该蛋白属于核糖体蛋白L23P家系。它存在于细胞质中。近年来，一些研究成果显示， RPL23A基因参与细胞生长和调节的作用。人类核糖体蛋白RPL23A的cDNA和结构基因 已被克隆，测序和分析。该结构基因长度约4.0kb，包含5个外显子和4个内含子，编 码156个氨基酸的蛋白亚基。RPL23A蛋白亚基可能是参与调解生长抑制干扰素的物质 之一(Jiang et al.，1997)。也有研究表明RPL23A基因参与联合基因转录U42A，U42B， U101A和U101B小核仁RNA基因(Rogan et al.，2001)。目前，对很多哺乳动物的RPL23A 基因及其所编码的蛋白进行了研究，发现RPL23A蛋白亚基的氨基酸序列高度保守，而 且都存在一个16个氨基酸的功能位点，被称为核糖体蛋白L23标签(Ribosomal protein  L23 signature)。我们在研究大熊猫RPL23A基因时发现：大熊猫RPL23A基因也编码156 个氨基酸的蛋白亚基，也存在一个16个氨基酸的核糖体蛋白L23标签，但大熊猫的 RPL23A蛋白亚基存在一个变异位点，即在大熊猫RPL23A蛋白亚基的第5位是脯氨酸 (P)，而其人和其他哺乳动物RPL23A蛋白亚基的第5位是丙氨酸(A)。

为进一步研究大熊猫RPL23A蛋白亚基的功能，我们构建了大熊猫RPL23AcDNA的 表达载体，将其转入大肠杆菌进行表达，并对表达产物进行纯化，获得了大熊猫RPL23A 基因的重组蛋白，该重组蛋白的分子量是21.265KDa；等电点为10.57.在研究过程中 我们意外发现大熊猫RPL23A基因的重组蛋白对人类喉癌(Hep-2)有强烈的抑制作用(已 将该结果申请了中国专利，专利申请号为：201110369377.0)。

迄今为止，人类核糖体蛋白L23标签多肽对人类乳腺癌细胞强烈的生长抑制作用 在国内外尚无任何报道。

发明内容

为探索RPL23A基因重组蛋白的的抗癌机理和机制，同时为研发抗癌蛋白药物累积 系统而扎实的科学基础数据，我们把大熊猫RPL23A基因重组蛋白切割成若干个小的多 肽，逐个筛选多肽对人类不同类型癌细胞生长的效应，发现靠近核糖体蛋白L23标签 的一组多肽对人类不同类型的癌细胞生长具有不同的效应。因为大熊猫和其他哺乳动物 的核糖体蛋白L23标签与人类完全一致，于是我们将人类核糖体蛋白L23标签多肽进行 了人工合成，用此标签多肽分别作用于不同类型的癌细胞和正常细胞，发现此标签多肽 对正常细胞的生长几乎无任何影响，对不同类型的癌细胞生长显示了不同的效应，其中 对人类乳腺癌细胞有非常强的生长抑制作用，其生长抑制率高达72.29％；而对人喉癌细 胞具有促进生长效应。

人类核糖体蛋白L23标签多肽在制备抗癌药物中的应用，所述人类核糖体蛋白L23 标签多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1定义。

本发明的重要意义如下：

1、人类核糖体蛋白L23标签多肽属于小分子多肽，容易制备。

2、首次发现此标签多肽对正常细胞的生长几乎无任何影响，对不同类型的癌细胞 生长显示了不同的效应，其中对人类乳腺癌细胞有非常强的生长抑制作用，其生长抑制 率高达72.29％；而对人喉癌细胞具有促进生长效应。说明人类核糖体蛋白L23标签多肽 对细胞的影响有明显的靶向效应。

3、人类核糖体蛋白L23标签多肽人类乳腺癌细胞有非常强的生长抑制作用这一发 现为抗癌蛋白药物的研发提供了科学依据和方向。也为研究抗癌机理提供了有价值的资 源。

附图说明

图1为人类核糖体蛋白L23标签多肽对人正常肝细胞Chang Liver，人喉癌Hep-2 细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞生长的影响(图中1-8为：0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.5， 3.0，和6.0μg/ml.人类核糖体蛋白L23标签多肽浓度)；

图2为人类核糖体蛋白L23标签多肽对人正常肝细胞Chang Liver，人喉癌Hep-2 细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞形态的影响(图中1-9为：0，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.5， 3.0，和6.0μg/ml.人类核糖体蛋白L23标签多肽浓度；C：Chang liver；B：人乳腺 癌Bcap-37；H：人喉癌Hep-2)

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.1.1细胞株：人正常肝细胞Chang Liver(张氏肝细胞)，人喉癌Hep-2细胞， 人乳腺癌Bcap-37细胞，上述细胞株均为已经商品化的生物材料。

1.1.1.2试剂：RPMI1640粉末(购于Gibco公司，美国)，胎牛血清(购于四季青生 物制品公司，中国)，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司)。

1.1.1.3人类核糖体蛋白L23标签多肽(Ribosomal protein L23signature)，由 上海强耀生物科技有限公司合成。多肽的氨基酸序列为：KKAYVRLAPD YDALDV，分子量 为1.8368KDa，等电点为6.50。

1.1.2方法

1.1.2.1细胞培养

人正常肝细胞Chang Liver，人喉癌Hep-2细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞株分别用 含有10％的灭活的胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)100U/ml青霉素、100μg/ml 链霉素、pH7.4的RPMI-1640完全培养液于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

1.1.2.2MTT法检测细胞活性

取对数生长期的人正常肝细胞Chang Liver，人喉癌Hep-2细胞和人乳腺癌Bcap-37 细胞用胰蛋白酶消化后将细胞数调整到1×10⁵个/mL，接种于96孔板，每孔细胞液量为 200μL，放入CO₂培养箱内，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的条件下孵育至细胞单层铺满孔 底(96孔平底板)，然后加人类核糖体蛋白L23标签多肽使其终浓度分别为0，0.05， 0.1，0.2，0.5，0.8，1.5，3.0，和6.0μg/ml.设6个重复孔，空白组为不含细胞的 RPMI1640培养液，放入CO₂培养箱内培养24、36和48h后取出96孔板，加入MTT(5mg/mL) 溶液10μL，继续培养4h后，然后加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)振荡10min，待蓝 紫色结晶完全溶解后，用酶标仪在在490nm的波长下测定各孔的吸光度(OD)值，计 算不同浓度下人类核糖体蛋白L23标签多肽(本实施例采用直接加入培养生长良好的癌 细胞中观察结果，临床中，蛋白质或者多肽类的生物药物多采用注射剂的剂型，肌注或 者静脉滴注)作用各类型细胞的抑制率(％)。细胞生长抑制率公式为：细胞生长抑制率 ＝(1-A实验组/A对照组)×100％。

在以上实验的基础上选择了人类核糖体蛋白L23标签多肽对生长抑制效果最好的人 乳腺癌Bcap-37细胞株，人喉癌Hep-2细胞和人正常肝细胞Chang Liver进行对比实验， 培养时间为36h，具体方法与步骤同上。

1.1.2.3形态学观察

将96孔板放在倒置显微镜下观察，拍照记录不同浓度下细胞的形态变化。

1.2结果

1.2.1人类核糖体蛋白L23标签多肽对人正常肝细胞Chang Liver，人喉癌Hep-2 细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞生长的影响

本实施例采用MTT法检测，不同浓度人类核糖体蛋白L23标签多肽在36h下对人正 常肝细胞Chang Liver的生长抑制几乎无影响，对人喉癌Hep-2细胞的生长有促进作用， 而对人乳腺癌Bcap-37细胞生长具有强烈的抑制作用。从图1可以看出，人类核糖体蛋 白L23标签多肽对人乳腺癌Bcap-37的生长抑制率具有时间和剂量的依赖性。发现在0.2， 0.5和0.8μg/ml浓度下对人乳腺癌Bcap-37生长抑制有较好的效果，其中浓度0.5μ g/ml时人类核糖体蛋白L23标签多肽对人乳腺癌Bcap-37细胞的生长抑制率最好，达到 72.29％(见图1)。

1.2.2人类核糖体蛋白L23标签多肽对人正常肝细胞Chang Liver、人喉癌Hep-2 细胞、人乳腺癌Bcap-37细胞形态的影响

用倒置显微镜观察不同浓度人类核糖体蛋白L23标签多肽(0.05，0.1， 0.2，0.5，0.8，1.5，3.0，和6.0μg/ml)处理36h的人乳腺癌Bcap-37细胞形态变化(图 2)。从图2可以看到，在36h的处理时间下，与对照组相比，随着人类核糖体蛋白L23 标签多肽浓度的变化，细胞出现变圆，成团，脱落甚至裂解成碎片的现象(参见图2)。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。