肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法及其专用培养基

摘要

本发明是肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法及其专用培养基。其专用培养基中种子萌发培养基是：Read+6-BA0.2～1mg/L+NAA0.02～0.1mg/L；增殖培养基是：Read+6-BA0.5～1.5mg/L+KT0.05～0.1mg/L+NAA0.05～0.1mg/L；生根培养基是：Read+IAA0.5～1.5mg/L；三个培养基中蔗糖为30g/L，琼脂为6.5g/L，Ph为5.8。本发明能使种子萌发率达86～100%；增殖率达390～442%；生根率达81～92%；炼苗成活率达77～85%，对解决肥荚红豆种源缺乏问题，实现其可持续利用及规模化生产具有现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法，属植物组织培养领域。

背景技术

肥荚红豆（Ormosia fordiana Oliv.）为豆科红豆属乔木，在我国主要产广东、海南、广西、云南，国外越南、缅甸、泰国、孟加拉也有分布，其茎皮、根、叶可入药，具有清热解毒，消肿止痛的功效，主治急性肝炎，跌打损伤，肿痛，风火牙痛，烧烫伤，有研究表明肥荚红豆茎、叶提取的活性成分，对人体病原菌金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，能开发为新的抗生素；此外，其纹理通直，宜用于建筑业和制作高档家具，是具有较高经济价值和极大开发潜力的药用植物和用材树种。目前，肥荚红豆无论其栽培技术，还是繁殖技术,研究报道均为空白，其种源供给主要采用种子或扦插的传统繁殖方法，但繁殖速度较慢，繁殖系数低，难以满足生产应用的需求，种源缺乏成为了制约肥荚红豆开发应用的关键因子。因此，研究适宜和高效的肥荚红豆组培繁殖技术可以成为解决其种源缺乏问题的新途径。

发明内容

   本发明要解决的技术问题是克服现有技术采用种子或扦插的传统繁殖方法，

导致繁殖速度较慢，繁殖系数低，种源缺乏的缺陷和不足，其目的是提供一种适宜的和高效的肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法及其专用培养基。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

1、肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的专用培养基，它是由以下配方的种子萌发培养基，增殖培养基和生根培养基组成：

（1）种子萌发培养基的配方是：Read基本培养基+6-BA0.2～1mg/L+NAA0.02～0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8；

（2）增殖培养基的配方是：Read基本培养基+6-BA0.5～1.5mg/L+KT0.05～0.1 mg/L+ NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8； 

（3）生根培养基的配方是：Read基本培养基+ IAA0.5～1.5 mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8。

2、优选的肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的专用培养基，它是由以下配方的种子萌发培养基，增殖培养基和生根培养基组成：

（1）种子萌发培养基的配方是： Read基本培养基 + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8；

（2）增殖培养基的配方是：Read 基本培养基+ 6-BA 1 mg/L + KT 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8；

（3）生根培养基的配方是： Read基本培养基+ IAA 1.0 mg/L+ +蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8。

3、肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：

（1）种子消毒与处理

将肥荚红豆种子用0.12%氯化汞溶液浸泡12～18min，再用2%次氯酸钠溶液浸泡8～12min后，用清水漂洗，之后放入3MNaOH溶液浸泡40～80min，再用清水漂洗后取出，剥去种皮；

（2）种子萌发

将经步骤（1）消毒与处理的种子接种于种子萌发培养基，培养24～30天；所述的种子萌发培养基的配方是上述技术方案1所述的（1）种子萌发培养基的配方；

（3）不定芽增殖

将步骤（2）种子萌发诱导出来的芽从豆瓣上分离，整棵或切成带节的茎段转移到增殖培养基上，培养40天；所述的增殖培养基的配方是上述技术方案1所述的（2）增殖培养基的配方；

（4）生根

将步骤（3）培育的增殖苗分棵切开，接种于生根培养基，培养24～31天；所述的生根培养基的配方是上述技术方案1所述的（3）生根培养基的配方；

（5）炼苗与移栽

待步骤（4）的小苗长出4～6条主根时，将培养瓶移至室外大棚内，于透光率为70%的遮阳网下炼苗，3～7天取出小苗，洗去根部培养基，移栽到穴盘中，穴盘中基质为按腐叶土：红土：珍珠岩=2～3.5：1～2：0.5～1的体积比比例混合而成的混合物，穴盘放置于育苗小棚内，棚顶覆盖一层透光率60%的遮阳网，第8天揭去遮阳网，保持基质的土壤质量含水量为40-50%；

上述步骤（2）～步骤（4）的培养条件：培养温度22～25℃，光照时间12 h/d，光照强度1500～2000lx。

4、优选的肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：

（1）种子消毒与处理

将肥荚红豆种子用0.12%氯化汞溶液浸泡15min，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10min后，用清水漂洗，之后放入3MNaOH溶液浸泡60min，再用清水漂洗后取出，剥去种皮；

（2）种子萌发

将经步骤（1）消毒与处理的种子接种于种子萌发培养基，培养24天；所述的种子萌发培养基的配方是上述技术方案2所述的（1）种子萌发培养基的配方；

（3）不定芽增殖

将步骤（2）种子萌发诱导出来的芽从豆瓣上分离，整棵或切成带节的茎段转移到增殖培养基上，培养40天；所述的增殖培养基的配方是上述技术方案2所述的（2）增殖培养基的配方；

（4）生根

将步骤（3）培育的增殖苗分棵切开，茎基部切平，接种于生根培养基，培养24天；所述的生根培养基的配方是上述技术方案2所述的（3）生根培养基的配方；

（5）炼苗与移栽

待步骤（4）的小苗长出4～6条主根时，将培养瓶移至室外大棚内，于透光率为70%的遮阳网下炼苗，于7天取出小苗，洗去根部培养基，移栽到穴盘中，穴盘中基质为按腐叶土：红土：珍珠岩=3.5：1：0.5的体积比比例混合而成的混合物，穴盘放置于育苗小棚内，棚顶覆盖一层透光率为60%的遮阳网，第8天揭去遮阳网，保持基质的土壤质量含水量为40～50%；

步骤（2）～步骤（4）的培养条件：培养温度是22-25℃，光照时间是12 h/d，光照强度是1500-2000lx。

本发明的有益效果：

本发明的肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法和专用培养基，能有效地克服外植体种皮坚硬导致种皮不易剥落不易于诱导萌发的问题，使萌发率达86～100%；还使在整个诱导植株再生过程中其增殖，生根率高，增殖率达390～442%；生根率达81～92%；炼苗成活率达77～85%，小苗生长健壮，植株基部有丛芽增殖，茎杆节处有侧芽发出，质量好，是一种特别适宜肥荚红豆种子快速繁殖和高效优质的肥荚红豆种子快速繁殖的方法，解决了肥荚红豆种源缺乏问题，填补了肥荚红豆繁殖研究领域的空白。

具体实施方式

本实施例作如下3个处理。

处理1：肥荚红豆种子无菌诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：

（1）种子消毒与处理

将肥荚红豆种子用0.12%氯化汞溶液浸泡12min，再用2%次氯酸钠溶液浸泡8min后，用清水漂洗两遍，之后放入3MNaOH溶液浸泡40min，取出后清水漂洗两遍，剥去种皮；

（2）种子萌发

将经步骤（1）消毒与处理的种子接种于种子萌发培养基，培养27天；所述的种子萌发培养基的配方是：Read基本培养基+6-BA0.2mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8；

（3）不定芽增殖

将步骤（2）种子萌发诱导出来的芽从豆瓣上分离，整棵或切成带节的2cm～3cm的茎段转移到增殖培养基上，培养40天；所述的增殖培养基的配方是：Read基本培养基+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+ NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂30g/L,  Ph=5.8； 

（4）生根

将步骤（3）培育的增殖苗分棵切开，茎基部切平，接种于生根培养基，培养26天；所述的生根培养基的配方是：Read基本培养基+ IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8。

（5）炼苗与移栽

待步骤（4）的小苗长出4～6条主根时，将培养瓶移至室外大棚内，与透光率为70%的遮阳网下炼苗，于3天取出小苗，洗去根部培养基，移栽到穴盘中，穴盘中基质为按腐叶土：红土：珍珠岩=2：2：0.8的体积比比例混合而成的混合物，穴盘放置于育苗小棚内，棚顶覆盖一层透光率为60%的遮阳网，第8天揭去遮阳网，保持基质的土壤质量含水量为40～50 %；

上述步骤（2）～步骤（4）的培养条件：培养温度22-25℃，光照时间12 h/d，光照强度1500-2000lx。

处理2：处理2除以下措施不同外，其余措施与处理1相同，不再赘述：

（1）种子消毒与处理

将肥荚红豆种子用0.12%氯化汞溶液浸泡18min，再用2%次氯酸钠溶液浸泡12min后，用清水漂洗两遍，之后放入3MNaOH溶液浸泡80min，再用清水漂洗两遍后取出，剥去种皮；

（2）种子萌发

将经步骤（1）消毒与处理的种子接种于种子萌发培养基，培养30天；所述的种子萌发培养基的配方：Read基本培养基+6-BA1mg/L+NAA0.02 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8；

（3）不定芽增殖

将步骤（2）种子萌发诱导出来的芽从豆瓣上分离，整棵或切成带节的2cm～3cm的茎段转移到增殖培养基上，培养40天；所述的增殖培养基的配方是：Read基本培养基+6-BA1.5mg/L+KT0.07mg/L+ NAA0.08mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8； 

（4）生根

将步骤（3）培育的增殖苗分棵切开，茎基部切平，接种于生根培养基，培养31天；所述的生根培养基的配方是：Read基本培养基+IAA1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8。

（5）炼苗与移栽

待步骤（4）的小苗长出4～6条主根时，将培养瓶移至室外大棚内，与透光率为70%的遮阳网下炼苗，于5天取出小苗，洗去根部培养基，移栽到穴盘中，穴盘中基质为按腐叶土：红土：珍珠岩=2.5：1.5：1的体积比比例混合而成的混合物，穴盘放置于育苗小棚内，棚顶覆盖一层透光率为60%的遮阳网，第8天揭去遮阳网，保持基质的土壤质量含水量为40～50%；

上述步骤（2）～步骤（4）的培养条件：培养温度22～25℃，光照时间12 h/d，光照强度1500-2000lx。

处理3：处理3除以下措施不同外，其余措施与处理1相同，不再赘述：

（1）种子消毒与处理

将肥荚红豆种子用0.12%氯化汞溶液浸泡15min，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10min后，用清水漂洗，之后放入3MNaOH溶液浸泡60min，再用清水漂洗后取出，剥去种皮；

（2）种子萌发

将经步骤（1）消毒与处理的种子接种于种子萌发培养基，培养24天；所述的种子萌发培养基的配方： Read基本培养基 + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8；

（3）不定芽增殖

将步骤（2）种子萌发诱导出来的芽从豆瓣上分离，整棵或切成带节的2cm～3cm的茎段转移到增殖培养基上，培养40天；所述的增殖培养基的配方是：Read 基本培养基+ 6-BA 1 mg/L + KT 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,  Ph=5.8；

（4）生根

将步骤（3）培育的增殖苗分棵切开，茎基部切平，接种于生根培养基，培养24天；所述的生根培养基的配方： Read基本培养基+ IAA 1.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L,  Ph=5.8。

（5）炼苗与移栽

待步骤（4）的小苗长出4～6条主根时，将培养瓶移至室外大棚内，与透光率为70%的遮阳网下炼苗，于7天取出小苗，洗去根部培养基，移栽到穴盘中，穴盘中基质为按腐叶土：红土：珍珠岩=3.5：1：0.5的体积比比例混合而成的混合物，穴盘放置于育苗小棚内，棚顶覆盖一层光率为60%的遮阳网，第8天揭去遮阳网，保持基质的土壤质量含水量为40～50%；

步骤（2）～步骤（4）的培养条件：培养温度是22-25℃，光照时间是12 h/d，光照强度是1500-2000lx。

处理1-处理3的效果见表1。