含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及家蚕的转基因技术，主要为增强子Hr3和启动子IE1在制备转基因干扰载体中的联合应用；转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]，依次含有增强子Hr3、IE1基因启动子、目的基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin3(A3)内含子、目的基因反向片段和终止信号序列SV40；运用本技术，BmNPV病毒一旦侵染进入家蚕细胞就会受到抑制；本发明巧妙的利用IE1启动子和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下表达适量的dsRNA；当BmNPV侵染家蚕后，利用病毒增殖产生的IE1蛋白激活Hr3增强子来大量表达dsRNA，使靶标基因dsRNA的表达量随着病毒量的增加而增加，最大程度减少表达dsRNA对家蚕正常生理活动的影响，并显著提高家蚕的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在很多发展中国家，养蚕业是农民经济收入的一个重要来源。但是，每当养蚕业遭遇病毒侵害时，蚕业生产必将受到不可挽回的巨大损失。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是对养蚕业危害最为严重的一种病原。已有研究结果表明，破坏病毒的某些必需基因，病毒将不能进行增殖。利用转基因技术抑制病毒关键基因的表达是培育家蚕抗病品种的有效策略。

RNA干扰（RNAi）是指通过反义RNA和正链RNA形成双链RNA（dsRNA）分子，在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默，即序列特异性的转录后基因沉默技术。RNA干扰是最近十年发展起来的操控基因表达的新的强有力的实验方法。因为RNA干扰技术利用了dsRNA 能够特异的介导靶标基因表达沉默这一在生物界本身存在的基因表达调节机制，故与其他调控基因表达的手段相比，具有高效、快速且特异性好的特点。此外，由于RNA干扰是生物体固有的古老而天然的抗病毒机制，所以RNA干扰技术用于抗病毒治疗是最直接的运用。

利用转基因和RNA干扰相结合的转基因干扰技术，构建转基因干扰载体，在转基因家蚕体内持续表达能够抑制BmNPV病毒增殖的dsRNA，是制备家蚕抗病毒品种的有效方法。目前已有研究者利用IE1或者A4等组成型启动子来构建转基因干扰载体，制备转基因家蚕系统。但是，不管是否有病毒侵染，这些转基因家蚕系统体内都会有等量的dsRNA存在。因此，最优的转基因干扰载体应该是，制备的转基因家蚕在正常情况下有适量的dsRNA表达，在病毒侵染以后，家蚕体内的dsRNA量随着病毒侵入而诱导上调表达。

目前已经报道的少量关于家蚕转基因干扰抗BmNPV的研究中，都是利用组成性启动子构建转基因干扰载体，通过注射实验室用非滞育品种制备转基因家蚕系统。目前还没有利用组成诱导型启动子构建转基因干扰载体，制备家蚕实用品种转基因干扰系统的报道。

 

发明内容

     本发明的目的之一在于提供增强子Hr3联合启动子IE1的应用，该应用为家蚕转基因干扰载体的构建提供了新思路。本发明的目的之二在于提供一种转基因干扰载体，其能提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。本发明的目的之三在于提供上述转基因干扰载体的制备方法，该方法操作简单，稳定性高。

本发明家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，依次通过以下步骤实现： 

(1)利用转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]构建包含病毒IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-IGG)，包含家蚕A4启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-AGG)和包含病毒Hr3增强子、IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm] (pb-HIGG)。

(2)将家蚕932品种通过15℃低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后2h-3h用显微注射仪内将3-4nl、总浓度为400ng/ul的混合质粒（增量表达载体和辅助质粒按1:1混合）注射进蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。

(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒4min后,置于25℃、相对湿度为80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代（G0）的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的G1代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。

(4)将转基因系统IGG、 HIGG、AGG和正常932（非转基因932）经口添食感染BmNPV病毒，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。不同剂量病毒添食后的死亡率统计结果显示转基因系统HIGG对BmNPV病毒的抗性效果最好。

(5)在攻毒后48h，IGG、 HIGG、AGG和正常932各随机抽取10头蚕提取总DNA，通过荧光定量PCR检测BmNPV病毒的拷贝数，证明HIGG中的病毒含量确实远低于正常932品种。

(6) 调查IGG、 HIGG、AGG和正常932的经济性状，各系统雌雄各随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量，计算茧层率，确定转基因系统的经济性状没有受到影响。

为实现上述三种目的，本发明的技术方案为：

1增强子Hr3和启动子IE1在转基因干扰载体中的联合应用，所述增强子Hr3如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示，所述启动子IE1如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示。

2 所述转基因干扰载体为以BmNPV病毒为靶标的干扰载体。

3 含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]，所述基础载体上依次含有增强子Hr3、启动子IE1、目的基因正向片段、单链区、目的基因反向片段和终止信号序列SV40。

4 根据3所述的转基因干扰载体，所述目的基因为gp64基因，gp64基因的正向片段如SEQ ID NO:3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。

5根据4所述的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体为pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]，转基因干扰载体以转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]为基础载体，并依次含有病毒Hr3增强子、IE1启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子（A3 intron）、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段。

6所述的转基因干扰载体的制备方法，具体包括以下步骤：

A. 目的基因的正、反向片段的构建

设计目的基因正向片段，其上游引物为  5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3'，其下游引物为:  5' cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3'；设计目的基因反向片段，其上游引物为:   5' cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3'，其下游引物为   5' tgctctagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'；利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，分别得如SEQ ID NO:3所示的目的基因正向片段和如SEQ ID NO:4所示的目的基因反向片段；

B. pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A的构建

将所述目的基因正向片段用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，同时用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切包含家蚕肌动蛋白Actin 3内含子的pMD-19载体，连接酶切片段，得pMD-19-gp64S-A3intron载体；将所述目的基因反向互补片段和pMD-19-gp64S-A3intron载体分别用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切并连接，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体；

C．1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体的构建

将含有IE1启动子和SV40终止信号的L4440载体和pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切并连接，得L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5；将L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfa1180fa载体分别用SalⅠ和BglⅡ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体；

D．1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体的构建

将1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体和所述增强子Hr3分别用NcoⅠ进行单酶切，并连接，得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

E． pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGF Pafm]载体的构建

用限制性内切酶AscⅠ分别酶切步骤D所得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，得Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段；同时用内切酶AscⅠ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段；将Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，得重组载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGF Pafm]。

步骤A中，PCR反应条件均为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、52℃退火40秒、72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；

7 根据6所述的转基因干扰载体的制备方法，步骤中E中，对获得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化后，将Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，得重组载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGF Pafm]。

本发明的有益效果在于：本发明家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，通过对转基因干扰载体进行优化，提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。与其他方法相比，本发明具有以下优势：①使家蚕在发育的各个时期均能持续表达靶标基因的dsRNA，BmNPV病毒一旦侵染进入家蚕细胞就会受到抑制；②巧妙的利用IE1启动子和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下表达适量的dsRNA；当BmNPV侵染家蚕后，利用病毒增殖产生的IE1蛋白激活Hr3增强子来大量表达dsRNA，使靶标基因的dsRNA表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达dsRNA对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性；③和非滞育品种相比，滞育性转基因系统不需要连续饲养，保存和管理方便，而且品种资源丢失的风险低；④和传统育种手段相比，本发明通过转基因制备抗性品种不但效果好而且周期短。

附图说明

图1为构建转基因干扰载体pBac[IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP afm]、pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP afm]和pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP afm]的结构示意图。

图2为在3龄起蚕以3×10⁵ 个病毒多角体/头的剂量经口单头添食感染BmNPV病毒后，转基因系统IGG、 AGG、HIGG和正常932的死亡率统计结果。

图3为在3龄起蚕以5×10⁵ /头的剂量经口单头添食感染BmNPV病毒后，转基因系统IGG、 AGG、HIGG和正常932的死亡率统计结果。

图4为攻毒后48h，转基因系统IGG、 AGG、HIGG和正常932各系统体内BmNPV病毒拷贝数检测结果。932的病毒含量被设置为100%，各转基因系统的病毒含量被换算成相应的百分比。

图5为转基因系统IGG、 AGG、HIGG和正常932的茧重统计结果。

图6为转基因系统IGG、 AGG、HIGG和正常932茧层率分析图。

具体实施方式

 就分子生物学领域中，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

 

实施例1：转基因干扰载体的制备

本发明以BmNPV gp64基因作为靶标基因为例，构建转基因干扰载体。同理，本发明不限于以BmNPV gp64基因作为靶标基因，也可采用其它已报道或未报道的基因。

以已经报道的BmNPV gp64基因序列，设计正向片段(gp64S)扩增引物gp64senseF:  5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3'，gp64senseR:  5' cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3'，以及反向片段(gp64A)扩增引物gp64antiF:   5' cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3'，gp64antiR:   5' tgctctagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'。利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、52℃退火40秒、72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T simple载体连接，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明本实施例成功克隆了gp64基因的正反向片段序列。gp64基因的正向片段如SEQ ID NO:3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。

将如SEQ ID NO:3所示的正向片段gp64S用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得gp64S酶切片段；同时用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切已经包含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子（A3 intron）的pMD-19载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pMD-19载体酶切片段，将gp64S酶切片段和pMD-19载体酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到pMD-19-gp64S-A3intron载体。另外，将如SEQ ID NO:4所示的反向互补片段gp64A和pMD-19-gp64S-A3intron载体分别用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体。

将已经包含IE1启动子和SV40终止信号的L4440载体（该载体为本实验之前的其他实验所构建）和pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，如SEQ ID NO:5；将L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfa1180fa载体分别用SalⅠ和BglⅡ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体。

将L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和家蚕肌动蛋白基因Actin 4（A4）启动子分别用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到L4440-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体；将L4440-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfa1180fa载体分别用SalⅠ和BglⅡ进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

（5）将1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体和本实验室的Hr3序列分别用NcoⅠ进行单酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸如SEQ ID NO:6所示。

（6）用限制性内切酶AscⅠ分别酶切1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40、1180-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40、A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段；同时用内切酶AscⅠ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段，然后对获得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化，将IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]进行连接，转化后筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP afm]（pb-IGG)；将A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGF Pafm] (pb-AGG)；将Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGF Pafm] (pb-HIGG)上述转基因载体如图1所示。

实施例2：转基因显微注射和阳性个体的筛选

将家蚕932品种蚕卵浸酸（所用盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%），化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；

将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得pb-IGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进97粒932蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的25头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G0代蚕蛾通过自交或回交共获得8蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus^?电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得1个阳性蛾圈，即1个IE1启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称IGG转基因系统，转化效率为12.50%；将实施例1所得pb-AGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进103粒932蚕卵中，共孵化26头G0代蚁蚕，获得9蛾圈G1代蚕卵，筛选得到1个阳性蛾圈，即1个A4启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称AGG转基因系统，转化效率为11.11%；将实施例1所得pb-HIGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进124粒932蚕卵中，共孵化38头G0代蚁蚕，获得15蛾圈G1代蚕卵，筛选得到2个阳性蛾圈，即2个Hr3+IE1启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称HIGG转基因系统，转化效率为13.33%；

实施例3：转基因系统的抗性检测

将实施例2获得的一个IGG阳性蛾圈、一个AGG阳性蛾圈和随机选择的一个HIGG阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大。

取转基因系统IGG、 HIGG、AGG和正常932品种，在3龄起蚕时期单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，连续10天统计死亡率。

对IGG、HIGG AGG和正常932品种的死亡率进行统计。抗性检测结果显示，当以3×10⁵ /头的剂量进行添食时，其死亡率结果如图2所示，转基因系统HIGG的死亡率最低，具体为49.06%，AGG的死亡率为50.70%，IGG的死亡率为76.62%， 932的死亡率为62.91%。当感染病毒的剂量提高到5×10⁵ /头时，其死亡率结果如图3所示，转基因系统HIGG的死亡率为67.06%，AGG的死亡率为71.83%，IGG的死亡率为96.03%，932的死亡率为77.38%。

根据抗性检测结果证实：利用IE1+Hr3启动子的转基因干扰系统抗性效果优于利用A4和IE1启动子的转基因干扰系统。

需要说明的是，根据之前的文献报道，BmNPV病毒极早期基因ie1作为干涉靶标的抗病毒效果优于BmNPV病毒晚早期基因gp64。本发明主要是对转基因干涉载体的启动子进行优化，所以没有选择ie1作为干涉靶标。可以预见的是利用IE1+Hr3启动子，以ie1基因作为靶标的家蚕转基因干涉系统的抗性效果会更好。

 

实施例4：定量PCR检测攻毒后各系统中BmNPV病毒的含量

将实施例3的蚕在攻毒后48h，IGG、 HIGG、AGG和正常932每个系统各取10头蚕提取总DNA。每个DNA模板各取20 ng，以BmNPV病毒gp41基因的特异引物进行定量PCR检测，引物为GP41 F: 5‘cgtagtagtagtaatcgccgc3’, GP41 R: 5‘agtcgagtcgcgtcgcttt3’， （试剂盒为SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa；定量PCR检测仪器为ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR System，Applied Biosystems；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作；以家蚕看家基因BmGAPDH为内参，引物为 BmGAPDH F: 5‘ gctgcctccttgaccttttgc3 ’, BmGAPDH R: 5‘ cattccgcgtccctgttgctaat 3’。

定量PCR的结果如图4所示：在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，正常932体内的BmNPV病毒拷贝数被设置为100%；IGG系统的病毒含量为114%左右，略高于正常932；而HIGG系统的病毒含量仅为正常932中的45%左右；AGG系统的病毒含量为54%左右，高于IGG而低于正常932 。

BmNPV病毒拷贝数的检测结果说明，HIGG系统明显抑制了BmNPV病毒在其体内的复制增殖，所以HIGG的抗性效果最好。

实施例5：调查转基因系统的经济性状

实施例2获得的IGG、 HIGG、AGG和正常932各系统雌雄各自随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量。

统计的全茧量结果如图5所示：IGG、 HIGG、AGG和正常932的全茧量分别为1.30g、1.58g、1.30g、1.36g (雌)，和1.20g、1.36g、1.15g、1.06g (雄)。结果显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。

计算出的茧层率结果如图6所示：IGG、 HIGG、AGG和正常932的全茧量分别为17.51%、20.05%、20.70%、19.69% (雌)，和22.65%、22.33%、25.55%、23.68 % (雄)。结果也显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。

以上调查结果显示转基因干扰系统在提高家蚕抗性的同时不会影响家蚕的经济性状。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  西南大学

<120>  含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体及其制备方法和应用

<160>  7

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<211>  959

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  增强子Hr3

<400>  1

ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg caatccaacg      60

acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg     120

aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt     180

tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc     240

agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt     300

aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat     360

cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag     420

ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt     480

ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt     540

acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag     600

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta     660

aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg     720

aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg     780

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta     840

aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac     900

gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatgg      959

 

 

 

                                          

<210>  2

<211>  573

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  启动子IE1

<400>  2

ggtatcgata agcttcgatg tctttgtgat gcgccgacat ttttgtaggt tattgataaa      60

atgaacggat acagttgccc gacattatca ttaaatcctt ggcgtagaat ttgtcgggtc     120

cattgtccgt gtgcgctagc atgcccgcta acggacctcg tacttttggc ttcaaaggtt     180

ttgcgcacag acaaaatgtg ccacacttgc agctctgcat gtgtgcgcgt taccacaaat     240

cccaacggcg cagtgtactt gttgtatgca aataaatctc gataaaggcg cggcgcgcga     300

atgcagctga tcacgtacgc tcctcgtgtt ccgttcaagg acggtgttat cgacctcaga     360

ttaatgttta tcggccgact gttttcgtat ccgctcacca aacgcgtttt tgcattaaca     420

ttgtatgtcg gcggatgttc tatatctaat ttgaataaat aaacgataac cgcgttggtt     480

ttagagggca taataaaaga aatattgtta tcgtgttcgc cattagggca gtataaattg     540

acgttcatgt tggatattgt ttcagttgca agt                                  573

 

 

<210>  3

<211>  529

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  gp64基因正向片段

<400>  3

attaaacgta aagtcgagca ccaagtcaag aaacggccac ccacttggcg ccacaacgtt      60

agagccaagt acacagaagg agacactgcc accaaaggcg acctgatgca tattcaagag     120

gagctgatgt acgaaaacga tttgctgaaa atgaacattg agctgatgca tgcgcatatc     180

aacaagataa acaatatgct gcacgacctg atagtttccg tggccaaggt ggacgagcgt     240

ttgattggca atctcatgaa caattctgtt tcttcaacat ttttgtcgga cgacacgttt     300

ttgctgatgc cgtgcaccaa tccgccggca cacaccagta attgctacaa caacagcatt     360

tacaaagaag ggcgttgggt ggccaacacg gactcgtcgc aatgcataga ttttagcaac     420

tacaaggaac tagcaatcga cgacgacgtc gaattttgga ttccgaccat cggcaacaca     480

acctatcacg acagttggaa agatgccagc ggttggtcgt ttattgccc                    529

 

<210>  4

<211>  529

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  gp64基因反向片段

<400>  4

gggcaataaa cgaccaaccg ctggcatctt tccaactgtc gtgataggtt gtgttgccga      60

tggtcggaat ccaaaattcg acgtcgtcgt cgattgctag ttccttgtag ttgctaaaat     120

ctatgcattg cgacgagtcc gtgttggcca cccaacgccc ttctttgtaa atgctgttgt     180

tgtagcaatt actggtgtgt gccggcggat tggtgcacgg catcagcaaa aacgtgtcgt     240

ccgacaaaaa tgttgaagaa acagaattgt tcatgagatt gccaatcaaa cgctcgtcca     300

ccttggccac ggaaactatc aggtcgtgca gcatattgtt tatcttgttg atatgcgcat     360

gcatcagctc aatgttcatt ttcagcaaat cgttttcgta catcagctcc tcttgaatat     420

gcatcaggtc gcctttggtg gcagtgtctc cttctgtgta cttggctcta acgttgtggc     480

gccaagtggg tggccgtttc ttgacttggt gctcgacttt acgtttaat                   529

 

<210>  5

<211>  1946

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体

<400>  5

ggtatcgata agcttcgatg tctttgtgat gcgccgacat ttttgtaggt tattgataaa      60

atgaacggat acagttgccc gacattatca ttaaatcctt ggcgtagaat ttgtcgggtc     120

cattgtccgt gtgcgctagc atgcccgcta acggacctcg tacttttggc ttcaaaggtt     180

ttgcgcacag acaaaatgtg ccacacttgc agctctgcat gtgtgcgcgt taccacaaat     240

cccaacggcg cagtgtactt gttgtatgca aataaatctc gataaaggcg cggcgcgcga     300

atgcagctga tcacgtacgc tcctcgtgtt ccgttcaagg acggtgttat cgacctcaga     360

ttaatgttta tcggccgact gttttcgtat ccgctcacca aacgcgtttt tgcattaaca     420

ttgtatgtcg gcggatgttc tatatctaat ttgaataaat aaacgataac cgcgttggtt     480

ttagagggca taataaaaga aatattgtta tcgtgttcgc cattagggca gtataaattg     540

acgttcatgt tggatattgt ttcagttgca agtgaattca ttaaacgtaa agtcgagcac     600

caagtcaaga aacggccacc cacttggcgc cacaacgtta gagccaagta cacagaagga     660

gacactgcca ccaaaggcga cctgatgcat attcaagagg agctgatgta cgaaaacgat     720

ttgctgaaaa tgaacattga gctgatgcat gcgcatatca acaagataaa caatatgctg     780

cacgacctga tagtttccgt ggccaaggtg gacgagcgtt tgattggcaa tctcatgaac     840

aattctgttt cttcaacatt tttgtcggac gacacgtttt tgctgatgcc gtgcaccaat     900

ccgccggcac acaccagtaa ttgctacaac aacagcattt acaaagaagg gcgttgggtg     960

gccaacacgg actcgtcgca atgcatagat tttagcaact acaaggaact agcaatcgac    1020

gacgacgtcg aattttggat tccgaccatc ggcaacacaa cctatcacga cagttggaaa    1080

gatgccagcg gttggtcgtt tattgcccgg atcccggtga gctcatcgat tctggactat    1140

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taggttgtgt tgccgatggt cggaatccaa aattcgacgt cgtcgtcgat tgctagttcc    1320

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agcaaaaacg tgtcgtccga caaaaatgtt gaagaaacag aattgttcat gagattgcca    1500

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ttgttgatat gcgcatgcat cagctcaatg ttcattttca gcaaatcgtt ttcgtacatc    1620

agctcctctt gaatatgcat caggtcgcct ttggtggcag tgtctccttc tgtgtacttg    1680

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ttaattctag aagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa    1800

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cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa    1920

taaagcattt ttttcactgc agatct                                                 1946

 

<210>  6

<211>  2920

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体

<400>  6

ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg caatccaacg      60

acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg     120

aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt     180

tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc     240

agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt     300

aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat     360

cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag     420

ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt     480

ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt     540

acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag     600

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta     660

aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg     720

aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg     780

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta     840

aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac     900

gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatggc     960

catgggacgt cgacggtatc gataagcttc gatgtctttg tgatgcgccg acatttttgt    1020

aggttattga taaaatgaac ggatacagtt gcccgacatt atcattaaat ccttggcgta    1080

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taaccgcgtt ggttttagag ggcataataa aagaaatatt gttatcgtgt tcgccattag    1500

ggcagtataa attgacgttc atgttggata ttgtttcagt tgcaagtgaa ttcattaaac    1560

gtaaagtcga gcaccaagtc aagaaacggc cacccacttg gcgccacaac gttagagcca    1620

agtacacaga aggagacact gccaccaaag gcgacctgat gcatattcaa gaggagctga    1680

tgtacgaaaa cgatttgctg aaaatgaaca ttgagctgat gcatgcgcat atcaacaaga    1740

taaacaatat gctgcacgac ctgatagttt ccgtggccaa ggtggacgag cgtttgattg    1800

gcaatctcat gaacaattct gtttcttcaa catttttgtc ggacgacacg tttttgctga    1860

tgccgtgcac caatccgccg gcacacacca gtaattgcta caacaacagc atttacaaag    1920

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aactagcaat cgacgacgac gtcgaatttt ggattccgac catcggcaac acaacctatc    2040

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cgttttcgta catcagctcc tcttgaatat gcatcaggtc gcctttggtg gcagtgtctc    2640

cttctgtgta cttggctcta acgttgtggc gccaagtggg tggccgtttc ttgacttggt    2700

gctcgacttt acgtttaatt ctagaagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt    2760

ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca    2820

attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc    2880

acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcagatct                              2920

 

<210>  7

<211>  2139

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  L4440-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体

<400>  7

gattcatctt gtcacaccta catcttacta atttcgtaag tagatttttt tttacacgta      60

taatgtatgt attctttcct taattaactt attttgaaac gaaataaata ggctattaat     120

atttggaatt aggttgcggt caatgtcaat gtctgtctca actttaattc agaatgcctt     180

gagaaccgta gatgctataa atcaatcaag atgcatcttg gattgttgcc aactcgcagc     240

tacaaaattt gtttccaagc ctaagcatag tgctgtaccc gttcccgtgt attcagatcc     300

cgtataatag tataatatac tccgtaaatg tagtgtcact gcttgctgaa atgatattgc     360

aagttccgtt gggaatcttg ccgttatcaa gcaatgcgat attagcggta tggcgggagg     420

gggacgcgca gactccctct gctgtaatac catatatgga cacaaaactt cgtgtattgt     480

accctagcgc gcgattggag gagagtctgc ggcggcgggg caggggcgcc ccgataacca     540

gcctcattta tatagtccgc caagcgcact caccaacatt ccacgaagtg agcttgggtc     600

gttgcgttgt acagcaataa cgaagctgtg caatagcaag ttaatttatt tatttataat     660

agaactattt aattaaaagt aagttatttt cattgtgtct tcaaatatat taagtgattg     720

tgataacggt taacggatct ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcattaaacg     780

taaagtcgag caccaagtca agaaacggcc acccacttgg cgccacaacg ttagagccaa     840

gtacacagaa ggagacactg ccaccaaagg cgacctgatg catattcaag aggagctgat     900

gtacgaaaac gatttgctga aaatgaacat tgagctgatg catgcgcata tcaacaagat     960

aaacaatatg ctgcacgacc tgatagtttc cgtggccaag gtggacgagc gtttgattgg    1020

caatctcatg aacaattctg tttcttcaac atttttgtcg gacgacacgt ttttgctgat    1080

gccgtgcacc aatccgccgg cacacaccag taattgctac aacaacagca tttacaaaga    1140

agggcgttgg gtggccaaca cggactcgtc gcaatgcata gattttagca actacaagga    1200

actagcaatc gacgacgacg tcgaattttg gattccgacc atcggcaaca caacctatca    1260

cgacagttgg aaagatgcca gcggttggtc gtttattgcc cggatcccgg tgagctcatc    1320

gattctggac tatgcacttc gtctctcggc cggtgggccg ttatcgaccg ttatctgacg    1380

aatgactttg ttctgtttca gccaagcttg ggcaataaac gaccaaccgc tggcatcttt    1440

ccaactgtcg tgataggttg tgttgccgat ggtcggaatc caaaattcga cgtcgtcgtc    1500

gattgctagt tccttgtagt tgctaaaatc tatgcattgc gacgagtccg tgttggccac    1560

ccaacgccct tctttgtaaa tgctgttgtt gtagcaatta ctggtgtgtg ccggcggatt    1620

ggtgcacggc atcagcaaaa acgtgtcgtc cgacaaaaat gttgaagaaa cagaattgtt    1680

catgagattg ccaatcaaac gctcgtccac cttggccacg gaaactatca ggtcgtgcag    1740

catattgttt atcttgttga tatgcgcatg catcagctca atgttcattt tcagcaaatc    1800

gttttcgtac atcagctcct cttgaatatg catcaggtcg cctttggtgg cagtgtctcc    1860

ttctgtgtac ttggctctaa cgttgtggcg ccaagtgggt ggccgtttct tgacttggtg    1920

ctcgacttta cgtttaattc tagaagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt    1980

tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa    2040

ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca    2100

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcagatct                           2139