一种热性惊厥模型鼠的筛选方法及其应用

摘要

本发明涉及用于药物筛选及疾病机制研究的动物模型的建立的技术领域，具体涉及一种热性惊厥模型鼠的筛选方法，是一种将经典的水浴加热诱导模型结合人工定向选择和交配繁育的方式筛选得到模型鼠的方法。本发明的方法独特，能成功获得良好的热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠。

说明书

技术领域

本发明涉及用于药物筛选及疾病机制研究的动物模型的建立的技术领域，具 体涉及一种热性惊厥模型鼠的筛选方法，是一种通过热性惊厥模型以人工定向选 择和交配繁育的方式筛选得到模型鼠的方法。

背景技术

热性惊厥是小儿时期最常见的中枢神经系统功能异常的紧急症状，在婴幼儿 中尤为多见，其总发病率约为2％～4％，欧美为2％～5％，日本为6％～9％，某 些地区甚至高达14％。热性惊厥可导致神经系统的后遗症，回顾性研究表明，40％ 有复杂型热性惊厥发病史的病人会产生海马硬化和颞叶癫痫，同时流行病学调查 结果显示患儿发生癫痫的相对危险性是一般儿童的10倍。因此，对热性惊厥疾 病的预防和治疗就显得极为重要。但是目前仍缺少一种特异的用于热性惊厥机制 研究和治疗药物评价及筛选的模型鼠。

热性惊厥的疾病模型的建立由来已久，主要分为以下几类：体表直接加热诱 导模型、微波加热诱导模型、脂多糖诱导发热模型、热循环气流加热诱导模型和 热水浴加热诱导模型。其中，体表直接加热法会造成实验鼠的体表烫伤并且死亡 率高(Holtzman，D.，Obana，K.，and Olson，J.Hyperthermia-induced seizures in the rat pup：A model for febrile convulsions.Science.1981，213(4511)：1034-1036.)。脂多 糖诱导惊厥法成功率低，仅为50％，且无法排除该外源物质对模型构建的影响， 因此不能成为一种合适的动物模型(Heida JG，Boisse L，Lipopolysaccharide -induced febrile convulsions in the rat：short-term sequelae.Epilepsia.2004， 45(11)：1317-1329.)。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的一个目的在于提供了一种获得热性惊 厥敏感模型鼠和热性惊厥耐受模型鼠的筛选方法。通过此方法得到的热性惊厥敏 感模型鼠的发作温度低、发病率高且接近临床表现；得到的热性惊厥耐受模型鼠 的发作温度高，发病率低。这两种模型鼠不仅适用于热性惊厥模型的构建，而且 有利于热性惊厥的发病机制的研究。

本发明的另一个目的在于提供了一种前述的热性惊厥敏感模型鼠在防治热 性惊厥疾病的药物评价、筛选中的应用及用于发病机制的研究。

本发明的再一个目的在于提供了一种前述的热性惊厥耐受模型鼠对于热性 惊厥发病机制的研究。

为了实现第一个目的，本发明采取的技术措施如下：

一种热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的筛选方法，步骤如下：

1)初次筛选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级大鼠进行热性惊厥水浴实 验，温度设定在43.0℃-45.0℃。

1.1)敏感组大鼠的筛选：按照热性惊厥的发作等级的5级评分标准来筛选， 3级以上为敏感，等级越高越敏感；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短， 潜伏期越短越敏感；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长 短，时间越长越敏感。以此标准最终筛选出热性惊厥最敏感大鼠4只，其中雌雄 各半，组成敏感组大鼠；

耐受组大鼠的筛选：按照热性惊厥的发作等级5级评分标准来筛选，0级或 1级为耐受，等级越低越耐受；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏 期越长越耐受；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短， 时间越短越耐受。以此标准最终筛选出热性惊厥最耐受大鼠4只，其中雌雄各半， 组成耐受组大鼠。

1.2)将筛选出的敏感组大鼠和耐受组大鼠分别进行组内交配繁育获得第二 代大鼠，将所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验。

2)待第二代敏感组和耐受组大鼠生长至21日龄，进行热性惊厥水浴实验。

2.1)热性惊厥敏感组大鼠的水浴温度设定在43.0℃-45.0℃。根据上述敏感 组大鼠同样的筛选标准，从中选出热性惊厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，进行 组内交配繁育获得第三代大鼠，将所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。

2.2)热性惊厥耐受组大鼠的水浴温度设定在44.0℃-46.0℃。根据上述耐受 组大鼠同样的筛选标准，从中选出热性惊厥最耐受大鼠4只(雌雄各半)，进行 组内交配繁育获得第三代大鼠，将所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。

3)待第三代敏感组和耐受组大鼠生长至21日龄时，继续改变水浴温度进行 筛选实验。

3.1)热性惊厥敏感组大鼠的水浴温度设定在40.0℃-42.0℃。根据上述敏感 组大鼠同样的筛选标准，筛选出更加敏感的大鼠。

3.2)热性惊厥耐受组大鼠的水浴温度设定在45.0℃-46.0℃。根据上述耐受 组大鼠同样的筛选标准，筛选出更加耐受的大鼠。

(惊厥程度分级：0级为未发生惊厥；1级为大鼠面部急速抽动；2级为大 鼠点头或甩尾；3级为大鼠一侧前肢抬起阵挛；4级为大鼠全身强直或双侧前肢 抬起痉挛；5级为大鼠全身强直阵挛或跌倒。)

(惊厥潜伏期：从大鼠放入水中至刚开始发生惊厥的时间。)

(惊厥持续时间：大鼠由刚开始发生惊厥至惊厥停止的时间。)

本发明利用经典的水浴加热诱导模型，以人工定向选择和交配繁殖的方式筛 选得到的敏感大鼠，其温度敏感程度和发病率随代数的增加而增加，且趋势能继 续保持下去；本发明方法筛选得到的耐受大鼠，温度敏感程度低且发病率随代数 的增加而降低，且趋势能继续保持下去。

为了实现本发明的第二个目的，验证所筛选出的敏感模型鼠在研究热性惊厥 发病机制中的作用和在药物筛选方面的优点，我们选用了临床常用的抗惊厥药物 苯巴比妥进行药理学实验。

实验方法如下：

(1)待第三代热性惊厥敏感大鼠生长至21日龄，随机分为2组用于药理实验 (苯巴比妥组和热性惊厥组)，另取正常SPF级21日龄大鼠作为正常对照组。给 以连续8天相应处理，记录其发作的潜伏期、持续时间和发作等级。

①苯巴比妥组：每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43℃水浴4min；

②热性惊厥组：每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，43℃水浴4min；

③正常对照组：每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，33℃水浴4min；

(2)待大鼠30日龄时进行Morris水迷宫实验，主要用于验证大鼠的学习记忆 能力。实验包括两部分：定位航行实验和空间定位实验。通过比较，在热性惊厥 等级和潜伏期上苯巴比妥组都显著优于热性惊厥组，同时在学习记忆能力方面， 苯巴比妥组明显优于热性惊厥组。

(3)最后我们利用TUNEL法凋亡实验、尼氏染色实验及电镜实验等实验方法 证明：热性惊厥组的受损程度最高，苯巴比妥组受损程度相对于热性惊厥组有所 减轻。

为了实现本发明的第三个目的，更进一步地研究热性惊厥的发病机制，我们 利用基因表达谱芯片分析了热性惊厥敏感鼠和耐受鼠的mRNA表达差异情况。

实验方法如下：

(1)动物筛选：从上述第一代100只(雌雄各半)21日龄的SPF级大鼠中，采 用上述的方法逐代筛选，最终从第三代大鼠中选出热性惊厥最敏感鼠和最耐受鼠 各3只。

(2)动物取材：提取筛选出的大鼠的脑组织海马，将其放入无RNA酶的冻存 管中，置于液氮中保存。

(3)基因芯片分析：将6个保存样本样送至上海伯豪生物技术有限公司进行 基因芯片分析。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

本发明的筛选方法主要是利用最经典的热性惊厥热水浴加热诱导模型，并结 合人工定向选择和动物交配繁育的方法得到热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠， 该模型诱导时间短，观察直接，且模型诱导成功率高，从第一代到第三代，温度 敏感组与耐受组的温度敏感性差异呈随代数扩大，且继续培育，这种趋势能保持 下去。这两种方法的结合应用于热性惊厥模型鼠的筛选在国内外尚未见报道。通 过本筛选方法能够更好地保持遗传倾向性，并且对生长发育的影响越来越小。

本发明方法涉及的人工定向选择和交配繁育的筛选方法可以筛选得到温度 敏感度高，发病率更高的热性惊厥敏感大鼠，且接近人类热性惊厥的临床表现； 以及温度敏感度低，发病率更低的热性惊厥耐受大鼠。从实验应用方面可以看出 不管是在惊厥等级还是在学习记忆方面苯巴比妥组都显著优于热性惊厥组，同时 利用筛选得到的敏感鼠和耐受鼠进行基因表达谱的分析，得到热性惊厥相关表达 差异基因。从而证明了本发明得到的热性惊厥模型鼠更有利于研究热性惊厥发病 机制及防治药物的评价和筛选。

附图说明

图1：敏感组大鼠热性惊厥发作平均温度。

第1-3代发作平均温度分别为44.3±0.79℃、43.5±0.53℃和41.9±1.1℃。

1代与2代比较，P＜0.05；2代和3代比较，P＜0.01；3代与1代比较，P＜0.001。

图2：43.0℃水浴条件下(其他条件同实施例1和2)，敏感组大鼠热性惊厥 发病率(2级以上为发病)。

第1-3代发病率分别为25％、35.2％和72.7％。

3代与1、2代比较，P＜0.05。

图3：热性惊厥耐受组大鼠惊厥平均温度。

第1-3代发作平均温度分别为43.9±0.72℃、44.7±0.61℃和45.4±0.50℃。

2代与1代、3代比较，P＜0.05；1代与3代相比比较，P＜0.001。

图4：45.0℃水浴条件下(其他条件同实施例1和2)，耐受组大鼠热性惊厥 发病率(2级以上为发病)。

第1-3代发病率分别为62.5％、29.5％和20.8％。1代与2、3代相比，P＜0.05。

图5：海马组织电镜超微结构观察实验结果示意图。

图中A为正常对照组、B为苯巴比妥组、C为热性惊厥组。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发 明，而不限制本发明的保护范围。

实施例1：

一种热性惊厥敏感模型鼠的筛选方法，步骤如下：

(1)初次筛选实验中选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级正常大鼠。将 大鼠放入一个透明的玻璃筒中(直径6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多个小孔 与外部相通。将筒竖立于恒温水浴箱中，通过向玻璃筒底垫放塑料垫片以调节筒 中水的深度，以大鼠沿筒壁站立时仅能露出头部为准。第一次筛选温度为43.0 ℃，第二次筛选温度为44.0℃，第三次筛选温度为45.0℃。每次水浴4分钟后取 出大鼠进行观察。按照热性惊厥的发作等级的5级评分标准来筛选，3级以上为 敏感，等级越高越敏感；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越短 越敏感；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短，时间越 长越敏感，最终筛选出热性惊厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，然后继续培育至 体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第 二代大鼠全部用于下一步实验。

(2)待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅改变水浴温 度，筛选温度逐渐降低。第一次筛选温度是45.0℃，第二次筛选温度是44.0℃， 第三次筛选温度是43.0℃。根据上述同样的标准，最终筛选出4只最敏感大鼠(雌 雄各2只)，然后继续培育至体重在250g以上，且至少达到90日龄，组内进行 随机交配繁殖，所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。

(3)待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选，筛选温度进一步 降低。第一次筛选温度是42.0℃，第二次筛选温度是41.0℃，第三次筛选温度是 40.0℃。根据上述同样的标准，最终筛选出4只最敏感的大鼠(雌雄各2只)。

统计学分析结果显示(见图1和2)，通过人工定向选择和交配繁殖的方式得 到的敏感大鼠的惊厥发作平均温度逐代降低，发病率逐代上升，且均有显著性差 异。表明通过本筛选方法，成功得到了一种热性惊厥敏感模型鼠，其发作温度低、 发病率高且接近临床表现，更有利于研究热性惊厥的发病机制及药物筛选。

实施例2：

一种热性惊厥耐受模型鼠的筛选方法，步骤如下：

(1)初次筛选实验中选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级正常大鼠。将 大鼠放入一个透明的玻璃筒中(直径6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多个小孔 与外部相通。将筒竖立于恒温水浴箱中，通过向玻璃筒底垫放塑料垫片以调节筒 中水的深度，以大鼠沿筒壁站立时仅能露出头部为准。第一次筛选温度为43.0 ℃，第二次筛选温度为44.0℃，第三次筛选温度为45.0℃。每次水浴4分钟后取 出大鼠进行观察，按照热性惊厥的发作等级5级评分标准来筛选，0级或1级为 耐受，等级越低越耐受；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越长 越耐受；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短，时间越 短越耐受，最终筛选出热性惊厥最耐受的大鼠4只(雌雄各半)，然后继续培育 至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的 第二代大鼠全部用于下一步实验。

(2)待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅升高水浴温 度。第一次筛选温度为44.0℃，第二次筛选温度为45.0℃，第三次筛选温度为 46.0℃。根据上述同样的耐受鼠筛选标准最终选出最耐受大鼠4只(雌雄各半)， 然后继续培育至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁 殖，所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。

(3)待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选。第一次筛选温度 为45.0℃，第二次筛选温度为45.5℃，第三次筛选的温度为46.0℃。根据上述同 样的耐受鼠筛选标准最终选出最耐受大鼠4只(雌雄各半)。

统计学分析结果显示(见图3和4)，通过人工定向选择和交配繁殖的方式获 得的耐受模型鼠的惊厥发作平均温度逐代上升，发病率逐代下降，且均有显著性 差异。表明通过筛选成功得到了一种热性惊厥耐受模型鼠，更有利于研究热性惊 厥的发病机制及药物筛选。

实施例3：热性惊厥敏感和耐受模型鼠的基因芯片表达谱分析

利用基因表达谱芯片提供的信息进行高通量的信息分析，获得热性惊厥相关 差异表达基因参与的基因功能、信号通路、代谢通路等方面，从而对热性惊厥发 病机制进行更深入的了解。聚类热图是对样本和基因分别进行分级聚类之后与热 图画在一起。通过热图可以观察同一基因在不同样本中的表达情况，还可以根据 基因表达情况验证样本的分组情况。

实验步骤如下：

1.动物筛选：从上述第一代100只(雌雄各半)21日龄的SPF级大鼠中，采用 上述的方法逐代筛选，最终从第三代大鼠中选出热性惊厥最敏感鼠和最耐受鼠各 3只。

2.动物取材：根据基因芯片公司的取材标准，提取大鼠脑组织海马，将其放 入无RNA酶的冻存管中，置于液氮中保存。

3.基因芯片分析：将6个保存样本样送至基因芯片公司(上海伯豪生物技术 有限公司)进行基因表达谱分析。

所得基因芯片聚类热图结果表明：热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的基因 表达差异显著。所有基因中p＜0.05的有1582个，其中P＜0.01的基因有312个，满 足P值且差异倍数(FC)大于2的基因有89个。这些差异基因中，有些基因已经证 实是热性惊厥相关基因，如GPR98。同时我们可以通过基因的功能相关性，通过 对其他待选基因进一步的筛选、分析研究，这对于探索新的热性惊厥发病机制提 供了有力的支持和帮助。

实施例4：利用热性惊厥敏感模型鼠进行药理学实验

在实施例1所得的第三代热性惊厥敏感大鼠21日龄时随机分组，苯巴比妥组 12只，热性惊厥组11只，另选用未经任何处理的21日龄SPF级大鼠6只作为正常 对照组(后续实施例也按此分组进行)。在大鼠21日龄时开始进行连续8天以下处 理，并记录其发作的潜伏期、持续时间和发作等级。

①苯巴比妥组：每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43.0℃水浴4min；

②热性惊厥组：每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，43.0℃水浴4min；

③正常对照组：每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，33.0℃水浴4min；

统计学分析结果显示，热性惊厥组与苯巴比妥组相比，潜伏期短，发作等级 高，且均存在显著性差异。表明本发明方法筛选出的热性惊厥敏感模型鼠具有与 人类相似的药理学特征，更适合热性惊厥模型的构建。由于正常组惊厥发作等级 为0，因此附表1中不涉及其潜伏期和持续时间。

表1

#与热性惊厥组比较有显著性差异，P＜0.05

实施例5：热性惊厥敏感模型鼠的学习记忆功能和空间认知功能检测实验

在实施例4中进行分组处理的第三代热性惊厥敏感大鼠30日龄时，通过 Morris水迷宫方法检测苯巴比妥组和热性惊厥组及正常组学习记忆功能和空间 认知功能。实验用水槽为镀锌圆槽，直径150cm，高50cm，池内水深25cm，水 温22-23℃，水中加入墨汁，使水池不透明。将水池划分为四个象限，在某个 象限中点距池边25cm处放置一高23.5cm、直径8cm的平台，隐于水面下1.5cm。

实验分为两部分：

(1)定位航行实验：主要是检测动物学习记忆功能。

实验前一天下午让大鼠在水槽中自由游泳2min，以熟悉环境。实验共进行4 天，每天上、下午各进行4次试验(每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水 1次)，大鼠入水后尽力逃避水患，当发现站台后则栖身其上，图像采集及分析 系统(EthoVision 3.0)自动记录保存大鼠的运动轨迹、找到站台的潜伏期(大鼠从 入水至攀上平台的时间)、游泳时间、游泳速度、游泳距离及寻找站台的搜索战 略等信息。若120秒仍未找到站台，由操作者将大鼠引上站台上休息4秒钟并将 潜伏期记为120秒。

(2)空间探索实验：主要是检测动物空间认知能力。

第4日下午完成4次定位航行之后将站台撤除，进行空间探索试验。选定和 站台区域相对的象限中点为入水点，大鼠以面壁方式入水，记录大鼠120秒内搜 索站台穿过原站台区域的次数。

以上实验的统计学结果见下表2：

表2

  分组   潜伏期(s)   穿台次数   热性惊厥组   38.28±20.83＊＊   7.20±2.48＊   苯巴比妥组   32.55±19.29＊   8.80±1.64   正常对照组   14.14±5.87   10.67±2.49

*与正常对照组比较有显著性差异，P＜0.05

**与正常对照组比较有显著性差异，P＜0.01

上述实验结果表明，与正常对照组和苯巴比妥组相比，热性惊厥对大鼠学习 记忆功能和空间认知能力均造成显著性损伤。苯巴比妥组的记忆功能和认知能力 明显优于热性惊厥组。

实施例6TUNEL法检测组织细胞凋亡实验

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内 源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30％的染色体 DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180-200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或一条链上出现缺口会产生的一系列 DNA的3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖 核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的3’末端，就可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端 转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。凋亡细胞早期可见染成深 棕黄色环状空心结构分布在细胞核部位，细胞核染色质浓缩至核膜下呈半月形或 环状，晚期可见核固缩变小。

实验步骤如下：

凋亡检测试剂盒内容：

试剂1酶浓缩溶液      5×50ul

末端脱氧核糖核酸转移酶      (10×)

试剂2标记溶液        5×500ul

含有核甘酸混合液的反应液    (10×)

试剂3转化酶-POD      3.5ml

酶标记荧光抗体(即用型)

(1)溶液配制：阴性对照：试剂2  100ul；

TUNEL反应混合物：试剂1  50ul和试剂24  50ul混合。

(2)每组取4张石蜡切片常规脱蜡下水预处理。

(3)用蛋白酶K(20ug/ml溶于Tris/HCl pH7.4-8.0)室温孵育15-30min。PBS洗 两次，每次5min。

(4)擦干样品周围的水，滴加50ul的TUNEL反应混合液，加上盖玻片后在湿盒中 37℃孵育60min。PBS冲洗3次，每次5min。

(5)信息转化和分析：擦干样品周围的水分，加上盖玻片后在湿盒中孵育30min。 PBS冲洗3次，加入750ulDAB底物溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min。

(6)苏木精复染：浸洗5％的醋酸液(酸化液)数秒；苏木精染液处理3-5min，胞 核呈橙红色，自来水冲洗至颜色变蓝。

(7)脱水透明封片：经70％-80％-90％-95％各级酒精，每级1-5min脱水。入二 甲苯中3min至透明。滴加一小滴中性树胶并用盖玻片小心封片。

(8)显微镜下观察照相：显微镜(×200)观察计数每个大脑皮质区域阳性细胞数 目。每张切片选取大脑皮质区5个不同位点，每一位点分别计数由浅至深6个视野 内细胞总数及阳性细胞数，以胞质出现棕黄色染色为凋亡阳性细胞标志。按下列 公式计算凋亡细胞百分率：凋亡细胞百分率＝阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细 胞数)×100，取其均值作为该样本的凋亡细胞百分率。

(9)实验结果：热性惊厥组可见较多的Tunel染色阳性细胞，凋亡神经元可见染 成深棕黄色环状空心结构分布在细胞核部位；苯巴比妥组也有一定程度的Tunel 染色阳性细胞，但是与热性惊厥组相比阳性细胞数量有一定程度的减少，细胞整 齐度较好；正常对照组神经细胞状态良好，形状规则正常，几乎无凋亡细胞。 实施例7尼氏染色检测神经元状态实验

尼氏体是反映神经元状态的一个指标：在正常生理情况下，尼氏体大而数量 多，反映神经细胞合成蛋白质的功能较强，在神经元受损时，尼氏体的数量可减 少甚至消失。

实验步骤如下：

(1)每组取4张石蜡切片常规脱蜡下水预处理。

(2)将石蜡切片放入缓冲亚甲蓝染色液内染10min(不多于12min)。

(3)在0.2mol/L醋酸盐缓冲液(PH＝4.6)中分化1-3秒，并在显微镜下观察， 尼氏体清晰时进行下一步试验。

(4)用4％的钼酸铵水溶液处理切片3-5min。

(5)蒸馏水洗脱后常规脱水透明、中性树胶封片。

(6)光学显微镜(×200)观察海马CA1区尼氏体的变化。

(7)实验结果显示：热性惊厥组大鼠海马CA1区较正常对照组尼氏体明显减少， 胞质淡染，且有海马分层稀疏紊乱的现象。苯巴比妥组较正常对照组海马神经元 尼氏体轻微减少，胞质稍有淡染，海马分层稀疏紊乱。以上结果表明：热性惊厥 组大鼠的海马神经元严重受损，苯巴比妥组大鼠海马神经元轻微受损。

实施例8：海马组织电镜超微结构观察实验

实验步骤如下：

(1)灌注固定：大鼠36日龄时，各组按随机数字法随机选取2只大鼠灌注固定。

(2)分离海马组织：开颅取脑，去除海马区域大脑皮质，并将海马与周围的组 织分离。在海马CA1区用注射器针头(直径约1mm)点取脑组织数块，浸没于4℃ 2.5 ％戊二醛固定液中。

(3)环氧树脂包埋：将2.5％戊二醛前固定的组织取出0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗三 次，锇酸(O₃O₄，1％)后固定，0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗三次，梯度酒精脱水(50％， 70％，80％，95％，100％)2次，每次15min。

(4)超薄切片制样：纯丙酮中脱水2次，每次15min，EPON812：丙酮(1∶1) 浸透30min，纯包埋液浸透1h，纯包埋液固化37℃，24h后60℃纯包埋液固化 48h。

(5)超薄切片前的准备：

a.修块：将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片 先削去表面的包埋剂，暴露组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削 去包埋剂，修成锥体形。

b.半薄切片定位：利用超薄切片机切厚度为1-10um的切片。切片用镊子转移 到事先滴有蒸馏水的洁净载玻片上，加温，使切片展平。干燥后经甲苯胺蓝染色， 光学显微镜观察定位于海马CA1区。半薄切片定位以后，将包埋块作进一步的修 整成梯形或长方形，每边的长度为0.2-0.3mm。

c.制刀：制刀机制作玻璃刀，围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮 在水面上，装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。

(6)超薄切片：安装包埋块，安装玻璃刀，调节刀与组织块的距离，调节水槽 液面高度与灯光位置，调节加热电流及切片速度，LKB-V型超薄切片机切片 (1-2um)，将切片捞到有支持膜的载网上。

(7)染色：铀、铅染色(醋酸双氧铀，枸橼酸铅)。

(8)H-600型透射电镜观察。

(9)海马CA1区神经元电镜观察结果显示：正常对照组(图5-A)海马CA1区神经 元中线粒体呈椭圆形、大小正常、嵴规则；苯巴比妥组(图5-B)海马CA1区神经 元中少量线粒体肿胀、嵴模糊不清或缺失；热性惊厥组(图5-C)海马CA1区神经元 大量线粒体肿胀明显、线粒体嵴模糊不清或缺失引起海马细胞的功能障碍。实验 结果表明苯巴比妥组可以减轻海马CA1区神经元线粒体的损伤程度。