一种细菌株的同源性快速鉴别方法

摘要

本发明公开了一种细菌株的同源性快速鉴别方法，包括如下步骤：Ⅰ.根据细菌的形态、染色、培养特性，将细菌鉴别到科；Ⅱ.利用细菌对糖、蛋白质利用的生化反应进行属或种鉴别；Ⅲ.利用血清学抗体将细菌鉴别到型；Ⅳ.采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸的种类与含量，得到该细菌脂肪酸指纹识别图谱，进行同源性比较，将细菌鉴别至株。本发明方法具有快速、简易、成本低、实验过程安全等优点。

说明书

技术领域   

本发明涉及到一种细菌株的同源性鉴别方法，具体地说是一种在传统细菌分类、鉴别的基础上，通过对细菌短链脂肪酸的种类和含量进行检测，清晰地判别出细菌株的同源性，从而对细菌株进行快速分类与鉴别的方法。

背景技术    

细菌感染性疾病的实验诊断，涉及病源微生物学（含医学、农业、工业、环境微生物）、流行病学、法医学、医院感染学、生物化学等方面的知识和技能，是一门多学科相互渗透的综合诊断技术。微生物学实验室的主要工作是从标本中分离出病原菌株并进行准确鉴别。对细菌同源性判别能及时了解流行性细菌株之间的种、属间亲缘关系，其目的在于：明确细菌病原学诊断、判别细菌与感染间的关系，提供快速、可靠的治疗方案，及时为流行病学防治作指导。细菌感染的同源性鉴别为临床诊断、治疗、预后和流行病学调查以及医院内感染的监控，提供可靠的实验依据。

目前，微生物学实验室细菌感染的同源性鉴别主要依靠细菌核苷酸测序或PCR杂交等，由于细菌是原核生物，核苷酸基因序列较病毒基因复杂，存在实验成本高、实验时间长等缺点。同时，原核生物含有丰富的糖、蛋白质（含抗体、酶系统）及脂类成分。细菌的糖和蛋白质经一百多年的研究，已形成了传统的细菌鉴别方法，即根据细菌的形态、染色、培养特性初步鉴别到科；通过生化反应，利用细菌独特的酶系统，因而对底物（糖、蛋白质）的分解能力及代谢产物差异，进行不同的化学反应，以此可将细菌鉴别到属或种；再利用血清学抗体将细菌鉴别到型。但传统的鉴别方法只能鉴别到种或型，而不能鉴别至株。

发明内容   

本发明所要解决的技术问题在于提出一种快速、简易、成本低、实验过程安全的细菌株的同源性快速鉴别方法。

为解决上述技术问题，本发明一种细菌株的同源性快速鉴别方法包括如下步骤：Ⅰ.根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴别；Ⅱ.利用细菌对糖、蛋白质利用的生化反应进行属或种鉴别；Ⅲ. 利用血清学抗体将细菌鉴别到型；Ⅳ.采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸的种类与含量，得到该细菌脂肪酸指纹识别图谱，进行同源性比较，将细菌鉴别至株。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述同源性比较是采用脂肪酸标准品进行同源性比较，所采用的脂肪酸标准品包括脂肪酸甲酯混合物液，含C5～C20直链饱和脂肪酸甲酯及2-羟基-10碳、3-羟基-10碳、2-羟基-14碳、2-羟基-16碳饱和脂肪酸。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，在采用气相色谱技术测量细菌脂肪酸的种类与含量前，将待测菌接种在无脂质成份的培养基上培养，收集菌落，经皂化、甲基化、萃取、洗涤过程，将细菌脂肪酸从水相转移到有机相。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述菌落的收集过程包括：将细菌按四区画线法接种于无脂肪成份的TSBA平板上，35℃、24h培养，用接种环取第三区的菌落40mg左右，置于无菌、干燥、有螺旋盖的试管底部。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述皂化过程包括：在试管中加入1.Oml的皂化试剂，盖紧试管，震荡试管10s，放入100℃沸水中水浴，5min之后从沸水中移出、冷却，震荡10s；再将试管放回水浴中，继续加热25min；沸水中皂化共30min，冷却。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述皂化过程中所采用的试剂是由氢氧化钠45g、甲醇150ml和水150ml组成的混合液。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述甲基化过程包括：每管中加入2.0ml甲基化试剂，栓紧试管盖子后震荡10s，置80℃水浴加热10 min，用冷水快速冷却至室温，将脂肪酸转化成甲基脂肪酸。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述甲基化过程中所用的试剂是由6.0 mol/L盐酸 325ml和甲醇275ml组成的混合液。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述萃取过程包括：每管加入1.25ml萃取溶剂，盖紧试管盖子，置28℃摇床温和混匀10min，取干净吸管吸取上层有机相，放入另一试管，将甲基脂肪酸从水相转移到有机相。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述萃取过程中所用的溶剂是由己烷和甲基叔丁醚以体积1:1混合而成的。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述洗涤过程包括：在试管中加入3.Oml碱性洗涤液，栓紧盖子，震荡试管5min，静止数分钟，分层清晰。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述洗涤过程中采用的碱性洗涤液，是由氢氧化钠10.8g和水900ml组成的混合液。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述色谱分析过程包括: 将萃取物移至样品小瓶，用干净吸管吸取上层有机相，转移到干净的色谱样品小瓶，置气相色谱仪上；色谱条件：炉温40℃，进样口250℃，检测器300℃；氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min，氮气流量30mL/min；氢气压力10.6psi；色谱柱为Agilent 19091B-102型，检测器为氢火焰离子检测器；脂肪酸标准品定标通过后，加待检细菌样本，采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸种类与相对含量，得到细菌脂肪酸指纹识别图谱。

上述一种细菌株的同源性快速鉴别方法，所述同源性比较的判别方法为: 如果两种细菌在所述Ⅰ至 Ⅲ步骤结果相同的情况下，如细菌脂肪酸色谱主峰位置存在明显差异，则提示细菌同属同种但不同源；若脂肪酸色谱主峰位置相同，峰高相近，则提示细菌既同属同种又同源。

由于细菌脂类包括胆固醇、脂肪酸、枝菌酸、磷脂、醌等，而脂肪酸作为细胞的基本成份，主要存在于细胞器中，其组份相对稳定，不同种、属的细菌,其脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，这与细菌的本质及遗传有关，故细菌脂肪酸的组份与含量中蕴藏了丰富的细菌分类学信息。本发明结合细菌对糖、蛋白质利用特性，对细菌短链脂肪酸（C5～C20）的种类和含量进行检测，根据细菌脂肪酸的种类和含量的差异，清晰判别出细菌株的同源性，从而进行细菌的分类与鉴别。它在传统细菌鉴别程序的基础上，即在细菌染色镜检、生化反应、血清学反应相同的情况下，基于糖、蛋白质与脂肪酸分析技术鉴别细菌感染的同源性，既是对传统细菌学鉴别、分型的延伸，又是继细菌核苷酸分型之后的一种新方法，为细菌学的分型、鉴别、比较提供了新途径，具有快速、简易、成本低、实验过程安全等优点。

附图说明

图1是本发明方法的操作流程示意图；

图2是细菌脂肪酸标准品（批号MIDI 601230-A）的气相色谱图的主要参数；

图3是细菌脂肪酸标准品（批号MIDI 601230-A）气相色谱图；

图4是创伤弧菌1.758株的脂肪酸气相色谱参数；

图5是创伤弧菌1.758株的脂肪酸气相色谱图。

具体实施方式

如图1所示，本发明一种细菌株的同源性快速鉴别方法包括如下步骤：

Ⅰ.根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴别，此法可将细菌鉴别到科。

Ⅱ.利用细菌对糖、蛋白质利用的生化反应进行鉴别，此法可将细菌鉴别到属或种。

Ⅲ.血清学鉴别：用含已知特异蛋白抗体去检测未知的细菌，此法可将细菌鉴别至种或型。

Ⅳ.将待测菌接种在无脂质成份的培养基上培养，收集菌落，经皂化、甲基化、萃取、洗涤过程，将细菌脂肪酸从水相转移到有机相。具体包括如下过程：

1、菌落获取：将细菌按四区画线法接种于无脂肪成份的TSBA平板，35℃、24h培养，用接种环取第三区的菌落40mg左右，置无菌、干燥有螺旋盖试管底部。

2、细菌脂肪酸抽提：

（1）皂化：在试管中加入1.Oml的皂化试剂，盖紧试管，震荡试管10s，放入100℃沸水中水浴，5 min之后从沸水中移出、冷却，震荡10s。再将试管放回水浴中，继续加热25 min。沸水中皂化共30min，冷却。皂化试剂可采用由氢氧化钠45g、甲醇150ml和水150ml组成的混合物。

（2）甲基化：将脂肪酸转化成甲基脂肪酸，每管加入2.0ml甲基化试剂，栓紧盖子后震荡10s，置80℃水浴加热10 min，用冷水快速冷却至室温。甲基化试剂可采用由6.0 mol/L盐酸325ml和甲醇275ml组成的混合物。

（3）萃取：甲基脂肪酸从水相转移到有机相。每管加入1.25ml萃取溶剂，盖紧试管盖子，置28℃摇床温和混匀10min，取干净吸管吸取上层有机相，放入另一试管。萃取溶剂可采用由己烷200ml和甲基叔丁醚200ml组成的混合物。

（4）洗涤：在试管中加入3.Oml碱性洗涤液，栓紧盖子，震荡试管5min，静止数分钟，分层清晰。碱性洗涤液可采用由氢氧化钠10.8g和水900ml组成的混合物。

Ⅴ.细菌脂肪酸色谱分析：采用气相色谱技术，测定出细菌的脂肪酸种类与相对含量，再现细菌脂肪酸指纹图谱，可将细菌鉴别至株。

1、细菌脂肪酸色谱分析所采用的仪器为美国Agilent HP6890型气相色谱仪。

2、同源性比较过程中所采用的脂肪酸标准品包括脂肪酸甲酯混合物液，含C5～C20直链饱和脂肪酸甲酯及2-羟基-10碳、3-羟基-10 碳、2-羟基-14 碳、2-羟基-16碳饱和脂肪酸，试剂购自美国MIDI公司，批号MIDI 601230-A。脂肪酸标准品的主要参数表见图2、图3。

3、测定过程：将萃取物移至样品小瓶，用干净吸管吸取上层有机相，转移到干净的色谱样品小瓶，置气相色谱仪上。色谱条件：炉温40℃，进样口250℃，检测器300℃；氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min，氮气流量30mL/min；氢气压力10.6psi。色谱柱为Agilent 19091B-102型，检测器为氢火焰离子检测器。脂肪酸标准品定标通过后，加待检细菌样本，采用气相色谱技术，测定出细菌脂肪酸种类与相对含量，得到细菌脂肪酸指纹识别图谱（见图4、图5）。

Ⅵ.同源性比较:两种细菌在生化反应相同的情况下，若细菌脂肪酸色谱主峰位置（Peak Name）存在明显差异，则提示细菌同属（种）、不同源（株）；若脂肪酸色谱主峰位置相同，峰高（Percent）相近，则提示细菌既同属（种），又同源（株）。本实施例中，判别的细菌株为创伤弧菌1.758株。