一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法

摘要

一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明采用解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefacines）CCTCCNO：M2011045为生产菌株，所用发酵培养基以克/升计为：葡萄糖5-20，麸皮10-30，氯化钠6，七水硫酸镁4.5，磷酸二氢钾1，碳酸钙3，用自来水配制，pH值自然，121℃灭菌30min；在发酵第一阶段（0-16h）将氧体积传质系数（KLa）控制在72.2h-1，发酵第二阶段（16h以后），将氧体积传质系数（KLa）控制在33.9h-1。采用本发明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢杆菌发酵产酶水平，缩短发酵时间18小时以上，同时也为在实际的工业放大过程中提供了一种更为有效的方法。

说明书

技术领域

一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法，具体的说是在发酵过程中，不同的发酵阶段采取不同的体积传质系数（K_La），从而提高凝乳酶的发酵水平，本发明属于微生物发酵技术领域。

背景技术

凝乳酶是乳酪生产中的关键酶，它使原奶凝固分为两个阶段：酪蛋白微胶粒中α-酪蛋白和β-酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不会发生自发凝结，首先凝乳酶专一性的将κ-酪蛋白分解为p-κ-酪蛋白和一种巨肽，使酪蛋白的微胶粒失去稳定性；然后在Ca²⁺作用下p-κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之间形成化学键从而形成沉淀。

目前凝乳酶的主要来源有动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。传统上，凝乳酶是利用牛犊第四胃（皱胃）提取制作，随着乳酪产业不断扩大，单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。动物性凝乳酶的短缺以及植物性凝乳酶自身特性的缺点，使得微生物凝乳酶成为未来凝乳酶行业的发展趋势。微生物凝乳酶又可分为真菌和细菌来源的凝乳酶，与真菌固体发酵相比，细菌液体发酵生产凝乳酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，如何提高发酵水平，缩短发酵时间还处在进一步的研究当中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于两阶段溶氧控制策略的用以提高解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines）产凝乳酶发酵水平、缩短发酵时间的方法。

本发明的技术方案：一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法，采用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines）CCTCC NO：M 2011045为生产菌株，所用发酵培养基以克/升计为：葡萄糖 15，麸皮 25，氯化钠6，七水硫酸镁4.5，磷酸二氢钾1，碳酸钙3，用自来水配制，pH值自然，121 ℃灭菌30 min；接种量为体积百分比0.2%，发酵温度为35℃；发酵第一阶段0-16h将氧体积传质系数K_La 控制在72.2 h^-1，发酵第二阶段16 h以后，将氧体积传质系数K_La控制在33.9 h^-1。

本发明采用的菌种为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacines）JNU002，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2011045。该菌株由本发明的部分发明人选育，该菌株以及利用该菌株发酵生产凝乳酶的方法已申请中国专利，申请号：201110091892.7，公开号：CN 102191203 A。

本发明中K_La值的测定采用参考文献（伦世仪主编，堵国成副主编，《生化工程（第二版）》，中国轻工出版社，2008年）所述的动态法用溶氧电极测定K_La。

本发明所涉及的培养与发酵所用的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基，以及斜面培养和种子培养的条件采用公开号为CN 102191203 A所提供的方法。

本发明在发酵过程中所采用的发酵温度为35℃，接种量为0.2%(体积百分比)。

凝乳酶活力的测定：用0.01mol/L氯化钙溶液配制质量浓度12%脱脂奶粉溶液，室温放置40min后使用，当天配制。取5 mL 12%的脱脂奶粉溶液在35℃水浴锅中保温10min，加适量35℃预热10min的酶液（发酵液5000rpm 离心5min获得之清液），立即摇匀，开始计时，把试管倾斜45°，旋转试管，观察壁上出现絮状沉淀时为凝乳终点，记录凝乳时间。40min凝固1mL脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位（Soxhlet Unit，SU）。

本发明的有益效果：采用本发明提供的方法，可以有效的提高解淀粉芽孢杆菌发酵产酶水平，同时缩短发酵时间18小时以上。此外，氧体积传质系数（K_La）是本领域进行规模放大的重要参数，本发明以氧体积传质系数（K_La）作为控制指标所建立的溶氧控制策略，同其它的溶氧控制方法相比，在实际的工业放大过程中提供了一种更为有效的方法。

具体实施方式

在下面所述的所有具体实施例中，所有的发酵均在7升发酵罐中进行（Bioflo-415 New Brunswick Scientific Co., U.S.A），在发酵过程中搅拌转速保持在500转/分钟。如无特殊说明，所用方法均为本领域常用方法。

对照实施例1：解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO：M 2011045在氧体积传质系数（K_La）为33.9h^-1条件下发酵产凝乳酶。

（1）斜面培养：解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO：M 2011045接种于斜面培养基上，在32℃下培养24小时。所用斜面培养基为（单位为克/升）：葡萄糖20，酵母膏10，琼脂条20，用自来水配制，pH值自然，115℃灭菌20分钟。

（2）种子培养：将斜面长好的菌种用接种环取一环接入种子培养基中，在35℃培养12小时，摇床转速150转/分钟。所用种子培养基为（单位为克/升）：麸皮 30，氯化钠 5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，用自来水配制，pH值自然；每250毫升三角瓶装30毫升种子培养基，121℃灭菌30 分钟。

（3）液体发酵培养：将培养好的种子9毫升接入发酵罐中，其中发酵培养基为4.5升，控制氧体积传质系数（K_La）在33.9 h^-1，在35℃培养。所用发酵培养基为（单位为克/升）：葡萄糖 15，麸皮 25，氯化钠6，七水硫酸镁4.5，磷酸二氢钾1，碳酸钙3，用自来水配制，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。发酵培养60 h，发酵液中的凝乳酶活力达到最高值6366 SU/mL。

对照实施例2：解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO：M 2011045在氧体积传质系数（K_La）为72.2 h^-1条件下发酵产凝乳酶。

将培养好的种子9毫升接入发酵罐中，其中发酵培养基为4.5升，控制氧体积传质系数（K_La）在72.2 h^-1。其他条件同对照实施例1。发酵培养54 h，发酵液中凝乳酶活力达到最高值5896 SU/mL。

实施例：解淀粉芽孢杆菌 CCTCC NO：M 2011045在二级溶氧控制条件下发酵产凝乳酶。

将培养好的种子9毫升接入发酵罐中，其中发酵培养基为4.5升，发酵前16 h控制氧体积传质系数（K_La）在72.2h^-1，16 h后控制氧体积传质系数（K_La）在33.9 h^-1。其他条件同对照实施例1。发酵培养36 h，发酵液中凝乳酶活力达到最高值6590 SU/mL。

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。