计明胺类甾体生物碱衍生物、其制备及在抗血栓药物中的应用

摘要

本发明提供计明胺类甾体生物碱衍生物、其制备及在抗血栓药物中的应用。计明胺类甾体生物碱衍生物具有通式I的结构，是以甾体生物碱计明胺为原料，经化学修饰，合成含有游离羧基的计明胺类酯型甾体生物碱。本发明采用经典的淤血诱发大鼠下腔静脉血栓形成模型以评价2个衍生物的抗静脉血栓活性。结果表明，计明胺类甾体生物碱衍生物具有强烈的抗静脉血栓形成活性，可用于制备抗血栓药物，拓宽了计明胺衍生物的医药应用。

说明书

技术领域

本发明涉及药物，具体涉及新型计明胺类甾体生物碱衍生物、其制备方法 及在制备抗血栓药物中的应用。

背景技术

血栓病是由于血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，使主要脏器发生缺血和梗塞而 引起机能障碍的各种疾病。它属于心脑血管疾病，全球每年脑血栓、脑梗塞、 心肌梗塞、冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病夺走1200万人的生命，接近世界 总死亡人数的1/4成为人类健康的头号大敌。中国每年死于心脑血管疾病的人数 达到280万人以上，存活的患者75％致残，其中40％以上重残。

目前抗血栓药主要有抗凝剂、抗血小板及溶栓药，其中主要以西药为主，如 肝素类、水蛭素及其类似物、阿司匹林、链激酶等，中成药主要是丹参制剂。 以上这些药品对血栓病起了一定作用，但大多数疗效不是很理想，另外存在一 定的副作用。因此，发现和研究新型抗血栓药物仍然是生物医药科学领域重要 的课题与任务。

传统中药在治疗中风等脑血管疾病方面具有悠久的历史和长期的临床积 累，因而利用中草药的优势从中发现天然的抗血栓药物是目前研制新型抗血栓 药物的有效途径之一。近年来，赵伟杰等发现从辽宁地产植物乌苏里藜芦 (Veratrum nigrum var.ussuriense Nakai)的根茎中提取的生物碱VnA具有强大 的抗栓降凝作用(韩国柱，李欣燕，赵伟杰。乌苏里藜芦碱抗血栓作用的研究。 中草药，2003，34(12)：1107-1110。)，其中计明胺(germine)(其结构式如 式Ⅳ所示)未见活性报道，但计明胺类酯型甾体生物碱乌苏瑞宁(verussrinine) (其结构式如式V所示)被证明是主要的活性成分之一，作用强度十分显著， 且同时具有抗血小板聚集和抗凝血双重作用。(邓伟峰，赵伟杰，吕莉，王世盛， 潘平，韩国柱，乌苏瑞宁的抗血栓作用，中草药，2007，38(12)：1836-1837)。 同时，临床上抗血栓药物如阿司匹林等往往带有酸性基团，因此，以计明胺为 先导化合物，结合二元羧酸或酸酐，设计合成一系列带有酸性基团的计明胺类 酯型甾体生物碱，希望得到活性高且溶解性好的衍生物，进行深入的抗血栓活 性和构效关系研究，以期发现结构新颖、作用独特、治疗指数更高的新天然产 物，为发展新的抗血栓新药奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以藜芦中分离得到的甾体生物碱计明胺为原料 制备的计明胺类甾体生物碱衍生物，并研究这些衍生物在制备抗血栓药物中的 应用。具体采用如下技术方案：

一类计明胺类甾体生物碱衍生物，具有通式I的结构：

其中：

R₁、R₂、R₃各自独立的选自取代基Ia、Ib和H，并且R₁、R₂、R₃中有 1～2个取代基为H；

取代基Ia中，n为2～6的整数；

取代基Ib中，X选自C和N；

本发明所述取代基Ib的结构中，杂原子X及-COOH可以位于六元环上除 羰基碳以外的任意位置。

优选的技术方案中，当R₁、R₂、R₃中有1个取代基为H时，其余2个取代 基相同。

优选的又一技术方案中，本发明所述取代基Ia中，n＝2。

优选的又一技术方案中，本发明所述取代基Ib中，X为C。

进一步优选的方案中，-COOH位于羰基碳的邻位。

更为优选的，上述本发明的化合物选自：

计明胺3，7-二琥珀酸单酯；

计明胺15-邻苯二甲酸单酯。

计明胺类甾体生物碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：

①0～10℃温度下，将琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐溶解于吡啶中，搅拌 30min～60min；

②向步骤①制备的溶液中加入计明胺溶液，控制滴速10～20滴/分钟；升温 至20℃～40℃，反应24～72小时；反应停止，加入与吡啶体积(此处所述吡啶体 积为溶解琥珀酸酐和计明胺的吡啶的体积之和)比为1∶5的环己烷，共沸，减压 浓缩至干，得到粉末；所述计明胺溶液为计明胺与吡啶按质量体积比25∶1混合；

③将步骤②中得到的粉末用氯仿甲醇混合溶剂溶解使其形成饱和溶液，在 制备板上上样，用氯仿∶甲醇∶二乙胺按体积比8～10∶1∶0.1的混合溶剂100ml 展开；刮取产物带，用氯仿甲醇混合溶剂超声加热洗脱，过滤除去不溶物，滤 液减压浓缩至干，得到产物；所述氯仿甲醇混合溶剂为氯仿与甲醇按体积比4∶1 混合；

上述方法的步骤①中，所述有机溶剂还可以是二氯甲烷、氯仿等。

优选的方案中，步骤①所述搅拌时间为30min。

优选的又一技术方案，步骤②所述滴速为10滴/分钟；更优选的，反应温 度为25℃，反应48小时。

本发明步骤③中，所述制备板的制作方法为本领域的公知常识；在本发明 中，具体包括如下步骤：

④在1000ml沸水中缓慢加入5g羧甲基纤维素钠(CMCNa)，搅拌直至全 部溶解，配制0.5％的CMCNa水溶液，作为黏合剂；

⑤取15～20g的GF254硅胶，缓慢加入黏合剂搅拌，加5ml丙酮搅拌除去 气泡；

⑥将步骤⑤制备的硅胶溶液铺满玻璃板的光滑面，依次从玻璃板四面振荡 直至玻璃表面的硅胶层变得平滑；然后放置在阴凉的僻静角落风干至水印全干， 再于烘箱中105℃时烘烤1-2个小时后，冷却；在展缸中用甲醇饱和后，吹干待 用。

本发明的另一目的在于提供本发明的计明胺类甾体生物碱衍生物在制备 抗血栓药物中的应用。包括将本发明的化合物以有效剂量与通常可选的药用辅 料配合制剂的步骤，按照本发明实施例的检测结果，本发明所述的化合物在此 应用中所需的有效剂量可能远低于现有技术中公开的化合物。

附图说明

图1为计明胺3，7-二琥珀酸单酯的¹³C NMR谱图

图2为计明胺15-邻苯二甲酸单酯的¹³C NMR谱图

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。

本发明所使用的计明胺原料制备方法为：取藜芦植物的干燥根茎500g粉碎 后，在常压提取装置中用95％(V/V)乙醇回流提取，提取4次，每次1小时， 提取液过滤，滤液减压浓缩至无醇味，真空干燥得到的71g浸膏。以10倍(710g) 5wt％酒石酸溶液溶解，溶解液过滤后用乙醚萃取脱脂。脱脂后得到的溶液用浓 氨水调节pH至9.0，用氯仿反复萃取，减压回收溶剂近干得到生物总碱4.2g。 将总生物碱溶解于45mL乙醇中，在搅拌状态下加入180mL0.5mol/L的KOH。 保持为pH12，70℃水解3小时，自然冷却到室温，用氯仿反复萃取，减压回收 溶剂近干得到生物碱1.2g，用6ml甲醇溶解，与1.2g100～200目硅胶混匀后，红 外灯下烘干溶剂，用40倍(48g)200～300目硅胶装柱，以氯仿∶甲醇∶二乙胺 体积比为40∶1∶0.1的流动相洗脱，进行硅胶色谱柱层析。以氯仿∶甲醇∶二乙胺 体积比为10∶1∶0.1的展开剂进行薄层层析跟踪结果，收集计明胺部分洗脱液，收 集液减压浓缩至干后在甲醇∶丙酮体积比为1∶4体系中进行重结晶，过滤，干燥， 得到计明胺145mg。

其他所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

(一)计明胺3，7-二琥珀酸单酯，结构如式Ⅱ所示：

(二)计明胺3，7-二琥珀酸单酯的制备方法：

0℃冰水混合物中，将100mg琥珀酸酐用4ml吡啶溶解，搅拌0.5小时后， 以10滴/分钟的滴速向其中滴加计明胺吡啶溶液(50mg计明胺溶解在2ml吡啶 中)。冰融化后升温至25℃反应48小时。停止反应后，加入30ml环己烷，与吡 啶共沸，减压旋蒸溶剂至干，得到粉末。粉末用体积比为4∶1的氯仿甲醇混合 溶剂溶解使其形成饱和溶液，在制备板上上样，用100ml氯仿甲醇二乙胺混合 溶剂展开，其中氯仿∶甲醇∶二乙胺体积比为10∶1∶0.1。刮取产物带，用体积比 为4∶1的氯仿甲醇混合溶剂超声加热洗脱，过滤除去硅胶，减压旋蒸溶剂至干， 得产物43mg，收率61.8％。

上述方法中，制备板的制作方法为：在1000ml沸水中慢慢加入5g羧甲基 纤维素钠(CMCNa)，不停的搅拌直至全溶解，配制0.5％的CMCNa水溶液， 作为黏合剂。取15-20g的GF254硅胶，慢慢加入黏合剂搅拌，加5ml丙酮搅拌 (除气泡)。将硅胶溶液铺在玻璃板的光滑面，用勺引导硅胶铺满玻璃表面，依 次从四面振荡直至玻璃表面的硅胶层变得平滑。然后放置在阴凉的僻静角落风 干至水印全干了，在烘箱中105℃烘烤1-2个小时后，冷却。在展缸中用甲醇饱 和后，吹干待用。

(三)计明胺3，7-二琥珀酸单酯的结构鉴定

上述方法制备的计明胺3，7-二琥珀酸单酯，经检测结果如下：

白色粉末，Dradendorff试剂显橘红色，(+)-ESI-MS m/z＝710[M+H]⁺。

图1为计明胺3，7-二琥珀酸单酯的¹³CNMR(C₅D₅N，100MHz)δ：32.69(C-1)， 28.03(C-2)，81.35(C-3)，108.38(C-4)，46.84(C-5)，29.73(C-6)，72.06(C-7)，49.48(C-8)， 93.50(C-9)，44.58(C-10)，33.59(C-11)，46.69(C-12)，34.14(C-13)，81.35(C-14)， 69.84(C-15)，71.96(C-16)，45.40(C-17)，62.26(C-18)，22.01(C-19)，76.20(C-20)， 18.94(C-21)，71.23(C-22)，18.82(C-23)，30.14(C-24)，29.95(C-25)，62.54(C-26)， 17.68(C-27)，172.92(C-1′)，28.74(C-2′)，30.98(C-3′)，177.75(C-4′)，172.31(C-1″)，28.77( C-2″)，31.02(C-3″)，177.56(C-4″)。

实施案例2

计明胺3，7-二琥珀酸单酯的制备：

0℃冰水混合物中，称取120mg琥珀酸酐，用5ml吡啶溶解，搅拌0.5小时 后，以10滴/分钟的滴速向其中滴加计明胺吡啶溶液(60mg计明胺溶解在3ml 吡啶中)。冰融化后升温至25℃下反应48小时。停止反应后，加入40ml环己烷， 与吡啶共沸，减压旋蒸溶剂至干得到粉末。粉末用体积比为4∶1的氯仿甲醇混 合溶剂溶解形成饱和溶液，在制备板上上样，用100ml氯仿甲醇二乙胺混合溶 剂展开，其中氯仿∶甲醇∶二乙胺体积比为10∶1∶0.1。刮取产物带，用体积比为 4∶1的氯仿甲醇混合溶剂超声加热洗脱，过滤除去硅胶，减压旋蒸溶剂至干，得 产物52mg，收率63.2％。

本实施例中，制备板制作方法同实施例1。

实施案例3

(一)计明胺15-邻苯二甲酸单酯，结构如式III所示：

(二)计明胺15-邻苯二甲酸单酯的制备方法：

0℃冰水混合物种，称取100mg邻苯二甲酸酐，用4ml吡啶溶解，搅拌0.5 小时后，慢慢向其中滴加计明胺吡啶溶液(50mg计明胺溶解在2ml吡啶中)， 10滴/分钟。冰融化后升温至25℃下反应48小时。停止反应后，加入30ml环己 烷，与吡啶共沸，减压旋蒸溶剂至干得到粉末。粉末用体积比为4∶1的氯仿甲 醇混合溶剂溶解形成饱和溶液，在制备板上上样，用100ml氯仿甲醇二乙胺混 合溶剂展开，其中氯仿∶甲醇∶二乙胺体积比为8∶1∶0.1。刮取产物带，用体积 比为4∶1的氯仿甲醇混合溶剂超声加热洗脱，过滤除去硅胶，减压旋蒸溶剂至干， 得产物44.3mg，收率68.7％。

本实施例中，制备板制作方法如实施例1。

(三)计明胺15-邻苯二甲酸单酯的结构鉴定

白色粉末，Dradendorff试剂显橘红色。(+)-ESI-MS m/z＝658[M+H]⁺

图2为计明胺15-邻苯二甲酸单酯的¹³CNMR(C₅D₅N，100MHz)δ：32.12(C-1)， 29.14(C-2)，74.54(C-3)，108.68(C-4)，48.19(C-5)，31.16(C-6)，69.31(C-7)，49.77(C-8)， 94.39(C-9)，44.25(C-10)，34.14(C-11)，46.88(C-12)，35.49(C-13)，84.10(C-14)， 74.30(C-15)，72.41(C-16)，45.53(C-17)，65.73(C-18)，23.60(C-19)，74.47(C-20)， 20.35(C-21)，72.80(C-22)，20.16(C-23)，31.75(C-24)，31.65(C-25)，66.90(C-26)， 18.96(C-27)，172.09(COPh)，132.70(C-1′)，131.00(C-2′)，130.54(C-3′)，132.37(C-4′)，1 33.46(C-5′)，129.71(C-6′)，163.72(COOH)。

实施例4

计明胺15-邻苯二甲酸单酯的制备：

0℃冰水混合物中，称取120mg邻苯二甲酸酐，用5ml吡啶溶解，搅拌0.5 小时后，慢慢向其中滴加计明胺吡啶溶液(60mg计明胺溶解在3ml吡啶中)， 10滴/分钟。冰融化后室温25℃下反应48小时。停止反应后，加入40ml环己烷， 与吡啶共沸，减压旋蒸溶剂至干得到粉末。粉末用体积比为4∶1的氯仿甲醇混 合溶剂溶解形成饱和溶液，在制备板上上样，用100ml氯仿甲醇二乙胺混合溶 剂展开，其中氯仿∶甲醇∶二乙胺体积比为8∶1∶0.1。刮取产物带，用体积比为 4∶1的氯仿甲醇混合溶剂超声加热洗脱，过滤除去硅胶，减压旋蒸溶剂至干，得 产物49.7mg，收率64.2％。

本实施例中，制备板制作方法如实施例1。

实施例5计明胺类甾体生物碱衍生物对大鼠下腔静脉血栓的影响

(1)样品配置：取本发明实施例制备的各化合物及乌苏瑞宁样品各1mg，用0.1ml 无水乙醇溶解后，加入20μL 0.35mol/L的稀盐酸，再加入0.9ml生理盐水，配成 1mg/ml溶液待用。

本实施例所用乌苏瑞宁样品(结构如式V)由大连理工大学王世盛副教授 实验室提供，制备方法为：将藜芦药材原料粉碎、乙醇回流提取、干燥得到浸 膏、再经酸溶液溶解、乙醚脱脂、氯仿萃取、浓缩得到藜芦甾体总生物碱、结 合色谱柱分离工艺制备乌苏瑞宁，即柱色谱纯化、重结晶、干燥，最终制得单 体成品。关于其药效的研究见《乌苏瑞宁的抗血栓作用》(邓伟峰，赵伟杰，吕 莉，王世盛，潘平，韩国柱；中草药，2007，38(12)：1836-1837)。

(2)动物：SD种大鼠，雌雄各半，体重200-240g，由大连医科大学试验动物 中心提供(许可证号：SCXK(辽)2008-0002)

(3)仪器：BS224S天枰d＝0.0001北京赛多利斯仪器系统有限公司

取大鼠60只，动物分组，大鼠以20％乌拉坦ip1g/kg麻醉。仰位固定，于 正中切开腹壁，分离下腔静脉，并于左肾静脉下方预置丝线备结扎用。计明胺3， 7-二琥珀酸单酯、计明胺15-邻苯二甲酸单酯分别5.0、10.0、20.0μg/kg舌下静 脉注射，以0.5ml/kg NS为空白对照、以已知有效计明胺类甾体生物碱乌苏瑞宁 5.0、10.0、20.0μg/kg为阳性对照(韩国柱，李欣燕，赵伟杰。乌苏里藜芦碱抗 血栓作用的研究。中草药，2003，34(12)：1107-1110)。给药15min后结扎 下腔静脉，关闭腹腔。结扎6小时后重新打开腹腔，于结扎线下方2cm处夹闭 血管，同时夹住该部位主要静脉侧枝并用脱脂棉吸尽静脉内残血，纵行剖开管 腔，观察有无血栓形成，若有血栓形成，记录血栓湿重，结果见表1。

表1计明胺类甾体生物碱衍生物对大鼠体内静脉血栓形成的影响

注：与NS组向比较*P＜0.05  **P＜0.01

结果表明：与对照组相比，计明胺3，7-二琥珀酸单酯10μg/kg组显著的降 低了血栓湿重(P＜0.01)，计明胺3，7-二琥珀酸单酯5、20μg/kg组明显的降 低了血栓湿重(P＜0.05)。

与对照组相比，计明胺15-邻苯二甲酸单酯5、10、20μg/kg组明显的降低 了血栓湿重(P＜0.05)，最高抑制率可达97.9％。